曹尚美 鄒真真 陳泊霖 楊少哲 張清偉 王單單 王浩然 付秀虹

基金項目：河南省自然科學(xué)基金（2223000420247）；2023年河南省博士后科研資助項目（312145）；中央引導(dǎo)地方項目（Z20221343023）；河南省重點研發(fā)與推廣專項（212102310813、222102310361）；河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)項目（LHGJ20221031）；漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校科技創(chuàng)新項目（2023ZD18）

第一作者簡介：曹尚美（1987-），女，博士，主治醫(yī)師。研究方向為泌尿內(nèi)科。

*通信作者：付秀虹（1967-），女，主任醫(yī)師，教授。研究方向為女性生殖。

DOI：10.19981/j.CN23-1581/G3.2024.16.002

摘? 要：基因過表達在基礎(chǔ)實驗和基因治療應(yīng)用中都是常用的手段，而質(zhì)粒的擴增在基因過表達過程中是不可或缺的技術(shù)，如何規(guī)范、高效地對質(zhì)粒進行擴增和提取是基因治療應(yīng)用的前提，也是困擾很多基礎(chǔ)研究人員的難題。利用現(xiàn)有的實驗技術(shù)，在降低實驗成本基礎(chǔ)上，建立過表達質(zhì)粒擴增、提取的最優(yōu)方案。首先采用傳統(tǒng)方法制作LB培養(yǎng)基和感受態(tài)細胞，對轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒進行大量擴增培養(yǎng)，之后使用商業(yè)試劑盒對質(zhì)粒進行提取，反復(fù)試驗后對商業(yè)試劑盒質(zhì)粒提取過程進行優(yōu)化，提高效率，最終獲得高純度和濃度的質(zhì)粒溶液。經(jīng)超微量分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳檢測和sanger測序等多種方式檢測驗證后與NCBI數(shù)據(jù)庫中目標(biāo)基因序列一致，提示擴增、提取成功。經(jīng)優(yōu)化后的質(zhì)粒擴增、提取方案標(biāo)準(zhǔn)、高效，成本低廉，是質(zhì)?；蚩寺〉淖罴堰x擇。

關(guān)鍵詞：IGF-1基因；質(zhì)粒克??；基因過表達；質(zhì)粒的擴增；基因治療應(yīng)用

中圖分類號：Q811.4? ? ? 文獻標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? 文章編號：2095-2945（2024）16-0007-05

Abstract： Gene overexpression is a common method in basic experiments and gene therapy applications， and plasmid amplification is an indispensable technique in the process of gene overexpression. How to amplify and extract plasmids standardized and efficiently is the premise of gene therapy application， and it is also a difficult problem for many basic researchers. To establish the optimal scheme of amplification and extraction of overexpression plasmid on the basis of reducing the experimental cost by using the existing experimental technology. Firstly， the LB medium and competent cells were made by traditional method， and the transformed plasmid was amplified and cultured， and then the plasmid was extracted by commercial kit. After repeated experiments， the plasmid extraction process of commercial kit was optimized， the efficiency was improved， and the plasmid solution with high purity and concentration was obtained. The sequence of the target gene was verified by ultramicro spectrophotometer， agarose gel electrophoresis and sanger sequencing， which was consistent with that in NCBI database， indicating that the amplification and extraction were successful. The optimized plasmid amplification and extraction scheme is standard， efficient and low cost， which is the best choice for plasmid gene cloning.

Keywords： IGF-1 gene; plasmid cloning; gene overexpression; plasmid amplification; gene therapy application

胰島素樣生長因子1（Insulin-like growth factor 1，IGF-1）是胰島素樣生長因子（Insulin-like growth factor，IGF）家族成員之一，具有促進細胞生長、分化、血管形成及抗腫瘤的作用，日益受到人們的關(guān)注[1]。IGF-1可與其受體結(jié)合，參與激活磷酸肌醇3激酶（PI3K）信號通路等，并可調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為[2]。IGF-1是一個只有477 bp的基因片段，其編碼的蛋白質(zhì)只有7.8 kDa。它是一種小分子物質(zhì)，其功能類似于生長因子，在促進細胞分化、增殖和個體生長發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用[3]。

IGF-1是調(diào)節(jié)人體生長與發(fā)育的因子[4]。參與了很多疾病的分子信號通路，它可以調(diào)節(jié)卵母細胞質(zhì)量，改善女性生育力水平[5]。IGF-1可以通過介導(dǎo)其他信號通路比如PI3K-AKT通路調(diào)節(jié)心臟功能[6-7]，還可以直接參與腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展[8]，參與機體代謝在糖尿病疾病發(fā)展中發(fā)揮作用[9]。IGF-1基因過表達在很多疾病模型中都有應(yīng)用[10]。本研究立足分子實驗基礎(chǔ)，構(gòu)建IGF-1基因擴增的標(biāo)準(zhǔn)實驗流程，為IGF-1的廣泛應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 主要試劑及儀器

質(zhì)粒PUC57-Kana-IGF-1（ABM21906，上海生工生物），大腸桿菌DH5α（B528411-0001，上海生工生物），50×TAE 緩沖液（T1060，北京索萊寶科技），2×RNA Loading Buffer（R0215，上海碧云天生物），NA-Red核酸染料（D0128，上海碧云天生物），DNA ladder（D0107，上海碧云天生物），超凈工作臺（Thermo Fisher， USA），恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Fisher， USA），低溫搖床Innova40R（Eppendorf，USA），超微量分光光度計（B-500，上海元析儀器）。

1.2? 試劑制備

試劑設(shè)備方法見表1。

1.3? 感受態(tài)細胞制備

①從購買的菌管中挑一個DH5α菌落，轉(zhuǎn)到2 mL不含抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床中過夜。②第二天打開制冰機預(yù)制冰，將2 mL的菌液分裝轉(zhuǎn)到4個50 mL離心管中，劇烈振搖 2～3 h。③制作冰浴桶，取出處于對數(shù)生長期的菌液冰浴10～15 min。④離心（4 ℃，4 000 rpm）10 min，收集細菌，盡可能地棄去培養(yǎng)液。⑤冰浴 30 min，用20 mL無菌預(yù)冷的 0.1 mol/L CaCl2（無甘油）重懸沉淀（置于冰中）。⑥離心（4℃，4 000 rpm）10 min，棄上清，盡可能地棄去培養(yǎng)液。⑦用12 mL CaCl2（含甘油，冰預(yù)冷）重懸沉淀。⑧分裝到滅菌的1.5 mL的EP管中，200 ？滋L/管，-80℃凍存，備用。

1.4? 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與細菌擴增

①從-80 ℃冰箱取1支含有100 μL感受態(tài)細胞，置于冰水混合物中進行解凍，解凍時長3～5 min。②吸取2～3 μL質(zhì)粒（質(zhì)粒濃度稀釋到10 ng/ μL左右），加入解凍后的感受態(tài)細胞中，輕彈離心管混勻，或使用移液器進行多次吹打混勻。③再將離心管置于冰水混合物中10 min。④將上述離心管2/3浸入42 ℃水浴鍋，熱激時長90 s。⑤熱激結(jié)束，離心管冰浴3 min。⑥加入600 μL不含抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床（200 rpm）復(fù)蘇培養(yǎng)45 min。⑦復(fù)蘇結(jié)束，吸取50～100 μL

轉(zhuǎn)化物用無菌槍頭呈田字格狀均勻涂布在含有卡那抗性的LB平板上。⑧將平板倒置放入37℃培養(yǎng)箱進行過夜培養(yǎng)。挑取平板中的單個細菌克隆，放入含有卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床6～8 h進行擴增。

1.5? 質(zhì)粒提取

使用天根質(zhì)粒大提試劑盒（Catalog No.DP117）進行質(zhì)粒提取，根據(jù)說明書進行優(yōu)化步驟。溶液P1在使用前先加入RNase A，混勻，置于2～8℃保存。①向吸附柱CP6中加入2.5 mL的平衡液BL，離心（4℃，4 000 rpm）2 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。取200～400 mL過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管，離心（4℃，4 000 rpm）3 min收集細菌，盡量吸除上清。盡量吸除上清，為確保上清液全部吸取，請用干凈的吸水紙吸去瓶壁上的水滴。向留有菌體沉淀的離心管中加入8 mL溶液P1，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。②向離心管中加入8 mL溶液P2，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，使菌體充分裂解，室溫放置5 min。向離心管中加入8 mL溶液P4，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，充分混勻，至溶液出現(xiàn)白色分散絮狀沉淀。然后室溫放置10 min左右。離心（4 ℃，4 000 rpm）5～10 min，使白色沉淀離至管底，將全部溶液小心倒入過濾器CS1中，慢慢推動推柄過濾，濾液收集在干凈的50 mL的管中。③向濾液中加入0.3倍濾液體積的異丙醇，上下顛倒混勻后轉(zhuǎn)移到吸附柱CP6中。離心（4 ℃，4 000 rpm）2 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP6重新放回收集管中。④向吸附柱CP6中加入10 mL漂洗液PW，離心（4℃，4 000 rpm）2 min，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。⑤重復(fù)操作步驟④。向吸附柱CP6中加入3 mL無水乙醇，離心（4 ℃，4 000 rpm）2 min，倒掉廢液。將吸附柱CP6重新放回收集管中，離心（4 ℃，4 000 rpm）5 min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。⑥將吸附柱CP6置于一個干凈的50 mL收集管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加1～2 mL洗脫緩沖液TB，室溫放置5 min，然后離心（4℃，4 000 rpm）2 min。⑦重復(fù)步驟⑥，每1 mL洗脫液加入1.42 mL異丙醇以及0.42 mL 5 mol/L NaCl，混勻，室溫放置5 min，離心（4 ℃，4 000 rpm）10 min，小心棄上清。⑧加入0.5 mL的70％乙醇洗滌沉淀，離心（4 ℃，4 000 rpm）5 min，小心棄乙醇。

重復(fù)操作步驟8。空氣中干燥沉淀約5～10 min，根據(jù)需要用適當(dāng)體積的TB緩沖液溶解沉淀。洗脫緩沖液體積不少于1 mL，體積過小影響回收效率。將提取好的質(zhì)粒分裝于100 μL的離心管中，保存于-20 ℃冰箱。

1.6? 質(zhì)粒DNA濃度及純度檢測

1.6.1? 超微量分光光度計檢測質(zhì)粒的濃度與純度

開機后選擇檢測核酸，使用前用蒸餾水清洗再次清洗，吸取2 μL蒸餾水作為空白調(diào)零，擦去蒸餾水。取2 μL提取的質(zhì)粒DNA，測量濃度和純度。

1.6.2? 瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度及完整性

①將清潔干燥的塑料托盤放入配膠板，置于水平面上。②配制足量的電泳緩沖液（1×TAE）用以灌滿電泳槽和配制凝膠。輕輕地旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液。③配制0.8%的瓊脂糖凝膠（0.24 g瓊脂糖粉末加入1×TAE 30 mL）微波爐加熱2 min沸騰，降溫到50℃左右時加入DD核酸染料1.5 μL。瓊脂糖溶液正在冷卻時，用一個合適的梳子形成加樣孔。梳齒的位置應(yīng)在托盤底面上0.5～1.0 mm，這樣瓊脂糖澆灌到托盤時將形成符合要求的加樣孔。④澆灌溫?zé)岬沫傊侨芤哼M入模具，室溫下放置30～45 min，待凝膠溶液完全凝結(jié)，小心拔出梳子。⑤將凝膠安放在電泳槽內(nèi)，向電泳槽加入電泳緩沖液，剛好沒過凝膠約1 mm。⑥混合DNA樣品和一定比例的載樣緩沖液。DNA 5 μL+1 μL RNA lodding buffer，DNA ladder 5 μL作為對照。原始質(zhì)粒和提取質(zhì)粒均進行10倍稀釋。⑦關(guān)上電泳槽蓋，接好電極插頭。給予120 V，30 min條件下電泳，其中距離以陽極至陰極之間的測量為準(zhǔn)。⑧當(dāng)DNA樣品或染料在凝膠中遷移了足夠距離時，關(guān)上電源、拔出電極插頭和打開電泳槽蓋，用紫外燈在302 nm處觀察凝膠和拍照。

1.6.3? 對提取的質(zhì)粒進行sanger測序

測序引物使用puc57-R（TAGCTCACTCATTAGGCAC）。

2? 結(jié)果

2.1? 超微量分光光度計檢測

OD260/OD280的比值為1.9，濃度為268.30 ng/μL。

2.2? 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，原始質(zhì)粒和提取質(zhì)粒電泳后位置一致。

（a）? 電泳圖? ? ? ? ? ?（b）? Maker

圖1? 瓊脂糖凝膠電泳

2.3? Sanger測序結(jié)果

測序結(jié)果如圖2所示，測序序列與NCBI中IGF1基因序列一致。

IGF1基因序列（下載于NCBI）

ATGGGAAAAATCAGCAGTCTTCCAACCCAATTATTTA

AGTGCTGCTTTTGTGATTTCTTGAAGGTGAAGATGCA

CACCATGTCCTCCTCGCATCTCTTCTACCTGGCGCTGT

GCCTGCTCACCTTCACCAGCTCTGCCACGGCTGGACC

GGAGACGCTCTGCGGGGCTGAGCTGGTGGATGCTCTT

CAGTTCGTGTGTGGAGACAGGGGCTTTTATTTCAACA

AGCCCACAGGGTATGGCTCCAGCAGTCGGAGGGCGC

CTCAGACAGGCATCGTGGATGAGTGCTGCTTCCGGA

GCTGTGATCTAAGGAGGCTGGAGATGTATTGCGCAC

CCCTCAAGCCTGCCAAGTCAGCTCGCTCTGTCCGTGC

CCAGCGCCACACCGACATGCCCAAGACCCAGAAGTA

TCAGCCCCCATCTACCAACAAGAACACGAAGTCTCA

GAGAAGGAAAGGAAGTACATTTGAAGAACGCAAGT

AG。

經(jīng)過檢測，此次提取的質(zhì)粒符合使用標(biāo)準(zhǔn)。后續(xù)可直接應(yīng)用于細胞轉(zhuǎn)染甚至動物體內(nèi)實驗等對DNA純度要求很高的實驗中。

3? 討論

基因過表達在基礎(chǔ)實驗和基因治療應(yīng)用中都是常用的手段，而質(zhì)粒的擴增在基因過表達過程中是不可或缺的技術(shù)[11]，如何規(guī)范、高效地對質(zhì)粒進行擴增和提取是應(yīng)用的前提，也是困擾很多基礎(chǔ)研究人員的難題[12]。本實驗中建立了一個質(zhì)粒進行擴增和提取的最新標(biāo)準(zhǔn)，使用了最新的試劑和技術(shù)，反復(fù)試驗后優(yōu)化了質(zhì)粒擴增、提取的步驟，制定了標(biāo)準(zhǔn)的實驗流程，提高了常規(guī)質(zhì)粒擴增、提取的效率，實驗時間大大縮短，且降低了實驗成本，為質(zhì)粒在基因過表達中的廣泛應(yīng)用打下了堅實的基礎(chǔ)。

大部分文獻的實驗流程不夠詳細，容易造成實驗的失敗，反復(fù)實驗造成資源浪費。經(jīng)過本實驗的多次調(diào)試，總結(jié)出一套詳實的實驗過程，極大減小了實驗失敗的可能性。前期經(jīng)過文獻檢索發(fā)現(xiàn)，有的基因過表達實驗成本較高，比如CRISPR-Cas9技術(shù)[13]，給后續(xù)實驗造成經(jīng)費上的負擔(dān)。有的基因克隆實驗時間較長，實驗流程復(fù)雜，不利于推廣和普及，比如文獻[14]中介紹的方法。而本研究中使用的方法可以大大降低后續(xù)配制試劑的時間，提高實驗效率。另外一種擴增質(zhì)粒的方法是利用病毒擴增[15]的方式，雖然其后續(xù)實驗轉(zhuǎn)染效率可能更高，但是相較于細菌擴增不僅成本更高，風(fēng)險也更大。質(zhì)粒提取的商業(yè)試劑盒中實驗條件過于籠統(tǒng)，需要反復(fù)試驗才能找到最佳實驗條件，經(jīng)過優(yōu)化后的實驗流程可重復(fù)性高，實驗條件較穩(wěn)定，得到的質(zhì)粒質(zhì)量較高，提高了實驗成功率。綜上所述，本實驗采用的質(zhì)粒擴增和提取方式成本更低、獲取效率更高，又可以保證后續(xù)實驗效果，是基因克隆一種較好的選擇。

本實驗以IGF-1質(zhì)粒為例，以較低的價格購進微量的質(zhì)粒母液，利用公司成功的商業(yè)質(zhì)粒為模板，對質(zhì)粒進行擴增和提取，并對提取質(zhì)粒的商業(yè)試劑盒中實驗條件進行優(yōu)化，整個過程不超過48 h。經(jīng)過檢測和驗證后提取的質(zhì)粒質(zhì)量純度、濃度均達到標(biāo)準(zhǔn)，對質(zhì)粒母液的擴增倍數(shù)達到了指數(shù)級。建立了重復(fù)性和成功率高的實驗標(biāo)準(zhǔn)流程，為其他類似的基因克隆實驗提供了有價值的參考，也為基因治療的應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)，具有很高的科研價值和現(xiàn)實意義。

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