魏丹丹，宋宇涵，王 淇，宿樹蘭，朱 悅，段金廒

南京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023

目前中國人口結(jié)構(gòu)已進(jìn)入老年型,深入研究衰老及老年相關(guān)疾病、科學(xué)應(yīng)對(duì)人口老齡化是新時(shí)代的國家重大需求。在眾多老年相關(guān)疾病中,年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)嚴(yán)重威脅著老年人群的視力健康。

1 AMD簡(jiǎn)介

AMD為視網(wǎng)膜黃斑區(qū)域的退行性疾病,引起進(jìn)行性中央視力喪失,是65歲及以上老年人視力喪失甚至失明的主要原因。流行病學(xué)研究表明,中國發(fā)達(dá)城市AMD發(fā)病率高達(dá)15.5%,預(yù)計(jì)2040年全球患者將達(dá)到2.88億人。臨床上以玻璃疣大小將AMD分為早期、中期、晚期3個(gè)階段,晚期AMD導(dǎo)致嚴(yán)重的永久性中央視力喪失,晚期AMD包括干性或濕性兩種類型。干性AMD目前尚無有效的治療手段,濕性AMD主流療法為玻璃體腔注射抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體。

2 AMD發(fā)生、發(fā)展的新近研究進(jìn)展

AMD病變主要包括視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(recular pigment endothelial, RPE)以及感光層的喪失、RPE下方脂質(zhì)和蛋白質(zhì)積累或Bruch膜中蛋白質(zhì)沉積、絨毛膜毛細(xì)血管脫落、脈絡(luò)膜新生血管和盤狀瘢痕以及小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞募集以及補(bǔ)體激活引起的炎性反應(yīng)。迄今為止AMD機(jī)制尚不完全清楚,但視網(wǎng)膜在老化和壓力刺激下導(dǎo)致的一系列內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡在其發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[1]。

2.1 細(xì)胞衰老-更新失衡

視網(wǎng)膜細(xì)胞更新和修復(fù)的能力差,使其罹患退行性疾病風(fēng)險(xiǎn)大大增加。RPE具有維持視網(wǎng)膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)功能,隨著年齡增長細(xì)胞反復(fù)復(fù)制導(dǎo)致端粒變短,RPE等體細(xì)胞分裂能力下降引發(fā)復(fù)制性細(xì)胞衰老。RPE細(xì)胞衰老是AMD的關(guān)鍵環(huán)節(jié),表現(xiàn)為衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal)上調(diào)、活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)增多等。衰老的RPE細(xì)胞溶酶體消化能力下降導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白聚集體和脂褐素等代謝廢物堆積,脂褐素的積累導(dǎo)致早期AMD的發(fā)生,脂褐素在光暴露下產(chǎn)生自由基導(dǎo)致RPE細(xì)胞溶酶體功能障礙,吞噬功能進(jìn)一步受損促進(jìn)AMD發(fā)展[2]。衰老RPE細(xì)胞的DNA損傷促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂褐素的堆積,SA-β-gal可以抑制線粒體分裂進(jìn)一步促進(jìn)脂褐素生成。

紫外線輻射、香煙暴露、氧化應(yīng)激等可作為應(yīng)激源,作用于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases, CDK)抑制劑以及p53下游信號(hào),阻止下游低磷酸化的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因(retinoblastomal, Rb)蛋白磷酸化,抑制S期DNA復(fù)制減慢細(xì)胞周期,觸發(fā)壓力引起RPE等細(xì)胞早衰。貝伐單抗顯著降低CDK2、CDK4和CDK6以及cyclin D和E的表達(dá),阻斷RPE細(xì)胞的G1/S進(jìn)展[3]。多柔比星等藥物暴露也能夠?qū)е翿PE細(xì)胞衰老,與胚胎干細(xì)胞共孵育可通過TGF-β和PI3K信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)早衰的RPE細(xì)胞[4-5]。衰老的RPE細(xì)胞破壞了血-視網(wǎng)膜屏障,導(dǎo)致RPE吞噬光感受器外節(jié)能力和調(diào)節(jié)類視黃醇循環(huán)能力下降,RPE代謝效率低下、識(shí)別和去除受損蛋白質(zhì)的泛素蛋白酶體和自噬溶酶體系統(tǒng)功能受損,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白質(zhì)堆積和視網(wǎng)膜細(xì)胞外沉積物聚集,形成了包含脂質(zhì)、脂蛋白、脂褐素、β-淀粉樣蛋白以及炎性相關(guān)因子多種有害物質(zhì)的玻璃膜疣并充當(dāng)抗原刺激,激活免疫系統(tǒng)。年齡相關(guān)的Bruch膜細(xì)胞外基質(zhì)膠原纖維交聯(lián)度增加,導(dǎo)致載脂蛋白等大分子在通過視網(wǎng)膜時(shí)受阻沉積,進(jìn)而導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素上皮和感光層損傷。

2.2 氧化壓力-抗氧化失衡

線粒體的脂肪酸β氧化為RPE細(xì)胞提供大量能量,與此同時(shí)產(chǎn)生大量的自由基,視網(wǎng)膜高含量的脂質(zhì)增加了RPE氧化應(yīng)激的風(fēng)險(xiǎn),RPE細(xì)胞主要抗氧化機(jī)制為核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)。衰老的RPE中Nrf2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)量下降甚至沉默,導(dǎo)致其無法有效地與細(xì)胞質(zhì)中的Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1分離活化并進(jìn)入細(xì)胞核,與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,導(dǎo)致下游超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽還原酶、硫氧還原酶等抗氧化劑短缺。低度ROS可活化氧化信號(hào)以維持生理功能,但慢性香煙煙霧、光暴露等刺激造成RPE細(xì)胞內(nèi)ROS堆積,造成多不飽和脂肪酸等脂質(zhì)過氧化,導(dǎo)致視網(wǎng)膜鐵蓄積[6-7]。RPE細(xì)胞內(nèi)過量的鐵通過GSH-GPx-4和FSP1-CoQ(10)-NADH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致RPE細(xì)胞鐵死亡并加速視網(wǎng)膜的老化,依賴于RPE提供營養(yǎng)和清除代謝廢物的光感受器細(xì)胞隨之死亡[8]。RPE細(xì)胞功能障礙和丟失觸發(fā)早期AMD的發(fā)生及進(jìn)展,最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性,二十二碳六烯酸對(duì)鐵超載小鼠模型的氧化應(yīng)激和干性AMD具有保護(hù)作用[9-10]。

脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可以氧化修飾視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、線粒體DNA等大分子使其轉(zhuǎn)變?yōu)閴勖L的氧化應(yīng)激刺激物--氧化特異性表位(oxidation-specific epitopes, OSEs),如晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs),AGEs促進(jìn)其他OSEs的保留并防止其被模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs)清除。OSEs通過與PRRs相互作用招募小膠質(zhì)細(xì)胞,下調(diào)26S蛋白酶導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白質(zhì)蓄積促進(jìn)脂褐素和玻璃膜疣的形成,并產(chǎn)生神經(jīng)毒性炎性介質(zhì),清除瀕死神經(jīng)元,破壞并吞噬光感受器。受損的線粒體DNA正反饋地促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)一步增加并加劇線粒體功能失調(diào),氧化損傷的DNA分子導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞DNA甲基化、端粒變短、組蛋白脫乙?；?、線粒體功能失調(diào)、轉(zhuǎn)錄組變化等功能異常。給予外源性線粒體來源的24肽護(hù)腦素HG可以降低細(xì)胞內(nèi)炎性指標(biāo)的蛋白水平,如CD62E/E-Selectin、CD62P/P-Selectin、ICAM-1、TNF-α、MIP-1α、IFN-γ、IL-1β、IL-13、IL-17A等,減輕線粒體DNA介導(dǎo)的炎性反應(yīng)[11]。RPE中特異性地過表達(dá)Nrf2可以保護(hù)RPE形態(tài)和功能并防止感光細(xì)胞層被破壞[1]。巨噬細(xì)胞NAD+消耗酶的過度表達(dá)導(dǎo)致視網(wǎng)膜微環(huán)境中NAD+濃度下降,觸發(fā)巨噬細(xì)胞炎性途徑激活、炎性細(xì)胞正反饋聚集和ROS積累[12]。給予其前體如煙酰胺核糖NR和煙酰胺單核苷酸NMN可通過Sirt3-Nrf2等通路恢復(fù)氧化-還原平衡改善AMD[13-14]。

2.3 慢性炎性反應(yīng)-抗炎失衡

視網(wǎng)膜中的硬脂酸通過Toll樣受體4(toll-like receptor 4, TLR4)重塑染色質(zhì),選擇性地增強(qiáng)AP-1結(jié)合位點(diǎn)并觸發(fā)先天免疫系統(tǒng)持續(xù)重編程。視網(wǎng)膜中的AGEs可以放大炎性反應(yīng),保留炎性碎片或細(xì)胞殘留物形成玻璃膜疣,觸發(fā)AMD。氧化壓力和線粒體功能失調(diào)可活化炎性小體NLRP3和cGAS/STING,激活NF-κF轉(zhuǎn)錄因子,釋放IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1等,導(dǎo)致視網(wǎng)膜長期處于慢性低度炎性環(huán)境,加劇AMD的進(jìn)展。衰老相關(guān)分泌表型SASPs包括促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-8、CXCL1、CXCL2、CSF-1,一方面誘導(dǎo)周圍健康細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞衰老,另一方面以自分泌、旁分泌的方式誘導(dǎo)免疫細(xì)胞聚集,引起慢性炎性反應(yīng)。衰老的RPE細(xì)胞內(nèi)蓄積的ROS可以激活NLRP3炎性小體和NF-κF信號(hào)通路,上調(diào)caspase-1,促進(jìn)IL-1β、IL-18等炎性因子的前體轉(zhuǎn)化為活性形式,并激活其他炎性因子,隨著炎性反應(yīng)的加劇免疫功能下降。NLRP3在AMD發(fā)展過程中的作用,目前尚存在爭(zhēng)議,有研究認(rèn)為在AMD的后期抑制NLRP3相關(guān)信號(hào)可防止RPE變性和干性AMD的進(jìn)展,另一些研究則認(rèn)為NLRP3信號(hào)可防止AMD進(jìn)一步發(fā)展。此外,衰老的RPE招募小膠質(zhì)細(xì)胞,激活補(bǔ)體系統(tǒng)并釋放玻連蛋白和簇蛋白等補(bǔ)體通路調(diào)控因子,形成C3和C5膜攻擊復(fù)合物等促炎反應(yīng)物,導(dǎo)致細(xì)胞溶解和釋放趨化因子,進(jìn)一步介導(dǎo)炎性細(xì)胞包括小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集,視網(wǎng)膜單核吞噬細(xì)胞的免疫狀態(tài)是AMD進(jìn)展、轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵決定因素[15]。

2.4 自噬功能失衡

自噬為RPE及視網(wǎng)膜代謝提供了至關(guān)重要的支持,保護(hù)視網(wǎng)膜免受壓力和生理衰老的影響。早期AMD患者中央凹周圍RPE中PTEN誘導(dǎo)激酶1(PTEN induced kinase 1, PINK1)降低,PINK1缺陷型RPE線粒體自噬和線粒體功能受損,觸發(fā)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,這種作用可以被一種分泌性蛋白Kallistatin所逆轉(zhuǎn)[16-17]。當(dāng)自溶體形成受損時(shí)分泌性自噬取代退化性自噬,導(dǎo)致RPE釋放蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)聚集體、脂褐素、β-淀粉樣蛋白、線粒體缺陷、促炎因子和促血管生成因子,形成玻璃膜疣和脈絡(luò)膜新生血管。抑制分泌性自噬可能是AMD的一種治療策略,分泌性自噬體特異性的TRIM16、SEC22B和RAB8A蛋白可能是治療靶點(diǎn)的主要候選蛋白[18]。年齡的增長導(dǎo)致褪黑素含量下降,補(bǔ)充褪黑素通過抑制低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)/Bcl2/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(Bcl2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3, BNIP3)-輕鏈3B(light chain 3B, LC3B)/線粒體自噬信號(hào)抑制碘酸鈉誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞凋亡[19]。

2.5 腸道屏障和腸道微生態(tài)失衡

隨著衰老的進(jìn)展,由上皮細(xì)胞、黏液層、抗菌肽、IgA分泌的免疫球蛋白構(gòu)成的腸道上皮屏障功能下降,導(dǎo)致腸道微生物的多樣性和豐富性下降。腸道微生物的結(jié)構(gòu)也隨著衰老逐漸變化:水解蛋白質(zhì)的潛在的腸道病原菌豐度增加,有利于維持腸道屏障功能完整性的水解糖類的腸道菌以及具有抗氧化活性的腸道菌豐度下降[20-21]。腸道菌及其代謝產(chǎn)物如短鏈脂肪酸可以直接或者間接修飾不同細(xì)胞的表觀基因組,從而調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能,老化的腸道菌群及其代謝產(chǎn)物可以刺激免疫系統(tǒng)的先天免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答,誘導(dǎo)全身性炎性反應(yīng),通過“腸-眼軸”、“腸-視網(wǎng)膜軸”在視網(wǎng)膜遠(yuǎn)端影響免疫狀態(tài),導(dǎo)致視網(wǎng)膜長期處于炎性環(huán)境,誘發(fā)AMD的發(fā)生和發(fā)展。老化的腸道內(nèi)乳酸菌豐度下降,乳酸可緩解線粒體膜電位破壞、減輕細(xì)胞內(nèi)ROS,上調(diào)LC3II/I的比例激活自噬、增加LC3點(diǎn)狀和自噬液泡的形成,保護(hù)線粒體功能并防止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜變性[22]。

2.6 促血管生成-抗血管生成失衡

RPE同時(shí)生成促血管生成因子VEGF以及抗血管生成因子--色素上皮衍生因子維持正常視網(wǎng)膜內(nèi)穩(wěn)態(tài);衰老或早衰的RPE細(xì)胞內(nèi)蓄積的ROS通過低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α通路上調(diào)VEGF的表達(dá),促進(jìn)脈絡(luò)膜新生血管形成。脆弱的脈絡(luò)膜新生血管易破裂受損,促使鄰近RPE缺氧并上調(diào)VEGF表達(dá),導(dǎo)致絨毛膜、毛細(xì)血管血流失調(diào),加劇濕性AMD進(jìn)展[23]。

3 問題與展望

AMD的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚、缺乏特異性專屬性衰老相關(guān)靶點(diǎn),嚴(yán)重阻礙了AMD藥物研發(fā)進(jìn)程。NF-κF、Nrf2、VEGF是其主要靶點(diǎn),NF-κF抑制劑、Nrf2激活劑、VEGF抗體、補(bǔ)體抑制劑、端粒激活劑、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑、微生態(tài)調(diào)節(jié)劑可以在一定程度上促使受損的視網(wǎng)膜重獲細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),可以在一定程度上延緩AMD的發(fā)生和發(fā)展。