諶星 劉光年 熊華章 董立明

膝關節(jié)骨關節(jié)炎（KOA）是常見的慢性關節(jié)疾病之一，以疼痛、腫脹和功能障礙等為主要臨床表現(xiàn)，且隨病情加重可最終導致肢體殘疾[1-2]。KOA 發(fā)病機制復雜，理想的動物模型是研究KOA發(fā)病機制及其治療手段的重要方法，而建立合適的評價方法是進行動物模型研究的前提[3]。本文對近年KOA 動物模型的評價方法進行綜述，并針對不同評價方法的特點進行介紹，為構建理想的KOA 動物模型提供參考。

1 動物及造模方式選擇

KOA 造?？蛇x用小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、羊、馬和猴等多種動物，這些動物可根據(jù)體型大小分為小型、中型及大型動物[4-5]。KOA 動物模型造模方式多樣，可分為自發(fā)型、手術誘導型和非手術誘導型[4,6-7]。實驗目的、實驗條件和倫理要求是選擇合適的動物模型的主要依據(jù)。

2 評價方法

2.1 組織病理學評價

2.1.1 大體觀察

有研究提出，在對動物進行安樂死處理后，可沿髕韌帶內(nèi)側縱行切開皮膚、皮下及關節(jié)囊，再外翻髕骨并顯露膝關節(jié)，從而可以觀察軟骨的光滑度、顏色及骨贅是否形成[8]。Pelletier 等[9]根據(jù)軟骨受損程度制定了大體軟骨評分系統(tǒng)，評分為0～4分，評分越高提示軟骨受損程度越大。Liu 等[10]通過大體觀察，發(fā)現(xiàn)兔KOA 模型關節(jié)軟骨表面粗糙，軟骨下骨外露，骨贅形成，平均Pelletier 評分為3.9分。大體觀察雖然可以直觀地看到KOA 動物的典型病變，但對細微病變的研究存在不足。

2.1.2 組織染色

組織學檢查雖為有創(chuàng)檢查，但目前仍是評價KOA 動物模型的金標準，常作為建模成功的依據(jù)[5]。KOA 動物模型評價常用的組織學染色方法包括蘇木精-伊紅染色、番紅固綠染色、Masson 染色、甲苯胺藍染色、抗酒石酸酸性磷酸酶染色和阿利新藍染色等。于冬冬等[11]通過蘇木精-伊紅染色、阿利新藍染色及Masson 染色發(fā)現(xiàn)，大鼠KOA 模型軟骨表面粗糙不平、層次紊亂，軟骨細胞數(shù)量減少，膠原分布廣而不均且含量減少，潮線模糊。肖壯等[12]通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色、甲苯胺藍染色及番紅固綠染色發(fā)現(xiàn)，大鼠KOA 模型軟骨下骨破骨細胞數(shù)量早期增加，后逐漸下降至消失，而軟骨細胞數(shù)量逐漸減少，且染色程度逐漸下降至消失，軟管下骨血管侵入潮線。

在組織染色基礎上，Mankin 軟骨評分系統(tǒng)、O'Driscoll 軟骨評分系統(tǒng)、國際骨關節(jié)炎研究學會（OARSI）軟骨評分系統(tǒng)、國際軟骨修復學會（ICRS）軟骨評分系統(tǒng)、ICRS Ⅱ軟骨評分系統(tǒng)以及改良O'Driscoll 軟骨評分系統(tǒng)等相繼建立。Bonasia 等[13]對10 種組織染色軟骨評分系統(tǒng)進行比較，發(fā)現(xiàn)每種評分系統(tǒng)各有優(yōu)缺點，但ICRS Ⅱ軟骨評分系統(tǒng)、O'Driscoll 軟骨評分系統(tǒng)和改良O'Driscoll 軟骨評分系統(tǒng)可靠性更高。組織染色結合軟骨評分系統(tǒng)可在細胞及組織層面對KOA 病變進行評價，為目前最常用的評價方式，但其不足在于必須通過有創(chuàng)的方法獲得病理切片，不利于后續(xù)實驗進行。

2.2 影像學評價

2.2.1 X 線

X 線檢查是診斷人KOA 的首選方法，可顯示關節(jié)間隙變窄、軟骨下骨硬化、骨贅及骨囊腫形成等KOA 典型病理變化，其臨床應用廣泛。Kellgren-Lawrence 分級系統(tǒng)即在X 線檢查基礎上建立，可用于診斷KOA 和選擇治療方案[14]。Ma 等[15]通過X 線檢查發(fā)現(xiàn)，兔KOA 模型患肢膝關節(jié)表面粗糙不平，關節(jié)間隙變小，骨贅形成。X 線檢查評估KOA 動物模型易實施，但也存在不足，如有電離輻射，不能觀察到細微病變及對軟組織敏感度低等。

2.2.2 電子計算機斷層掃描

電子計算機斷層掃描（CT）可先通過非侵入的方式掃描捕獲一系列2D 平面圖像，再應用3D重建技術和軟件分析系統(tǒng)進行分析，用于評估KOA 動物模型的骨特征。其中micro-CT 可提供高分辨率圖像，可對骨小梁結構實現(xiàn)定量分析，被認為是骨結構分析的“金標準”[16]。Radakovich 等[17]通過micro-CT 檢查發(fā)現(xiàn)，豚鼠KOA 模型患肢髕骨、股骨及脛骨均有骨贅形成，且有軟骨下骨硬化和骨囊腫形成。Ketola 等[16]通過micro-CT 檢查發(fā)現(xiàn)，兔KOA 模型患膝骨體積分數(shù)下降，小梁變薄、數(shù)量減少、分離增加，軟骨下骨板增厚。此外，CT檢查結合造影技術可對KOA 動物模型的軟骨體積和厚度、血管平均直徑和容積進行觀察。CT 檢查密度分辨率高，可發(fā)現(xiàn)骨結構的細微病變，但存在成像時間長，輻射損傷，動物需要麻醉及短時間內(nèi)不能重復等不足[18]。

2.2.3 磁共振成像

磁共振成像（MRI）檢查對組織的分辨率高，已廣泛用于疾病的臨床診斷。在KOA 動物模型中，MRI 檢查可顯示軟骨、半月板、韌帶和滑膜等組織病變，并可對骨結構及軟骨組成物質(zhì)進行量化分析。Sifre 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，兔KOA 模型軟骨及骨的MRI 表現(xiàn)與組織病理學變化有極好的相關性。MRI 檢查不需要通過電離輻射便可生成組織間的對比圖像，無輻射危害，但其不足在于掃描時間長，對微小骨折及鈣化灶缺乏敏感性，使用成本高等。

2.2.4 超聲

超聲檢查可顯示關節(jié)內(nèi)軟組織情況，可用于評估KOA 動物模型的滑膜炎癥、關節(jié)積液和軟骨及半月板損傷等病變。羅春海等[20]通過超聲檢查發(fā)現(xiàn)，狗KOA 模型患肢關節(jié)腔積液增多，滑膜增厚，關節(jié)腔面毛糙不平，膝關節(jié)內(nèi)外髁軟骨厚度變薄。Xu 等[21]通過超聲檢查發(fā)現(xiàn)，小鼠KOA 模型患肢膝關節(jié)空間體積、滑膜炎癥面積百分比和血流量均增加，結果與OARSI 評分密切相關。超聲檢查對軟組織成像清晰，采集時間短，操作方便，無電離輻射，但不能顯示骨組織為其最大不足。

2.2.5 分子影像技術

分子影像技術是將影像技術與分子生物技術相結合而形成的新型技術，涵蓋多個學科內(nèi)容，可在細胞及分子水平檢測生物體內(nèi)的病理變化，以用于疾病發(fā)展機制及藥物療效等方面的研究[22]。除CT、MRI 和超聲等傳統(tǒng)影像技術外，現(xiàn)有分子影像技術有正電子發(fā)射成像、單光子發(fā)射計算機斷層成像、生物發(fā)光成像、熒光成像、光聲成像及光學層析成像等[23-24]。目前，分子影像技術已用于檢測KOA 動物模型中的膠原蛋白、糖胺聚糖及基質(zhì)金屬蛋白酶等多種分子物質(zhì)的動態(tài)變化及骨代謝活性，可用于KOA 早期診斷[25-27]。與傳統(tǒng)病理及影像技術相比，分子影像技術可從分子水平發(fā)現(xiàn)異常，從而在疾病尚未形成解剖及組織改變時早期發(fā)現(xiàn)病變。此外，分子影像技術還可對KOA動物模型病變進行動態(tài)、可持續(xù)且無創(chuàng)的監(jiān)測，但其存在對設備要求高、費用昂貴等不足。

2.3 癥狀評價

KOA 的主要臨床表現(xiàn)包括疼痛及功能障礙。動物模型KOA 發(fā)生發(fā)展時，動物也會出現(xiàn)相應癥狀。因此，評估動物的癥狀可以評價建模效果。

疼痛和功能障礙的評估方法包括靜態(tài)和動態(tài)評估兩類：①靜態(tài)評估，是指對誘發(fā)疼痛的評估，常見方法包括Vonfrey 試驗、哈格里夫斯試驗、冷敏感實驗及膝關節(jié)伸展實驗等。②動態(tài)評估，是指觀察及記錄動物的活動，根據(jù)活動情況評估動物的疼痛及功能障礙程度。常見方法包括自發(fā)活動檢測、運動分析、爪印評估、步態(tài)分析及轉輪跑步運動等[28-30]。Zhang 等[31]通過Vonfrey 試驗和溫度可調(diào)平板系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，大鼠KOA 模型對機械刺激、冷刺激和熱刺激均表現(xiàn)敏感。Alsalem 等[32]通過Vonfrey試驗、靜態(tài)承重儀器和活動檢測系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，大鼠KOA 模型機械縮足反射閾值下降，患肢負重及活動量減少。Williams 等[33]通過Vonfrey 試驗、哈格里夫斯試驗、步態(tài)分析和靜態(tài)肢體負重實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠KOA 模型出現(xiàn)視覺可見的跛行，機械縮足反射閾值下降，熱刺激敏感，站立期減少，擺動期增加，靜態(tài)承重不對稱。此外，采用根據(jù)疼痛反應、步態(tài)、關節(jié)活動范圍及腫脹程度所制定的改良Lequesne MG 量表對KOA 動物模型進行癥狀評價后發(fā)現(xiàn)，評分高低與KOA 嚴重程度相關[34]。癥狀評價可以通過癥狀的嚴重程度判定KOA 動物模型的病變程度，但并不能因此確定KOA 動物模型是否建模成功。

2.4 關節(jié)鏡評價

關節(jié)鏡檢查系采用微創(chuàng)方法發(fā)現(xiàn)關節(jié)腔內(nèi)軟骨、半月板、韌帶和滑膜病變，在臨床上應用廣泛，也可用于KOA 動物模型評價。Bi 等[35]通過關節(jié)鏡檢查發(fā)現(xiàn)，恒河猴KOA 模型患肢股骨內(nèi)側髁軟骨會出現(xiàn)不同程度的磨損缺失。Flynn 等[36]通過關節(jié)鏡檢查發(fā)現(xiàn)，羊KOA 模型患肢會出現(xiàn)不同程度的脛骨平臺和股骨髁軟骨損傷，伴滑膜腫脹。關節(jié)鏡檢查可在活體上對關節(jié)內(nèi)病變持續(xù)監(jiān)測，但因設備及操作要求，僅適用于關節(jié)腔較大的動物。

2.5 生物標志物評價

KOA 病變過程中，軟骨、骨及滑膜組織的多種生物標志物會出現(xiàn)變化。這些物質(zhì)包括炎癥因子、軟骨細胞及細胞外基質(zhì)的代謝前體和產(chǎn)物等，存在于尿液、血液、關節(jié)液及軟骨組織中，可采用聚合酶鏈反應、蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫組織化學等方法進行檢測[5,37-38]。但在KOA 動物模型構建中，大部分生物標志物缺乏特異性，因而不能根據(jù)生物標志物變化確定KOA 動物模型是否建模成功。

3 結語

KOA 動物模型有多種評價方法，包括組織病理學評價、影像學評價、癥狀評價、關節(jié)鏡評價及生物標志物評價。組織病理學評價通過大體觀察和多種組織染色方法可以顯示軟骨退變、滑膜炎癥及骨贅形成等病理變化，并有多種軟骨評分系統(tǒng)，適用于所有動物模型，是應用最廣泛的動物KOA 模型評價方法，尚無任何替代方法，但其不足在于需要處死動物后才能獲取標本，若未能成功建立模型則需要重新建模。X 線、CT、MRI 和超聲等影像技術可通過無創(chuàng)方式對KOA 動物模型進行評價，適用范圍廣，具有可重復性，可動態(tài)觀察KOA 動物模型的病變過程，直至建立模型為止，可避免組織病理學評價可能反復建模的風險，而其缺點在于MRI 和CT 檢查費用昂貴，隨著動物模型專用檢查設備的改進和使用，檢查費用和反復造模的成本已大大降低。癥狀評價通過發(fā)現(xiàn)KOA所引起的疼痛、功能及行為改變，推斷KOA 的嚴重程度，多用于大鼠、小鼠等小型動物，但部分癥狀判斷存在主觀性，故僅作為KOA 動物模型的輔助評價方法。關節(jié)鏡評價沒有普適性，生物標志物評價缺乏特異性，故都只作為KOA 動物模型的輔助評價方法。

目前，無創(chuàng)且簡化的方法是動物模型評價方法的發(fā)展趨勢[39]。高分辨率的CT 及MRI 檢查可成為無創(chuàng)評價的方向，但其步驟需要進一步簡化并標準化。此外，隨著影像技術及分子技術的發(fā)展，高特異性的分子探針及高分辨的圖像獲取及分析技術的產(chǎn)生，分子影像技術應用前景巨大。