車笑吟,閆 滿,2,沙萬(wàn)里,2*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院,吉林 吉林 132109;2.吉林省豬生態(tài)養(yǎng)殖及疫病防控科技創(chuàng)新中心,吉林 吉林 132109)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)是一種條件致病菌,高溫、高濕的夏季和秋季以及氣候多變的春季使宿主的免疫力降低時(shí),Pm侵入機(jī)體在局部大量繁殖引起菌血癥和敗血癥,造成疫病快速流行,發(fā)病率高達(dá)100%[1],環(huán)境中的噪音、光線等外界刺激產(chǎn)生的壓力還會(huì)導(dǎo)致發(fā)病率和致死率上升[2]。哺乳羊羔感染Pm甚至在數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)之內(nèi)死亡[3],一經(jīng)發(fā)生會(huì)對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失,而且還會(huì)感染人類,嚴(yán)重者可能因此患腦膜炎而致死。該菌引起疾病的途徑分為內(nèi)源性和外源性兩種,病畜、病禽的排泄物及分泌物,攜帶病原菌的動(dòng)物本身均是該病的重要傳染源。但該菌對(duì)環(huán)境變化的抵抗能力弱,常規(guī)消毒劑和去污劑均可將其迅速殺滅[4],對(duì)林可霉素、鏈霉素、磺胺類等抗生素敏感[5]。相關(guān)研究表明,Pm的毒力因子包括莢膜、脂多糖(LPS)、菌毛與黏附素、外膜蛋白、鐵調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白、皮膚壞死因子(PMT)、唾液酸與透明質(zhì)酸酶、超氧化物歧化酶[6]。

1 Pm的耐藥性及耐藥機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn),Pm會(huì)對(duì)β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、四環(huán)素類、氯霉素類、磺胺類抗生素產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性。抗生素的耐藥機(jī)制是復(fù)雜的,持續(xù)接觸抗生素可以篩選細(xì)菌中的耐藥菌株[7],從而導(dǎo)致耐藥基因可以通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移在各種細(xì)菌病原體之間共享[8]。

1.1 大環(huán)內(nèi)酯類

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(macrolidesantibiotics,MA)是一類分子結(jié)構(gòu)中具有14～16碳內(nèi)酯環(huán)的抗菌藥物的總稱,是臨床放線菌屬細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物[9],通過(guò)阻斷50s核糖體中肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性來(lái)抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成。Elsayed等[10]分離的55株P(guān)m對(duì)阿奇霉素等大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥率均為50.9%,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中攜帶erm頻率為40%,34.5%的分離株同時(shí)攜帶mph(E)和msr(E)。erm編碼MLSB單甲基轉(zhuǎn)移酶,mph(E)編碼大環(huán)內(nèi)酯流出泵,msr(E)編碼大環(huán)內(nèi)酯失活磷酸轉(zhuǎn)移酶。Olsen等[11]在與牛呼吸道相關(guān)的分離菌株中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥決定因素msr(E)、mph(E)和erm(42),erm(42)基因?yàn)榘形患谆x予抗性,并在整合結(jié)合元件內(nèi)進(jìn)行染色體編碼。殷貴虎等[12]也曾分離出1株含有大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因mef(B)的Pm,提供了Pm耐藥和變異機(jī)理的進(jìn)一步研究思路。

1.2 四環(huán)素類

四環(huán)素類抗生素(Tetracyclines,TCS)是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素,通過(guò)與細(xì)菌的核糖體結(jié)合,進(jìn)而干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成來(lái)發(fā)揮抗菌的作用[13]。2017年Hu[14]分離的55株P(guān)m對(duì)強(qiáng)力霉素的耐藥率最高為83.64%;Wentzel等[15]對(duì)50株P(guān)m進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)55.17%的Pm對(duì)土霉素耐藥;Depenbrock等[16]檢測(cè)145株P(guān)m,發(fā)現(xiàn)所有分離株被歸類為對(duì)四環(huán)素不敏感;王喜等[17]分離出1株含有四環(huán)素耐藥基因tetB的Pm菌株,該基因編碼四環(huán)素外排泵,使菌株產(chǎn)生耐藥;張亞楠等[18]發(fā)現(xiàn),1株P(guān)m含有5個(gè)四環(huán)素耐藥基因tetA、tetB、tetT、tet34、tet35,其中tetT可能與保護(hù)細(xì)胞核免受抗生素作用有關(guān);Oh等[19]選擇了來(lái)自韓國(guó)的37株P(guān)m,觀察到4種tet基因:tetB(78.4%)、tetH(16.2%)、tetC(5.4%)和tetO(2.7%),這是Pm中tetC的首次報(bào)道。

1.3 β-內(nèi)酰胺類

β-內(nèi)酰胺類抗生素(β-lactams)能抑制胞壁粘肽合成酶,即青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding proteins,PBPs),從而阻礙細(xì)胞壁粘肽合成,使細(xì)菌胞壁缺損,抑制菌體生長(zhǎng)[20]。除此之外,對(duì)細(xì)菌的致死效應(yīng)還包括觸發(fā)細(xì)菌的自溶酶活性,缺乏自溶酶的突變株則表現(xiàn)出耐藥性。質(zhì)粒介導(dǎo)的TEM-1和ROB-1β-內(nèi)酰胺酶基因之前已在Pm分離菌株中發(fā)現(xiàn),使其對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生抗性[21]。Elsayed等[22]在Pm中發(fā)現(xiàn)了超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因blaCTX-M和blaCTX-M-1,該基因?qū)е戮陮?duì)頭孢噻肟具有高度耐藥性[23]。

1.4 磺胺類

磺胺類抗生素(Sulfonamides,SAs)是指具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱?；前匪幍幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)與PABA類似,能與PABA競(jìng)爭(zhēng)二氫葉酸合成酶,影響二氫葉酸的合成,因而使細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖受到抑制?；前奉愃幬锬退幓騭ul2通常位于小的非接合性質(zhì)?；虼蟮目梢赞D(zhuǎn)移的多重耐藥質(zhì)粒。Zhu等[24]發(fā)現(xiàn),一株P(guān)m對(duì)磺胺甲惡唑的MIC值大于512 mg/L。Niemann等[25]發(fā)現(xiàn),在ΔstrA-dfrA14-ΔstrA片段的上游存在完整磺胺抗性基因sul2。

1.5 氨基糖苷類

氨基苷類抗生素(aminoglycosides)是由二個(gè)或三個(gè)氨基糖分子和一個(gè)非糖部分稱苷元的氨基環(huán)醇通過(guò)醚鍵連接而成,作用于細(xì)菌體內(nèi)的核糖體,抑制蛋白質(zhì)的合成,破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。Schnecker等[26]對(duì)分離出的Pm中觀察到的最高抗菌藥物耐藥率(>80%)是壯觀霉素。Snyder[27]提到ICE中存在基因aadA25、aadB、strA和strB以及aphA1,這些基因編碼氨基糖苷類的抗性基因。aadA25通過(guò)編碼3'-O腺苷酸轉(zhuǎn)移酶促進(jìn)對(duì)鏈霉素的耐藥性。aadB還編碼2'-O腺苷酸轉(zhuǎn)移酶促進(jìn)對(duì)卡那霉素的耐藥性。strA、strB和aphA1是編碼氨基糖苷類磷酸轉(zhuǎn)移酶的抗性基因,可修飾和滅活氨基糖苷類抗生素。Wang等[28]在研究中檢測(cè)到的Met、Ser和Phe的丟失被認(rèn)為會(huì)影響突變的S5蛋白與16SrRNA的結(jié)合。先前的研究表明,核糖體蛋白S5的19至33位氨基酸形成一個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu),參與大觀霉素與核糖體的結(jié)合,導(dǎo)致大觀霉素抗性。

1.6 喹諾酮類

喹諾酮類抗生素(quinolones)作用的靶酶為細(xì)菌的DNA回旋酶(gyrase)及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ。對(duì)大多數(shù)革蘭陰性細(xì)菌而言,DNA回旋酶是喹諾酮類藥物的主要靶酶。喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)靶位基因突變通常定位于gyrA或parC的氨基末端結(jié)構(gòu)域,gryB和parE的突變也會(huì)導(dǎo)致喹諾酮類藥物耐藥,但突變頻率相對(duì)少[29]。張亞楠等[30]在Pm中發(fā)現(xiàn)基因mfd,該基因在空腸彎曲桿菌中的過(guò)度表達(dá)提高了環(huán)丙沙星耐藥性的自發(fā)突變率,對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥性的產(chǎn)生起重要作用。但mfd在Pm中對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥性的作用還需要進(jìn)一步驗(yàn)證[18]。孔令聰?shù)萚31]研究發(fā)現(xiàn),由于突變菌83-位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?環(huán)丙沙星與ILE-83的雙氫鍵作用消失,拓?fù)洚悩?gòu)酶C亞基(parC) QRDR的80-位絲氨酸和84-位谷氨酸分別突變?yōu)榱涟彼岷唾嚢彼?使環(huán)丙沙星與Ser-80和Glu-84的氫鍵作用消失,從結(jié)構(gòu)的角度驗(yàn)證了Pm對(duì)喹諾酮類藥物高度耐藥性的原因。

1.7 氯霉素類

氯霉素類抗生素(chloram phenicols)是一種由委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomycesvenezuela)中分離提取的廣譜抗生素。氯霉素及其氟含衍化物可抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的生物合成。Vassort-Bruneau等[32]研究了25株P(guān)m,在所有這些菌株中都證明了乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的產(chǎn)生。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明,其中23例產(chǎn)生的CAT為III型。在另外兩個(gè)菌株中,證明了I型CAT的產(chǎn)生。該基因通過(guò)編碼CAT從而起到使氯霉素滅活的作用。馬雪[33]研究發(fā)現(xiàn),部分Pm含有氯霉素耐藥基因floR,該基因編碼特異性的外排泵,介導(dǎo)細(xì)菌的主要外排作用。

2 其他耐藥機(jī)制

2.1 整合子介導(dǎo)耐藥機(jī)制

整合子是一種運(yùn)動(dòng)性的 DNA分子,具有獨(dú)特結(jié)構(gòu),可捕獲和整合外源性基因,使之轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄曰虻谋磉_(dá)單位。它通過(guò)轉(zhuǎn)座子或接合性質(zhì)粒,使多重耐藥基因在細(xì)菌中進(jìn)行水平傳播。在革蘭陰性菌中已有四類整合子,其中I型整合子檢出率最高。sul1基因通常由Ⅰ類整合子介導(dǎo),是Ⅰ類整合子的一部分。Smith等[34]分離出含有氨基糖苷類耐藥基因的Pm占總數(shù)的18.1%,它們或來(lái)源于整合和共軛元件 (ICE) ICEPmu1或來(lái)源于IncQ1質(zhì)粒,其中包含基因aph(3")-lb、aph(3')-la、aph(6)-ld,賦予對(duì)氨基糖苷類藥物的抗性。

2.2 SOS反應(yīng)介導(dǎo)耐藥機(jī)制

細(xì)菌DNA損傷誘導(dǎo)反應(yīng)(SOS反應(yīng))增強(qiáng)了細(xì)菌修復(fù)損傷DNA的能力,弱化了抗菌藥物的影響。張海鵬等[35]研究發(fā)現(xiàn),SOS及同源重組可介導(dǎo)耐藥機(jī)制,SOS應(yīng)答與牛莢膜A型Pm對(duì)喹諾酮類藥物耐藥的適應(yīng)性相關(guān),其中recO基因的缺失可顯著降低其對(duì)喹諾酮類藥物的突變頻率。

2.3 抗生素靶位突變介導(dǎo)耐藥機(jī)制

抗生素靶位突變,即與抗生素結(jié)合的DNA或蛋白質(zhì)靶位點(diǎn)突變或者被修飾后,影響了抗生素與靶點(diǎn)結(jié)合,從而影響了抗生素的殺傷作用。Olsen等[11]對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類高度耐藥的Pm進(jìn)行靶位基因的檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)3株P(guān)m耐藥菌在23SrRNA發(fā)生A2059G堿基突變,這一堿基正是克拉霉素結(jié)合位點(diǎn)。

3 結(jié)論與展望

Pm耐藥機(jī)制種類繁多,大多數(shù)研究證明Pm的耐藥性與外排泵介導(dǎo)、藥物靶位突變、整合子、耐藥質(zhì)粒等因素有關(guān)。本文通過(guò)總結(jié)前人在Pm與β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、四環(huán)素類、氯霉素類、磺胺類抗生素耐藥機(jī)制方面的研究總結(jié)出部分耐藥機(jī)制。目前,抗生素仍是對(duì)巴氏桿菌病的主要治療手段,但隨著抗生素的持續(xù)使用,不少巴氏桿菌已經(jīng)獲得了耐藥性,并且該耐藥性可通過(guò)質(zhì)粒等物質(zhì)轉(zhuǎn)移到其他菌中,給Pm感染的治療增加了難度。細(xì)菌素是近來(lái)備受矚目的替抗藥品,具有良好的抗菌活性和較高的穩(wěn)定性,部分細(xì)菌素被發(fā)現(xiàn)對(duì)Pm具有抑制作用,但要應(yīng)用于臨床仍需要更多的試驗(yàn)來(lái)明晰相關(guān)作用機(jī)理以及毒副作用。