金明靜， 李艷萍， 周歡思， 楊梅， 趙昱倩， 盧春花

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬?lài)?guó)際壯醫(yī)醫(yī)院， 廣西 南寧 530200； 2.廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院壯瑤醫(yī)藥研究實(shí)驗(yàn)室， 廣西 南寧 530200； 3.南寧市第一人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 廣西 南寧 530021）

肺癌作為癌癥死亡最主要的原因，是癌癥發(fā)病的第2 大原因[1]，已成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病，2020 年肺癌發(fā)病率和病死率均隨著年齡和人類(lèi)發(fā)展指數(shù)等級(jí)的升高而逐漸升高[2]，由于肺癌早期臨床癥狀及體征隱匿，被確診時(shí)多數(shù)已錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)，其傳統(tǒng)手術(shù)治療有限，且對(duì)正常組織器官損傷較大，因此尋找新的治療藥物，完善抗腫瘤藥物數(shù)據(jù)顯得格外重要。

鉤吻（GelsemiumelegansBenth.）為馬錢(qián)科胡蔓藤屬植物全草，有劇毒，以根、葉及全草入藥。其別名較多，如斷腸草、大茶藥、豬人參、葛根、大炮葉、山砒霜等，主要分布在我國(guó)廣西、云南、福建等長(zhǎng)江以南的地區(qū)?！肚Ы鹨矸健分休d：鉤吻味辛，溫，有大毒。主金瘡乳痓，中惡風(fēng)，咳逆上氣，水腫，殺鬼疰蠱毒，破瘕積，除腳膝痹痛，四肢拘攣，惡瘡疥蟲(chóng)，殺鳥(niǎo)獸[3]。吲哚類(lèi)生物堿是鉤吻的主要有效成分，其中含量最多的是鉤吻素子（koumine），其次包括鉤吻綠堿（gelsevirine）、鉤吻素甲（gelsemine）、胡蔓藤堿乙（humantenine）和鉤吻素己（gelsenicine）等[4]。鉤吻具有明顯的抗腫瘤及鎮(zhèn)痛作用，同時(shí)具有抗焦慮、修復(fù)放射損傷及放射增敏、造血保護(hù)、抗炎、抗曲霉菌等作用[5]。早在1984 年，就有學(xué)者將鉤吻堿注射液應(yīng)用于臨床，觀察到其對(duì)內(nèi)臟平滑肌痙攣引起的絞痛和癌性疼痛均有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，總有效率高達(dá)90%，推測(cè)鉤吻止痛效果較為可靠，且不具有成癮性，可作為嗎啡、鹽酸哌替啶的替代品[6]，鉤吻醇提物具有一定的抗腫瘤作用，其促進(jìn)Hela 細(xì)胞凋亡，并使Hela 細(xì)胞周期阻滯在G2/M 期，G0/G1期也有一定阻滯作用[7]，將其與玉葉金花混合提取，既可保持鉤吻抗腫瘤的療效，又降低毒性[8]。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鉤吻總堿（total alkaloids ofGelsemiumelegansBenth., TAG）能抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29 和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，并且TAG 對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、侵襲和管腔形成均有抑制作用，從而推測(cè)TAG 抗腫瘤作用的機(jī)制可能與抑制腫瘤血管新生有關(guān)[9-11]。TAG 呈劑量依賴(lài)性抑制人舌癌細(xì)胞Tca8113增殖、促進(jìn)凋亡，推測(cè)與調(diào)控JAK2/STAT3/Survivin 通路有關(guān)[12]。對(duì)TAG 進(jìn)行分離純化得到的9 種吲哚類(lèi)生物堿對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、人肺癌細(xì)胞A549、人慢性髓系白血病細(xì)胞K562、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3 均具有抑制作用[13]。MTT 法觀察到鉤吻生物堿化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、人胃癌細(xì)胞MGC80-3、人食管癌細(xì)胞TE-11 和人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 增殖有抑制作用，并且發(fā)現(xiàn)鉤吻生物堿化合物具有抗消化系統(tǒng)腫瘤活性，并具有構(gòu)效關(guān)系[14]?；诖?，本文從細(xì)胞增殖和凋亡的角度采用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等方法研究TAG 對(duì)肺腺癌A549、SPCA1 細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、藥品及試劑

肺腺癌細(xì)胞系（A549、SPCA1）由廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院壯瑤醫(yī)藥研究實(shí)驗(yàn)室保存。鉤吻生藥材購(gòu)自玉林市銀豐國(guó)際中藥港，經(jīng)廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院壯瑤醫(yī)藥研究實(shí)驗(yàn)室陳少峰副主任藥師鑒定確認(rèn)。鉤吻素子對(duì)照品（純度：99.45%，編號(hào)：T5S0661），鉤吻堿甲對(duì)照品（純度：98%，編號(hào)：T5S0662）均購(gòu)自上海陶術(shù)生物科技有限公司。DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司，編號(hào)：C11995500BT），胎牛血清[依科賽生物科技（太倉(cāng)）有限公司，編號(hào)：FSP500]，PBS 緩沖液（編號(hào)：P1020）、胰蛋白酶（編號(hào)：T1300）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，青霉素-鏈霉素溶液（編號(hào)：C0222）、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（編號(hào)：P0018FS）、增強(qiáng)型CCK-8 試劑盒（編號(hào)：C0042）、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（編號(hào)：C1052）、Hoechst 33258 染色液（編號(hào)：C1018）、Rhodamine 123（編號(hào)：C2007）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）[安倍醫(yī)療器械貿(mào)易（上海）有限公司，編號(hào)：196055]，Caspase-3（編號(hào)：19677-1-AP）、Bcl-2（編號(hào)：12789-1-AP）、Bax（編號(hào)：50599-2-Ig）、GAPDH 抗體（編號(hào)：60004-1-Ig）均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

活細(xì)胞動(dòng)態(tài)功能分析系統(tǒng)（美國(guó)Sartorius 公司，型號(hào)：Incucyte S3），全自動(dòng)激光四色流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司，型號(hào)：BD FACSVia），熒光倒置顯微鏡（日本Olympus 公司，型號(hào)：CKX53），細(xì)胞計(jì)數(shù)器（美國(guó)Beckman Coulter 公司，型號(hào)：ZⅠ型），多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司，型號(hào)：SYNERGY H1M），二氧化碳培養(yǎng)箱（新加坡Esco 公司，型號(hào)：CCL-240B-8），高速臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司，型號(hào)：5424R），置入-80 ℃超低溫冰箱冷凍（中國(guó)海爾公司，DW-86L626），近紅外雙色熒光成像系統(tǒng)（德國(guó)耶拿公司，型號(hào)：UVP Chem Studio 815）。

1.3 方法

1.3.1 TAG 的提取及配制 將鉤吻生藥材用氫氧化鈉NaOH 水溶液浸濕，采取加熱回流、減壓旋蒸、萃取及蒸干的實(shí)驗(yàn)方法提取TAG，配制前溶解于濃度為4 g/mL 的DMSO 儲(chǔ)存液，于4 ℃下避光保存。

1.3.2 薄層色譜法 ①對(duì)照品溶液的制備：分別稱(chēng)取0.5 mg 鉤吻堿甲、鉤吻素子對(duì)照品，加甲醇溶解制成濃度均為1 mg/mL 的對(duì)照品溶液；②供試品溶液的制備：稱(chēng)取0.5 mg TAG，加甲醇溶解制成濃度分別為1 mg/mL 的供試品溶液。吸取制備的供試品和鉤吻素子、鉤吻堿甲對(duì)照品溶液各6 μL 分別點(diǎn)于以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 板上，以三氯甲烷-甲醇（9∶1）為展開(kāi)劑，將薄層板飽和10 min，展開(kāi)、取出、晾干、噴以碘化鉍鉀試液，可見(jiàn)光下檢視。溶質(zhì)移動(dòng)距離與流動(dòng)相前沿移動(dòng)距離之比值（Rf值）=原點(diǎn)到斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng) A549、SPCA1 細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4 Incucyte S3 活細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析系統(tǒng)擬合細(xì)胞融合度、EC50 值及觀察細(xì)胞形態(tài) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549、SPCA1 細(xì)胞以4 000 個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96 孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，以不加TAG 為對(duì)照組，不同濃度的TAG 作為實(shí)驗(yàn)組處理細(xì)胞，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔，將96 孔板置于活細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析系統(tǒng)中動(dòng)態(tài)檢測(cè)48 h，系統(tǒng)根據(jù)細(xì)胞融合度擬合EC50 值及觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549、SPCA1 細(xì)胞消化后，重懸計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度以4 000 個(gè)/孔接種于96 孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。以不加TAG 為對(duì)照組，不同濃度的TAG（50、100 和150 μg/mL）作為實(shí)驗(yàn)組處理細(xì)胞，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 和48 h，移除各孔中原有的培養(yǎng)基，每孔加入含有10 μL CCK-8 的溶液，將96 孔板重新放回37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處吸光度，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=1-（實(shí)驗(yàn)組平均吸光值-背景值）/（對(duì)照組平均吸光值-背景值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期的A549、SPCA1 細(xì)胞，重懸計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度以2 500 個(gè)/孔接種于12 孔板中，于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)至合適克隆團(tuán)時(shí)，以不加TAG為對(duì)照組，不同濃度的TAG（50、100 和150 μg/mL）作為實(shí)驗(yàn)組處理細(xì)胞48 h，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，結(jié)晶紫染色。掃描儀掃描12 孔板，用Image J 軟件對(duì)克隆團(tuán)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.7 Hoechst 33258 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549、SPCA1 細(xì)胞，重懸計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度以5 000 個(gè)/孔接種于12 孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后以不加TAG 為對(duì)照組，不同濃度的TAG（50、100 和150 μg/mL）作為實(shí)驗(yàn)組處理細(xì)胞48 h，染色時(shí)各孔加入500 μL Hoechst 33258 染色液，充分覆蓋住待染色的樣品，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)30 min 后棄染色液，用無(wú)菌PBS 洗3 次，熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.3.8 Rhodamine123 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549、SPCA1 細(xì)胞，重懸計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL 接種于6 孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后以不加TAG 為對(duì)照組，不同濃度的TAG（50、100 和150 μ g/mL）作為實(shí)驗(yàn)組處理細(xì)胞48 h，染色時(shí)吸除舊培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS 洗滌2 次，在37 ℃黑暗環(huán)境下用2 μmol Rhodamine 123染色30 min，用無(wú)菌PBS 洗滌2 次收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3.9 Western blotting 檢測(cè)Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá) 以不加TAG 為對(duì)照組，不同濃度的TAG（50、100 和150 μg/mL）作為實(shí)驗(yàn)組處理細(xì)胞48 h，胰酶消化細(xì)胞，PBS 清洗2 次，組織裂解液（RIPA）提取蛋白。蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，封閉液封閉，加入Caspase-3、Bcl-2、Bax及內(nèi)參蛋白GAPDH 抗體孵育，ECL 顯色液在PVDF膜上顯色，在近紅外雙色熒光成像系統(tǒng)中測(cè)定各組蛋白條帶。

1.3.10 PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549、SPCA1 細(xì)胞，細(xì)胞密度以1×105/mL 接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后以不加TAG為對(duì)照組，不同濃度的TAG（50、100 和150 μg/mL）作為實(shí)驗(yàn)組處理細(xì)胞48 h，胰酶消化后使用PBS 洗滌2 次，加入經(jīng)預(yù)冷后的乙醇，4 ℃固定過(guò)夜，PI 染色液37 ℃避光溫浴30 min。染色后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的分布。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 9.5 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)分析以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 薄層色譜法鑒定結(jié)果

在TAG 供試品薄層色譜中（見(jiàn)圖1），與鉤吻素子、鉤吻堿甲對(duì)照品相應(yīng)位置顯現(xiàn)相同橙色斑點(diǎn)，對(duì)照品的斑點(diǎn)的Rf 值分別為0.63 和0.45，斑點(diǎn)清晰，Rf 值適中，因此可鑒別TAG 中含有鉤吻素子、鉤吻堿甲。

圖1 TAG薄層色譜圖

2.2 Incucyte S3活細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析系統(tǒng)擬合細(xì)胞融合度、EC50值及觀察細(xì)胞形態(tài)

根據(jù)不同濃度的TAG 作用細(xì)胞48 h 的細(xì)胞融合度改變，Incucyte S3 活細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析系統(tǒng)擬合出A549、SPCA1 細(xì)胞的EC50 值分別是99.2、82.0 μg/mL（見(jiàn)圖2），因此確定后續(xù)TAG 對(duì)A549、SPCA1 細(xì)胞增殖、凋亡等實(shí)驗(yàn)中的低、中、高濃度，依次為50、100、150 μg/mL。隨著TAG 濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞融合度降低，生長(zhǎng)狀態(tài)逐漸變差，部分細(xì)胞形態(tài)變小變圓，大小不一，藥物作用呈濃度依賴(lài)性（見(jiàn)圖3）。

圖2 TAG作用A549、SPCA1細(xì)胞48 h細(xì)胞融合度的改變及EC50值

圖3 各組A549、SPCA1細(xì)胞48 h的細(xì)胞形態(tài) （×10）

2.3 TAG抑制A549、SPCA1細(xì)胞的增殖

采用CCK-8 法檢測(cè)TAG 對(duì)A549、SPCA1 細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TAG100、150 μg/mL 組干預(yù)A549、SPCA1 細(xì)胞后能明顯抑制細(xì)胞的增殖，隨著TAG 作用濃度增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，A549、SPCA1 細(xì)胞抑制率逐漸升高（P<0.05）（見(jiàn)表1）。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100 和150 μg/mL 濃度的TAG 處理A549 細(xì)胞48 h 后，TAG 細(xì)胞克隆形成顯著減少（見(jiàn)圖4 和表2）。

表1 各組A549、SPCA1細(xì)胞24和48 h細(xì)胞抑制率的比較 （±s）

表1 各組A549、SPCA1細(xì)胞24和48 h細(xì)胞抑制率的比較 （±s）

注 ： ?與對(duì)照組比較，P <0.05。

組別對(duì)照組TAG 50 μg/mL組TAG 100 μg/mL組TAG 150 μg/mL組F 值P 值A(chǔ)549 24 h 0.00±0.00 9.22±5.10 20.6±11.22?34.24±6.84?13.200 0.002 48 h 0.00±0.00 10.93±3.46 29.95±13.98?53.15±14.66?15.450 0.001 SPCA1 24 h 0.00±0.00 12.04±3.45?20.60±3.83?28.37±2.29?55.870 0.000 48 h 0.00±0.00 13.19±5.16?27.06±3.31?40.86±5.52?54.720 0.000

表2 各組A549、SPCA1細(xì)胞集落面積的比較 （±s）

表2 各組A549、SPCA1細(xì)胞集落面積的比較 （±s）

注 ： ? 與對(duì)照組比較，P <0.05。

組別對(duì)照組TAG 50 μg/mL組TAG 100 μg/mL組TAG 150 μg/mL組F 值P 值A(chǔ)549 20.74±1.01 18.32±1.08 16.84±1.61 9.78±1.04?45.460 0.000 SPCA1 40.26±9.56 38.17±9.06 31.59±11.33 19.11±4.66 3.366 0.075

圖4 TAG抑制A549、SPCA1細(xì)胞集落形成

2.4 TAG促進(jìn)A549、SPCA1細(xì)胞凋亡

與對(duì)照組比較，50、100 和150 μg/mL 濃度的TAG 處理A549、SPCA1 細(xì)胞48 h，經(jīng)Hoechst 33258染色發(fā)現(xiàn)對(duì)照組A549、SPCA1 細(xì)胞著色均勻，呈規(guī)則的圓形，TAG 50、100 和150 μg/mL 組均出現(xiàn)細(xì)胞核碎裂、邊緣不規(guī)則，大小不一，細(xì)胞數(shù)量減少（見(jiàn)圖5）。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Rhodamine123 探針染色熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)TAG 50、100 和150 μg/mL 組均出現(xiàn)熒光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)（見(jiàn)圖6）。Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，給藥組Bcl-2 表達(dá)下調(diào)，Bax 表達(dá)上調(diào)，Bcl-2/Bax 的比率降低，Caspase-3 的切割活化增加，其中以濃度為150 μg/mL 的TAG 作用最顯著（P<0.05），見(jiàn)圖7 和表3。以上結(jié)果提示TAG 促進(jìn)A549、SPCA1 細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

表3 TAG對(duì)A549、SPCA1細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 （±s）

表3 TAG對(duì)A549、SPCA1細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 （±s）

注 ： ?與對(duì)照組比較，P <0.05。

組別對(duì)照組TAG 50 μg/mL組TAG 100 μg/mL組TAG 150 μg/mL組F 值P 值A(chǔ)549細(xì)胞Bcl-2 1.23±0.22 1.03±0.12 0.61±0.05?0.41±0.02?17.110 0.010 Bax 0.52±0.08 0.84±0.15?0.88±0.07?1.11±0.08?12.180 0.018 Cleaved Caspase-3 0.36±0.09 0.82±0.12?0.84±0.09?1.13±0.06?22.120 0.006 Bcl-2/Bax 2.36±0.05 1.23±0.08?0.70±0.11?0.37±0.00?299.900 0.000 SPCA1細(xì)胞Bcl-2 1.73±0.20 0.85±0.17?0.72±0.08?0.54±0.08?27.210 0.004 Bax 0.63±0.06 0.77±0.10 1.32±0.59 2.70±0.47?12.250 0.018 Cleaved Caspase-3 0.51±0.13 0.51±0.11 0.74±0.15 1.78±0.41?13.140 0.015 Bcl-2/Bax 2.76±0.57 1.09±0.09?0.59±0.20?0.20±0.00?27.170 0.004

圖5 TAG作用A549、SPCA1 48 h染色后細(xì)胞核形態(tài)

圖6 TAG對(duì)A549、SPCA1細(xì)胞染色熒光強(qiáng)度變化

圖7 TAG對(duì)A549、SPCA1細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 TAG對(duì)A549、SPCA1細(xì)胞周期的影響

用不同濃度的TAG 處理細(xì)胞48 h 后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相的占比發(fā)生相應(yīng)的變化，處于G2/M 期的細(xì)胞比例隨著TAG 作用濃度的升高而增加，這在A549 細(xì)胞中表現(xiàn)得更明顯，當(dāng)TAG 濃度為150 μg/mL 時(shí)，G2/M 期的比例達(dá)15.55%，而對(duì)照組G2/M 期的比例僅8.02%。這表明TAG 使A549、SPCA1 細(xì)胞周期阻滯在G2/M 期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖8。

圖8 TAG對(duì)A549、SPCA1細(xì)胞周期的影響

3 討論

自20 世紀(jì)后半葉起，全球科學(xué)家們從天然藥物中研發(fā)小分子抗腫瘤藥物，如長(zhǎng)春堿（類(lèi)）、喜樹(shù)堿（類(lèi)）、秋水仙堿和高三尖杉酯堿等生物堿在全球范圍內(nèi)批準(zhǔn)使用，且至今為臨床上常用化療藥物[15]。鉤吻作為中國(guó)傳統(tǒng)瑤藥，其化學(xué)成分豐富，藥理作用廣泛，鉤吻注射液與放射療法相結(jié)合，可提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性，提升治療腫瘤的療效[16]，有研究發(fā)現(xiàn)，鉤吻素子依賴(lài)ROS 通過(guò)NF-κB 和ERK/p38 MAPK 信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞癌的增殖并促進(jìn)凋亡[17]，也能夠顯著減輕神經(jīng)損傷后的神經(jīng)性疼痛，并同時(shí)保留對(duì)神經(jīng)性疼痛的抗炎反應(yīng)[18]。

本課題組前期研究表明，TAG 對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、HCT116、人肝癌細(xì)胞SMMC7721、HepG2、人舌鱗癌細(xì)胞CAL27、人乳腺癌細(xì)胞MCF7 等均具有較明顯的生長(zhǎng)抑制作用，在此基礎(chǔ)上本研究進(jìn)一步探究TAG 對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549、SPCA1 的作用。首先從鉤吻植物中提取TAG，采用薄層色譜法鑒定TAG中含有的化合物鉤吻素子、鉤吻堿甲，然后從TAG 抑制肺腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡的角度分別采取實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。從抑制肺腺癌細(xì)胞增殖的角度使用了Incucyte S3 活細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析系統(tǒng)、CCK-8 法和集落形成實(shí)驗(yàn)：Incucyte S3 活細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析系統(tǒng)擬合出A549、SPCA1細(xì)胞的EC50值分別是99.2和82.0 μg/mL，并且觀察到給藥組細(xì)胞融合度降低，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，生長(zhǎng)狀態(tài)逐漸變差，部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡；CCK-8 法觀察到TAG 干預(yù)A549、SPCA1 細(xì)胞后能明顯抑制細(xì)胞的增殖，且具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性；集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TAG 作用A549、SPCA1 細(xì)胞后，細(xì)胞形成克隆團(tuán)數(shù)下降。從促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞凋亡的角度采用Hoechst 33258 細(xì)胞核染色、Rhodamine123 線粒體染色、Western blotting 及PI 染色法等實(shí)驗(yàn)：Hoechst 33258 細(xì)胞核染色后發(fā)現(xiàn)給藥組出現(xiàn)細(xì)胞核碎裂、核固縮，且細(xì)胞數(shù)目下降；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Rhodamine123 探針染色熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)給藥組熒光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)；Western blotting 結(jié)果顯示Bcl-2/Bax 的比率降低，Caspase-3 的切割活化明顯增加；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到TAG 使A549、SPCA1 細(xì)胞周期阻滯在G2/M 期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。以上研究結(jié)果證實(shí)TAG 具有抑制肺腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的作用。

細(xì)胞凋亡涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控，也是評(píng)價(jià)抗癌藥物有效性的指標(biāo)之一。惡性腫瘤的特征之一是細(xì)胞凋亡程序性失控導(dǎo)致的細(xì)胞增殖，因此凋亡相關(guān)通路可能作為T(mén)AG 抗腫瘤研究的重點(diǎn)。Bcl-2 蛋白家族屬于線粒體凋亡通路，又被稱(chēng)為內(nèi)源性凋亡通路，通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體功能來(lái)調(diào)節(jié)凋亡，屬于凋亡通路中最經(jīng)典的通路，其中Bcl-2 和Bax 分別作為抗凋亡和促凋亡蛋白。細(xì)胞凋亡的線粒體途徑表現(xiàn)為線粒體外膜透化作用和細(xì)胞色素C的活化，Bcl-2 蛋白家族成員之間通過(guò)蛋白-蛋白相互作用來(lái)調(diào)控線粒體凋亡通路。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)Bcl-2/Bax 的比率發(fā)生改變，細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡[19-20]。當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí)Bax 作用于線粒體外膜，使線粒體通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞色素C 釋放，以誘導(dǎo)Caspase 通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)，放大死亡信號(hào)，最終引發(fā)凋亡。本研究TAG 作用肺腺癌細(xì)胞后Bcl-2/Bax 的比率下降，Caspase-3 切割活化增加，推測(cè)TAG 促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞凋亡與此相關(guān)。Rhodamine123 染色經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)線粒體跨膜電位的增加，可能與Bcl-2/Bax 的比率下降、線粒體通透性改變有關(guān)。由此推測(cè)TAG 通過(guò)降低Bcl-2/Bax 的比率引起線粒體跨膜電位的改變從而激活Caspase-3 發(fā)生凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TAG 抑制A549、SPCA1增殖并促進(jìn)凋亡，TAG 具有顯著的抗腫瘤作用，是前景廣闊的抗腫瘤藥物，后續(xù)也將進(jìn)一步研究TAG抗腫瘤作用的分子機(jī)制。