訾瑞， 胡萍

（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科， 寧夏 銀川 750004）

肺癌是亞洲女性及45 歲以下人群最易發(fā)生的惡性腫瘤，常見影響因素包含遺傳、吸煙及被動(dòng)吸煙等[1]。肺癌仍是惡性腫瘤死亡的主要原因，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung carcinoma,NSCLC）的發(fā)生率占肺癌的80%。NSCLC 早期臨床癥狀隱匿性較強(qiáng)，確診時(shí)易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)，5 年生存率較低[2]。肺癌細(xì)胞的增殖、分化及轉(zhuǎn)移過程均依賴血管生成，腫瘤新生血管導(dǎo)致患者預(yù)后不佳。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是當(dāng)前公認(rèn)的腫瘤血管生成的刺激因子，在肺癌中過表達(dá)，能加快腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，惡化病情[3]?，F(xiàn)有的腫瘤標(biāo)志物在肺癌早期篩查中效果不佳，敏感性和特異性較低，往往達(dá)不到早發(fā)現(xiàn)、早診斷的要求[4]。現(xiàn)階段，有學(xué)者提出采用基因檢測(cè)技術(shù)可提高對(duì)腫瘤的診斷價(jià)值，進(jìn)而有利于進(jìn)行針對(duì)性治療，提高治療準(zhǔn)確性，降低患者痛苦。肺癌組織的父系表達(dá)基因3（paternally expressed gene 3, PEG3）表達(dá)下調(diào)，抑微管裝配蛋白1（Stathmin 1, STMN1）表達(dá)上調(diào)[5]，猜測(cè)這兩種基因聯(lián)合可能會(huì)增加NSCLC 診斷的敏感性與特異性。

PEG3 位于人體染色體19q13.43 上，包含一些非編碼區(qū)域，可參與調(diào)控多種信號(hào)通路表達(dá)，例如能夠通過抑制Wnt 信號(hào)而遏制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)，且通過調(diào)控核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）水平而調(diào)節(jié)糖尿病腎臟功能[6]。肺腺癌、膠質(zhì)瘤、乳腺癌及子宮內(nèi)膜癌組織中PEG3 表達(dá)缺失，顯著低于癌旁組織，富集分析認(rèn)為PEG3 的DNA 甲基化發(fā)生改善可導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)改變，可通過關(guān)閉抑癌基因活性而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展[7]。STMN1 定位于人基因染色體1p35-36 中，全長(zhǎng)6.3 kb，具有高度保守性，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。STMN1 在肺癌組織中表達(dá)升高，采用化療藥物長(zhǎng)春瑞濱干預(yù)后表達(dá)降低，患者中位生存期增加，反之，其表達(dá)升高，患者生存率降低[8]。本文探討PEG3、STMN1 基因在NSCLC 中的表達(dá)及其與臨床病理特征和血管生成的關(guān)系，期望為相關(guān)研究提供有利依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院2021 年1 月—2023 年1 月收治的經(jīng)組織學(xué)確診的96 例NSCLC 患者作為研究對(duì)象，經(jīng)手術(shù)切除后保留NSCLC 患者癌組織及癌旁正常組織（距癌組織邊緣>5 cm）放入液氮中低溫保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：①未接受放化療或免疫治療等；②術(shù)前經(jīng)支氣管鏡或腫塊穿刺標(biāo)本病理檢查確診；③所有研究對(duì)象均根據(jù)第8 版TNM 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期[9]；④組織樣本均由患者或家屬知情同意獲?。虎莶±碣Y料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重纖維化；②腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移；③合并其他部位惡性腫瘤；④妊娠和哺乳期；⑤參與其他臨床項(xiàng)目研究者。96 例NSCLC 患者男性55 例，女性41 例；年齡34～74 歲，平均（63.25±9.80）歲；TNM 分期Ⅰ期20 例、Ⅱ期46 例、Ⅲ期30 例；腺癌25 例，鱗癌71 例；高分化24 例；中分化38 例，低分化34 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45 例，未轉(zhuǎn)移51 例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核標(biāo)準(zhǔn)（倫理編號(hào)：KYLL-2021-698），患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗人PEG3 單抗（上海易匯生物科技有限公司，貨號(hào)：sc-102056），兔抗人STMN1 多抗（武漢博歐特生物科技有限公司，貨號(hào)：orb512182），兔抗人VEGF 多抗（北京義翹神州股份有限公司，貨號(hào)：10542-RP01），兔抗人CD105 單抗（北京義翹神州股份有限公司，貨號(hào)：10149-R103-A），兔抗人VEGF 多抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：AV202），CD105（上海莼試生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：CSK99816），免疫組織化學(xué)SP 試劑盒（武漢純度生物科技有限公司，貨號(hào)：CDLG-4852)；TRIzol 試劑盒（上海尚寶生物科技有限公司，貨號(hào)：11131-100），Nano-Drop 2000c 紫外可見光分光光度計(jì)（美國(guó) Thermo Fishe 公司），CFX 型號(hào)熒光定量?jī)x（美國(guó)伯樂公司）。

1.3 方法

1.3.1 資料采集 收集所有研究對(duì)象的臨床資料，包括性別、年齡、TNM 分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測(cè)PEG3、STMN1、VEGF 及CD105 mRNA 表達(dá) 取NSCLC 患者癌組織及癌旁組織，TRIzol 法提取組織中RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度、純度及完整性，經(jīng)鑒定RNA 無降解符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。按照轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為20 μL，分別為總RNA 1.5 μL、特異性莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物2.0 μL、RNA 酶抑制劑1.0 μL、緩沖液4.0 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2.0 μL、DECP 水8.5 μL。PEG3 正向序列：5′-TAATGAAAGTGTTTGAGATTTG TTC-3′，反向序列：5′-CCTATAAACAACCCCACAC CTATAC-3′；STMN1 正向序列：5′-TGAAAGACGCA AGTCCCAT-3′，反向序列：5′-GGTAGCCCCTAAAA CAACAT-3′；VEGF 正向序列：5′-CAGCACGAGCTA CCTCAGCAAG-3′，反向序列：5′-TTTAGACATGCA TCGGCAGGAA-3′；CD105 正向序列：5′-GTCTTGC GCAGTGCTTACTC-3′，反向序列：5′-AGTGTGGGC TGAGGTAGAGG-3′；β-actin 正向序列：5′-GGCATC GTGATGGACTCCG-3′，反向序列：5′-GCTGGAAGG TGGACAGCGA-3′。反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，25 ℃5 min，70 ℃ 5 min。合成cDNA，低溫保存。PEG3、STMN1 均由中國(guó)北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。按照TaqMan PCR 說明書進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系20 μL：正反向引物分別0.6 μL，cDNA 模板2.0 μL，2×Taqman PCR Master Mix為10.0 μL，DECP水6.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 10 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸7 min，40 個(gè)循環(huán)。樣本為3 個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)過程中熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為Ct 值。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，以β-actin 為內(nèi)參，2－ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 免疫組織化學(xué)SP 法檢測(cè)PEG3、STMN1、VEGF及CD105蛋白表達(dá) NSCLC 患者癌組織及癌旁組織石蠟包埋，連續(xù)4 μm 切片，脫蠟、二甲苯水花，微波爐修復(fù)，3%的H2O2失活，低火加熱1 min修復(fù)抗原加血清封閉，加一抗PEG3（1∶200）、STMN1（1∶200）、VEGF（1∶100）及CD105（1∶100），磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶1 000），最后加入DAB 顯色劑染色。蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。染色結(jié)果由本院病理科兩位高年資病理醫(yī)師共同評(píng)估，每張切片對(duì)100 個(gè)觀察細(xì)胞數(shù)的高倍鏡視野進(jìn)行評(píng)估，高倍鏡視野至少10 個(gè)。PEG3、VEGF 蛋白陽(yáng)性物質(zhì)定位于細(xì)胞漿中，棕黃色或棕褐色顆粒。STMN1、CD105 蛋白陽(yáng)性物質(zhì)定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿著色，呈棕褐色顆粒狀。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在同類細(xì)胞數(shù)中占比進(jìn)行評(píng)分：無為0 分，< 20%為1 分，20%～60%為2 分，> 60%為3 分；②按切片中細(xì)胞著色深度進(jìn)行評(píng)分：無著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；兩項(xiàng)乘積為最終的得分。< 4分定義為低表達(dá)，≥ 4分定義為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Graph Pad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較做χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析；相關(guān)性分析用Pearson 法；繪制受試者工作特征（receiver operator characteristic, ROC）曲線。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 組織與癌旁組織的PEG3、STMN1、VEGF和CD105 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

NSCLC 組織與癌旁組織的PEG3、STMN1、VEGF和CD105 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與癌旁組織相比，NSCLC 組織的PEG3 表達(dá)降低，STMN1、VEGF 及CD105 表達(dá)升高。見表1。

2.2 NSCLC 組織及癌旁組織的PEG3、STMN1、VEGF及CD105陽(yáng)性表達(dá)

NSCLC 組織的STMN1、VEGF 及CD105 陽(yáng)性率分別為62.50%（60/96）、69.79%（67/96）、72.92%（70/96），癌旁組織的分別為5.21%（5/96）、10.42%（10/96）、13.54%（13/96），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=70.360， 70.450 和68.950， 均P=0.000）；NSCLC 組織高于癌旁組織。NSCLC 組織的PEG3 陽(yáng)性率為8.33%（8/96），癌旁組織為73.96%（71/96），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=85.360，P=0.000），NSCLC 組織低于癌旁組織。見圖1。

圖1 NSCLC組織及癌旁組織的PEG3、STMN1、VEGF及CD105陽(yáng)性表達(dá) （免疫組織化學(xué)×400）

2.3 不同臨床病理特征NSCLC 患者的PEG3、STMN1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

不同年齡、性別及腫瘤類型NSCLC 患者的PEG3、STMN1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。不同TNM 分期NSCLC 患者中，Ⅰ期20 例，Ⅱ期46 例，Ⅲ期30 例，PEG3 及STMN1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。45 例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與51 例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC 患者的PEG3、STMN1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同分化程度NSCLC 患者中，高分化24 例，中分化38 例，低分化34 例，PEG3 及STMN1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征NSCLC患者的PEG3、STMN1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

2.4 NSCLC 組織的PEG3、STMN1 與VEGF 及CD105相關(guān)性

經(jīng)Pearson 相關(guān)分析，NSCLC 組織的PEG3 與STMN1（r=-0.338，P=0.011）、與VEGF（r=-0.405，P=0.001）及CD105（r=-0.358，P=0.008）均呈負(fù)相關(guān)，NSCLC 組織的STMN1 與VEGF（r=0.305，P=0.028）及CD105（r=0.380，P=0.004）均呈正相關(guān)。見圖2。

2.5 PEG3、STMN1對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值

PEG3 診斷NSCLC 的曲線下面積為0.750（95% CI：0.453，0.936）、敏感性為73.66%（95% CI：0.650，0.937）、特異性為79.62%（95% CI：0.590，0.956）；STMN1 診斷NSCLC 的曲線下面積為0.796（95% CI：0.540，0.942）、敏感性為80.30%（95% CI：0.744，0.978）、特異性為81.12%（95% CI：0.612，0.996）；PEG3+STMN1 聯(lián)合診斷的曲線下面積為0.935（95% CI：0.753，0.995）、敏感性為92.33%（95% CI：0.751，0.930）、特異性為77.12%（95% CI：0.735，0.948）。見表3 和圖3。

圖3 PEG3、STMN1診斷NSCLC的ROC曲線

表3 PEG3、STMN1對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值分析

3 討論

NSCLC 是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展涉及到致癌基因激活、抑癌基因缺失、環(huán)境及遺傳等因素，但隨著研究的深入，其生存率及治愈率未見明顯改善，因此，提高其診斷的準(zhǔn)確性對(duì)改善患者預(yù)后有重要作用[10]。

PEG3 是1996 年外國(guó)學(xué)者KUROIWA 在母系及父系二體胚胎中發(fā)現(xiàn)的印跡基因[11]。PEG3 被鑒定為鋅指基因，參與多種信號(hào)通路表達(dá)進(jìn)而調(diào)控機(jī)體代謝[11]。PEG3 可以調(diào)控Siah1 信號(hào)通路促進(jìn)其從細(xì)胞漿至線粒體中移位，可以抑制Wnt 活性，提高抑癌基因p53 活性進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。國(guó)外學(xué)者研究表明，在PEG3 在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)缺失的原因與啟動(dòng)子甲基化及丟失雜合性相關(guān)[12]。STMN1 已經(jīng)證實(shí)在卵巢癌及乳腺癌中呈高表達(dá)[13-14]，可作為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)分子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明，NSCLC 組織中PEG3 表達(dá)下調(diào)，STMN1 表達(dá)上調(diào)，并與患者TNM 分期及分化程度有關(guān)，前者同時(shí)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。PEG3 在NSCLC 組織表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)缺失導(dǎo)致患者預(yù)后較差，推測(cè)其表達(dá)缺失后導(dǎo)致抑癌因子失活，可加快腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而降低患者生存期。有研究探討STMN1 與肺癌的關(guān)系，證實(shí)其在肺癌組織中高表達(dá)，與患者的性別、吸煙史、腫瘤病理等無關(guān)，但是與腫瘤分化程度相關(guān)[5]。本研究結(jié)果與之相似，均證實(shí)STMN1 作為致癌因子促進(jìn)肺癌的發(fā)生、發(fā)展。STMN1 在肺腺癌中表達(dá)升高，并與患者分化程度相關(guān)，認(rèn)為可以將其作為疾病診斷相關(guān)指標(biāo)[15]。但是關(guān)于兩者與肺癌血管生成關(guān)系的研究較少，本文以此作為創(chuàng)新點(diǎn)，探討PEG3、STMN1 基因在NSCLC 組織的表達(dá)，及其與臨床病理特征的關(guān)系，以及與血管生成的相關(guān)性。

肺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟過程，其中腫瘤微血管是腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的主要過程，VEGF 及CD105 均為腫瘤血管生成的主要因子。VEGF 是促血管活性因子，與受體結(jié)合后可加快血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖而加快腫瘤血管新生[16]。CD105 又稱內(nèi)皮糖蛋白，可在細(xì)胞膜上表達(dá)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transform growth factor-β, TGF-β）受體是其主要活性成分，具有加快血管生成的作用[17]。肺癌組織中VEGF 及CD105 均表達(dá)升高，且復(fù)發(fā)性肺癌患者中表達(dá)水平高于未復(fù)發(fā)患者，認(rèn)為兩者均以調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路加快腫瘤血管及淋巴結(jié)新生，進(jìn)而加快腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移[18]。本研究結(jié)果表明，NSCLC 組織的STMN1、VEGF 及CD105 表達(dá)升高，PEG3 表達(dá)降低；PEG3 與VEGF 及CD105 均呈負(fù)相關(guān)，STMN1 與VEGF 及CD105 均呈正相關(guān)。這說明上調(diào)STMN1 表達(dá)可以增加肺癌組織的侵襲及轉(zhuǎn)移，而VEGF 及CD105 能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移提供有利條件，NSCLC 組織的STMN1、VEGF 及CD105均可以加快腫瘤進(jìn)程；上調(diào)PEG3 表達(dá)可以改善患者預(yù)后，降低腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，與VEGF 及CD105 呈負(fù)相關(guān)。目前，臨床上常見的肺癌標(biāo)志物為血清學(xué)檢查，有CEA、CYFRA21-1、SCCA、NSE、 ProPR 等[4]。 其中， CEA、 CYFRA21-1、SCCA 主要用于小細(xì)胞肺癌檢測(cè)。但是這些指標(biāo)在肺癌早期診斷中效果欠佳，敏感性和特異性均不高。近些年，隨著基因生物技術(shù)的發(fā)展，肺癌疾病發(fā)現(xiàn)多種基因活性發(fā)生改變，因此通過對(duì)異?；蜻M(jìn)行針對(duì)性治療，對(duì)降低患者的病死率及提高診斷率意義重大[19]。本研究ROC 曲線分析結(jié)果表明，PEG3 對(duì)NSCLC 的診斷敏感性、特異性分別為73.66%、79.62%，STMN1 對(duì)NSCLC 的診斷敏感性、特異性分別為80.30%、81.12%，PEG3+STMN1聯(lián)合診斷的敏感性、特異性分別92.33%、77.12%，聯(lián)合診斷價(jià)值顯著提高。

綜上所述，NSCLC 組織PEG3 降低、STMN1 升高，與肺癌TNM 分期、分化程度有關(guān)，其可以加快腫瘤血管生成。PEG3+STMN1 聯(lián)合診斷有望于成為肺癌的新的診斷參考指標(biāo)，有助于疾病的早期診斷和提高臨床療效。本研究的不足之處是本研究樣本量小，還需進(jìn)一步更多研究證實(shí)本研究結(jié)論。