陳椿 王可欣 賀夢(mèng)雯 李樂(lè) 王春艷 劉妍 紀(jì)冬

摘要： 目的 探討減數(shù)分裂內(nèi)切酶1 （EME1） 在肝癌組織中的表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法 篩選TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)肝癌樣本中的差異表達(dá)基因。采用免疫組化和Western Blot分析EME1在肝癌組織中的表達(dá)豐度。通過(guò)短發(fā)夾RNA（shRNA） 構(gòu)建慢病毒并感染BEL-7404細(xì)胞干擾EME1基因表達(dá)， 分為沉默組 （shEME1） 和對(duì)照組 （shCtrl）。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Western Blot檢測(cè)兩組EME1 mRNA和蛋白表達(dá)水平， Celigo計(jì)數(shù)法及MTT活性檢測(cè)細(xì)胞增殖率， 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期， Caspase3/7活性檢測(cè)細(xì)胞凋亡。兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。結(jié)果 TCGA結(jié)果顯示EME1的mRNA表達(dá)水平在肝癌組織中是癌旁組織的18. 9倍 （114. 5±153. 0 vs 8. 0±7. 2， t=5. 00， P<0. 001）； EME1的蛋白表達(dá)水平在肝癌組織中是癌旁組織的7. 0倍（免疫組化檢測(cè)， 8. 4±2. 6 vs 1. 2±0. 4， t=7. 55， P<0. 001）和2. 5倍（Western Blot檢測(cè)， 249. 0%±35. 5% vs 100. 0%±77. 8%， t=3. 02， P<0. 05）。慢病毒感染后， 相對(duì)于對(duì)照組， 沉默組EME1的mRNA表達(dá)水平下降了29. 9%（29. 9%± 0. 9% vs 100. 0%±3. 6%， t=32. 82， P<0. 001）， 蛋白表達(dá)水平顯著下降了35. 7% （35. 7%±14. 9% vs 100. 0%±28. 9%， t=3. 42， P<0. 05）； 細(xì)胞計(jì)數(shù)下降了45. 1% （4 053±167 vs 8 988±477， t=16. 91， P<0. 001）、 細(xì)胞活性下降至66. 9% （0. 518±0. 046 vs 0. 774±0. 022， t=8. 74， P<0. 001） 及細(xì)胞克隆形成能力下降至29. 0% （75±6 vs 260±9， t=28. 92， P<0. 001）。與對(duì)照組比較， 沉默組G1期細(xì)胞 （49. 9% vs 44. 0%， t=8. 96， P<0. 001） 比例增多， G2/M期 （15. 9% vs 17. 9%， t=9. 13， P<0. 001） 與S期 （34. 2% vs 38. 1%，t=6. 91， P<0. 001）的細(xì)胞比例減少； Caspase3/7活性增強(qiáng)了1. 5倍（145. 8%±5. 9% vs 100. 0%±2. 3%， t=12. 50， P<0. 001）。結(jié)論 EME1在肝癌組織中高表達(dá)， 沉默EME1基因可抑制肝癌細(xì)胞增殖， 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞： ?癌， ?肝細(xì)胞； ?減數(shù)分裂內(nèi)切酶1； ?RNA， ?小分子干擾； ?細(xì)胞增殖

基金項(xiàng)目： ?北京市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 （7222173）

Silencing essential meiotic endonuclease ?1 inhibits the proliferation of liver cancer cells： A study of?related mechanisms

CHEN Chun1， WANG Kexin2， 3， HE Mengwen2， 4， LI Le5， WANG Chunyan2， LIU Yan5， JI Dong1， 2， 3， 4. （1. The Second Clinical Medical School of Southern Medical University， Guangzhou 510515， China； 2. Senior Department of Hepatology， The Fifth Medical Center of Chinese PLA General Hospital， Beijing 100039， China； 3. PLA 307 Medical College of Anhui Medical University， Hefei 230032， China；4. Peking University 302 Clinical Medical School， Beijing 100191， China；5. Senior Department of Infectious Diseases， The Fifth Medical Center of Chinese PLA General Hospital， Beijing 100039， China）

Corresponding authors： ?JI Dong， ?jidg302@126.com ?（ORCID： ?0000-0001-8214-462X）； ?LIU Yan， ?liuyan5360@163.com ?（ORCID： ?0000-0003-1498-4314）

Abstract： ?Objective To investigate the expression of essential meiotic endonuclease ?1 （EME1） ?in liver cancer tissue and its?effect on the biological behavior of hepatoma cells. Methods The TCGA database was used to identify the differentially expressed genes between liver cancer tissue and paracancerous tissue. Immunohistochemistry and Western Blot were used to measure the expression abundance of EME1 in liver cancer tissue. A lentivirus was constructed by short hairpin RNA， and BEL-7404 cells were transfected with the lentivirus to interfere with the expression of the EME1 gene； the cells were divided into silencing group （shEME1 group） and control group （shCtrl group） . Quantitative real-time PCR and Western Blot were used to measure the mRNA and protein expression levels of EME1； Celigo Image Cytometer and MTT assay were used to measure cell proliferation rate； flow cytometry was used to observe cell cycle； Caspase 3/7 activity was used to measure cell apoptosis. The independent-samples t-test was used for comparison between two groups. Results TCGA results showed that the mRNA expression level of EME1 in liver cancer tissue was 18.9 times that in paracancerous tissue （t=5.00， P<0.001）， and the protein expression level of EME1 in liver cancer tissue was 7.0 times （based on immunohistochemistry： 8.4±2.6 vs 1.2±0.4， t=7.55， P<0.001） or 2.5 times （based on Western Blot： 249.0%±35.5% vs 100.0%±77.8%， t=3.02， P<0.05） that in paracancerous tissue. After lentivirus infection， compared with the shCtrl group， the shEME1 group had an mRNA expression level of EME1 reduced by 29.9% （29.9%±0.9% vs 100.0%±3.6%，

t=32.82， P<0.001）， a protein expression level of EME1 reduced by 35.7% （35.7%±14.9% vs 100.0%±28.9%， t=3.42， P<0.05）， and a level of cell counting reduced by 45.1% （4 053±167 vs 8 988±477， t=16.91， P<0.001）， as well as a level of cell activity reduced to 66.9% （0.518±0.046 vs 0.774±0.022， t=8.74， P<0.001） and a level of colony forming ability reduced to 29.0% （75±6 vs 260±9， t=28.92， P<0.001） . Compared with the shCtrl group， the shEME1 group had a significant increase in the proportion of cells in G1 phase （49.9% vs 44.0%， t=8.96， P<0.001） and significant reductions in the proportion of cells in G2/M phase （15.9% vs 17.9%， t=9.13， P<0.001） and S phase （34.2% vs 38.1%， t=6.91， P<0.001）， while Caspase 3/7 activity was enhanced by 1.5 times （145.8%±5.9% vs 100.0%±2.3%，t=12.50， P<0.001） . Conclusion EME1 is highly expressed in liver cancer tissue， and silencing the EME1 gene can inhibit the proliferation of hepatoma cells and promote cell apoptosis.

Key words： Carcinoma， Hepatocellular； Essential Meiotic Endonuclease 1； RNA， Small Interfering； Cell Proliferation

Research funding： Beijing Municipal National Science Foundation （7222173）

肝細(xì)胞癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大常見(jiàn)原因，對(duì)于晚期肝癌患者， 靶向治療的效果仍不能滿足臨床需求［1-5］ ， 尋找新的基因靶點(diǎn)可進(jìn)一步提升療效及安全性，成為目前肝癌治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。減數(shù)分裂內(nèi)切酶1（essential meiotic endonuclease 1， EME1） 編碼的蛋白質(zhì)可與MUS81形成核酸內(nèi)切酶復(fù)合物， 作用于特定的DNA底物， 包括Holiday連接、 3′ 末端翹翼結(jié)構(gòu)以及復(fù)制叉結(jié)構(gòu)， 在DNA鏈間交聯(lián)、 DNA雙鏈斷裂后修復(fù)過(guò)程中對(duì)重組中間產(chǎn)物的分解發(fā)揮著關(guān)鍵作用［6］ 。既往研究［7-9］ 發(fā)現(xiàn)， EME1高表達(dá)是膀胱癌、 乳腺癌及腎透明細(xì)胞癌不良預(yù)后的高危因素， 但其在肝癌中的表達(dá)和作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)入手， 通過(guò)生物信息學(xué)尋找肝癌組織中的高表達(dá)基因EME1， 并在肝癌組織/癌旁組織中進(jìn)行驗(yàn)證， 通過(guò)基因沉默探討EME1對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響， 以期鑒定新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1. 1 材料 人肝癌細(xì)胞BEL-7404/7402、 Hep3B及人胚腎細(xì)胞293T均為本單位感染病研究所保存。慢病毒載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司。鼠源EME1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司， HRP標(biāo)記山羊抗小鼠的二抗檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司。HiScript Ⅲ All-in one RT、 SuperMix Perfect for qPCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑和 Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊公司。RPMI 1640和MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Corning公司， 胎牛血清 （FBS） 購(gòu)自美國(guó)Geniala公司， 四甲基偶氮唑鹽 （MTT）購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛公司， Caspase-Glo? 3/7 Assay試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司， 碘化丙啶 （PI） 購(gòu)自吉至生化公司。

1. 2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析 下載TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中肝細(xì)胞癌樣本的mRNA seq表達(dá)譜， 利用R軟件中的 “edge” 包篩選癌及癌旁組織中高表達(dá)基因。

1. 3 細(xì)胞培養(yǎng) BEL-7404/7402細(xì)胞在含10%FBS的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液、 Hep3B細(xì)胞在含10%FBS的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液中37 ℃、 5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞傳代使用0. 25%胰蛋白酶消化， 按照1∶3比例傳代。

1. 4 免疫組化染色 石蠟切片經(jīng)脫蠟、 水化、 抗原修復(fù)后， FBS封閉后加入EME1一抗， 4 ℃孵育過(guò)夜， 加入二抗37 ℃孵育20 min， DAB顯色， 蘇木精復(fù)染， 中性樹(shù)膠封片， 鏡檢評(píng)分。染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析， 以染色強(qiáng)度評(píng)分 ［陰性為0分， 淡黃色 （弱陽(yáng)性） 為1分， 棕黃色 （陽(yáng)性） 為2分， 棕褐色 （強(qiáng)陽(yáng)性） 為3分］ 和陽(yáng)性細(xì)胞范圍評(píng)分［≤25% 為 1 分， 26%～50% 計(jì)為 2 分， 51%～75% 為3分， >75%為4分］ 乘積作為最終結(jié)果。

1. 5 EME1沉默慢病毒載體的構(gòu)建 EME1 短發(fā)夾RN（shRNA） 干擾序列為CTGAGAAGACAGGAAAGAA， 兩端分別添加AgeI （A^CCGGT） 和EcoRI （G^AATTC） 酶切位點(diǎn)黏性末端， 并在正鏈3′ 端添加終止信號(hào) （TTTTT）， 反鏈5端添加終止信號(hào)互補(bǔ)序列 （AAAAA）， 合成DNA Oligo。雙酶切hU6-MCS-CMV-EGFP慢病毒載體使其線性化， 將DNA Oligo與載體質(zhì)粒相連后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞， 之后PCR擴(kuò)增及測(cè)序鑒定 （表1）。提取鑒定正確的質(zhì)粒， 利用第二代慢病毒包裝系統(tǒng)， 穿梭質(zhì)粒GV115、 包裝質(zhì)粒psPAX2、 包膜質(zhì)粒pMD2. G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞， 轉(zhuǎn)染后48 進(jìn)行病毒收獲， 濃縮與純化慢病毒。

1. 6 EME1沉默慢病毒感染BEL-7404細(xì)胞 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEL-7404細(xì)胞接種于6孔板 （2×105個(gè)/孔）， 培養(yǎng)至鋪板量達(dá)30%后分別加入shRNA干擾表達(dá)慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒， 感染12 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。感染72 h后， 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞感染效率。以GADPH為內(nèi)參照， 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-qPCR） 檢測(cè) （表2） ， 2?△△Ct法計(jì)算EME1相對(duì)表達(dá)量。

1. 7 Western Blot檢測(cè) 制備樣品， 每孔上樣量為30 ?g，10%的SDS-PAGE電泳分離， 并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上， 室溫封閉1 h， 一抗 （1∶800） 4 ℃孵育過(guò)夜， TBST洗膜。二抗（1∶5 000） 室溫孵育1 h， TBST洗膜?；瘜W(xué)發(fā)光法 （ECL法） 檢測(cè)條帶， 以GAPDH為內(nèi)參照， 用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1. 8 Celigo與MTT檢測(cè) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板 （2×103個(gè)/孔）， 每天用Celigo檢測(cè)讀板。另設(shè)置一組進(jìn)行MTT檢測(cè)， 培養(yǎng)終止前4 h加入5 mg/mL的MTT溶液20 ?L， 繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸取培養(yǎng)液， 每孔加入100 ?L二甲基亞砜， 振蕩器振蕩2 min， 檢測(cè)490 nm處的吸光值。

1. 9 細(xì)胞克隆形成能力檢測(cè) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板 （800個(gè)/孔）， 持續(xù)培養(yǎng)10 d后使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min， PBS洗滌后加入500 ?L/孔吉姆薩染液（10 min）， ddH2O洗滌細(xì)胞， 晾干后拍照并克隆計(jì)數(shù)。

1. 10 Caspase3/7檢測(cè) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板（1×104個(gè)/孔）， Caspase-Glo3/7緩沖液10 mL溶解Caspase-Glo3/7 凍干粉， 每孔加入 Caspase-Glo 反應(yīng)液 100 ?L，500 r/min離心30 min， 室溫孵育2 h后使用酶標(biāo)儀測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度。

1. 11 PI-FACS-周期檢測(cè) 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞， 用4 ℃預(yù)冷的D-Hanks洗滌細(xì)胞并沉淀， 用4 ℃預(yù)冷的75%乙醇固定細(xì)胞1 h。1 300 r/min離心5 min， 去固定液， 用4 ℃預(yù)冷的D-Hanks洗滌細(xì)胞沉淀1次。加入1 mL的細(xì)胞染色液重懸， 上機(jī)檢測(cè)。

1. 12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用R語(yǔ)言軟件4. 2. 1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 每個(gè)實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔， 數(shù)據(jù)以x ˉ±s表示， 兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。P<0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 人肝癌細(xì)胞中EME1 mRNA表達(dá)水平 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出50對(duì)肝癌樣本， EME1 mRNA在肝癌組織（114. 5±153. 0） 的表達(dá)量是癌旁組織 （8. 0±7. 2） 的18. 9倍 （t=5. 00， P<0. 001）（圖1a）。RT-qPCR結(jié)果顯示， 人肝癌細(xì)胞BEL-7404/7402和Hep3B中EME1 mRNA相對(duì)表達(dá)量 （ΔCT值） 分別為9. 25、 10. 32和10. 89， 均<12， 為高豐度表達(dá) （圖1b）。

2. 2 人肝癌細(xì)胞中EME1的蛋白表達(dá)水平 選取病理確診的3例肝癌患者的手術(shù)切除癌/癌旁組織進(jìn)行Western Blot分析， 結(jié)果顯示肝癌組織EME1蛋白水平 （249. 0%± 35. 5%） 是癌旁組織 （100. 0%±77. 8%） 的2. 5倍 （t=3. 02，P<0. 05）（圖2a、 b）。選取病理確診的5例肝癌患者的手術(shù)切除肝癌組織/癌旁組織進(jìn)行免疫組化分析， 結(jié)果顯示肝癌組織EME1蛋白水平 （8. 4±2. 6） 是癌旁組織 （1. 2±0. 4） 的7. 0倍 （t=7. 55， P<0. 001）（圖2c、 d）。

2. 3 EME1穩(wěn)定沉默BEL-7404細(xì)胞系的構(gòu)建 熒光倒置相差顯微鏡觀察慢病毒感染72 h后的BEL-7404細(xì)胞，結(jié)果顯示感染效率達(dá)到80%以上， 細(xì)胞狀態(tài)正常 （圖3）。RT-qPCR結(jié)果顯示， 沉默組 （shEME1） EME1 mRNA表達(dá)水平 （29. 9%±0. 9%） 相較于陰性對(duì)照組 （shCtrl）（100. 0%± 3. 6%） 顯著降低 （t=32. 82， P<0. 001）（圖4a）； Western Blot結(jié)果顯示， shEME1組EME1蛋白表達(dá)水平 （35. 7%±14. 9%）相較于shCtrl組 （100. 0%±28. 9%） 顯著降低 （t=3. 42， P<0. 05）（圖4b）， 表明EME1穩(wěn)定沉默的肝癌細(xì)胞株BEL-7404構(gòu)建成功。

2. 4 EME1沉默后BEL-7404細(xì)胞增殖能力的變化 Celigo觀察培養(yǎng)1～5天的BEL-7404細(xì)胞， 結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)， 相對(duì)于對(duì)照組， 沉默組細(xì)胞數(shù)量顯著下降， 培養(yǎng)5天時(shí)沉默組為4 053±167， 對(duì)照組為8 988±477， 細(xì)胞數(shù)量下降了45. 1% （t=16. 91， P<0. 001）（圖5a、 b）。MTT檢測(cè)培養(yǎng)1～5天的BEL-7404細(xì)胞在490 nm處的吸光值，相對(duì)于對(duì)照組， 沉默組細(xì)胞吸光值顯著下降， 培養(yǎng)5天時(shí)沉默組為0. 518±0. 046， 對(duì)照組為0. 774±0. 022， 細(xì)胞活性下降了66. 9% （t=8. 74， P<0. 001）（5c）。培養(yǎng)10天后，沉默組克隆數(shù) （75±6） 較對(duì)照組 （260±9） 顯著減少， 細(xì)胞克隆形成能力下降了29. 0% （t=28. 92， P<0. 001）（圖5d、e）。表明沉默EME1降低BEL-7404細(xì)胞的增殖能力。

2. 5 EME1沉默后BEL-7404細(xì)胞周期變化 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢病毒感染5天后的BEL-7404細(xì)胞周期， 沉默組的G1期細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組 （49. 9%±0. 8% vs 44. 0%±0. 9%， t=8. 96， P<0. 001）， G2/M期細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組（15. 9%±0. 2% vs 17. 9%±0. 7%， t=9. 13， P<0. 001）， S期細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組 （34. 2%±0. 6% vs 38. 1%±0. 5%， t=6. 91， P<0. 001）（圖6）。

2. 6 EME1沉默后的BEL-7404細(xì)胞凋亡的變化 Caspase3/7活性分析顯示感染shRNA慢病毒5天后， 沉默組細(xì)胞的Caspase3/7 活性（145. 8%±5. 9%）較對(duì)照組組（100. 0%± 2. 3%） 顯著升高1. 5倍 （t=12. 50， P<0. 001）（圖7） 。

3 討論

EME1對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 DNA 代謝的各個(gè)方面都很重要， Guo等［10］研究發(fā)現(xiàn)EME1與胃癌細(xì)胞AGS和MGC-803的增殖及侵襲能力密切相關(guān)， 沉默EME1基因表達(dá)可通過(guò)抑制蛋白激酶B活化， 降低糖原合酶激酶-3β、 細(xì)胞周期蛋白D1， 從而抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲， 促進(jìn)細(xì)胞凋亡?；谥袊?guó)廣西人群的研究［11］ 發(fā)現(xiàn)EME1的Glu69Asp錯(cuò)義多態(tài)性與肝癌風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)。EME1的另一外顯子Ile350Thr變異會(huì)提高乳腺癌的易感性［12］ 。

本研究發(fā)現(xiàn)沉默EME1的表達(dá)可降低肝癌的增殖能力。正常細(xì)胞中同源重組 （homologous recombination， HR）相關(guān)蛋白受到高度的調(diào)控， 對(duì)DNA序列具有相當(dāng)高的特異性， 一旦失調(diào)就會(huì)導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性。MUS81/EME1在異常的時(shí)間節(jié)點(diǎn)被激活， 可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯、 DNA向子細(xì)胞的不對(duì)稱(chēng)分布以及非整倍體。相反，過(guò)早的磷酸化會(huì)刺激Holiday連接交叉。HR途徑的過(guò)表達(dá)可能引起DNA重排， 導(dǎo)致癌基因活化或者抑癌基因的雜合性的缺失［13］ 。HR介導(dǎo)基因表型的持續(xù)變化為腫瘤細(xì)胞提供生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)， 惡性表型的不斷發(fā)展以及耐藥性的產(chǎn)生。有研究［14］ 發(fā)現(xiàn)， 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞和患者樣本中的HR酶活性升高密切相關(guān)， 抑制HR活性可顯著減少新基因表型的產(chǎn)生， 上調(diào)HR活性會(huì)增加基因突變的數(shù)量。持續(xù)獲得HR介導(dǎo)的新基因， 可能會(huì)導(dǎo)致癌基因的激活， 促進(jìn)腫瘤或耐藥表型的獲得。筆者推測(cè)高表達(dá)水平的EME1蛋白可能通過(guò)催化DNA-RNA雜交的形成導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定， 或通過(guò)促成同源性驅(qū)動(dòng)的易出錯(cuò)過(guò)程 （如單鏈退火、 復(fù)制模板切換和非等位HR） 來(lái)促進(jìn)突變。

結(jié)果表明， 沉默EME1表達(dá)后Caspase3/7活性顯著增高， 有效促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡主要由Caspase家族蛋白酶執(zhí)行， Caspase3/7負(fù)責(zé)對(duì)特定的細(xì)胞底物進(jìn)行關(guān)鍵的切割， 導(dǎo)致最終的凋亡細(xì)胞死亡。癌前病變的DNA損傷可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)清除潛在的有害細(xì)胞從而阻斷腫瘤生長(zhǎng)。這一死亡過(guò)程的失控與異常的細(xì)胞增殖、 腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)， 細(xì)胞凋亡的失調(diào)被認(rèn)為是癌癥的標(biāo)志之一［15］ 。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)沉默EME1表達(dá)后G1期細(xì)胞比例高于shCtrl組， 表明抑制EME1表達(dá)能有效阻滯細(xì)胞周期， 抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。EME1雖然在G2/M期活性受到嚴(yán)格的調(diào)控， 但其在細(xì)胞全周期中都能檢測(cè)到。有研究［16］ 證明有絲分裂中Cdk1活性的失調(diào)， 會(huì)過(guò)早激活MUS81/EME1的有絲分裂同源重組，可能會(huì)誘導(dǎo)DNA損傷應(yīng)答缺陷相關(guān)的細(xì)胞周期改變。

蛋白激酶2 （CK2） 通過(guò)磷酸化調(diào)控MUS81/EME1復(fù)合物的活性， 從而在有絲分裂和DNA復(fù)制應(yīng)激后發(fā)揮不同的功能。在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中， CK2通過(guò)磷酸化MUS81/EME1增強(qiáng)其活性， 有助于維持基因組的穩(wěn)定性。但在細(xì)胞受到DNA復(fù)制應(yīng)激后， CK2過(guò)度活化MUS81/EME1復(fù)合物會(huì)導(dǎo)致DNA損傷和染色體不穩(wěn)定性［17］。事實(shí)上， 已經(jīng)在許多腫瘤中發(fā)現(xiàn)CK2過(guò)表達(dá)［18-19］ ， 因此可以推測(cè)CK2可通過(guò)提高M(jìn)US81/EME1的生物學(xué)功能， 促進(jìn)人類(lèi)基因組的不穩(wěn)定性， 還需要進(jìn)一步研究確定肝癌中CK2的表達(dá)水平與MUS81/EME1的關(guān)系。在檢查點(diǎn)激酶缺陷1的細(xì)胞中， 由于核苷酸的缺乏不足以維持有絲分裂期DNA合成， MUS81/EME1復(fù)合物切割有絲分裂期間合成的新生DNA［20］ 。這種機(jī)制并不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡， 而是造成子細(xì)胞遺傳了受損的DNA， MUS81/EME1復(fù)合物對(duì)晚期復(fù)制產(chǎn)物的異常處理會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定。在FIBP敲低的肺腺癌中， EME1的過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了其對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用［21］ 。該研究結(jié)果顯示，EME1的過(guò)表達(dá)顯著減少了 γ-H2AX 病灶形成， 表明EME1 參與肺腺癌細(xì)胞增殖和放射耐藥性。FIBP 與STAT3互作通過(guò)增強(qiáng)其磷酸化從而提高轉(zhuǎn)錄活性， 并誘導(dǎo)靶基因EME1的表達(dá)。外源性STAT3的過(guò)表達(dá)也提高了FIBP缺陷肺腺癌細(xì)胞中的EME1表達(dá)水平， 這一結(jié)果在另一項(xiàng)研究［22］ 中也得到證實(shí)。此外， 腫瘤細(xì)胞中的某些特異性的細(xì)胞因子常通過(guò)結(jié)合EME1的啟動(dòng)子上調(diào)其表達(dá)。

綜上， EME1在肝癌組織中高表達(dá)， 并在細(xì)胞功能學(xué)層面證明了沉默EME1基因可抑制肝癌細(xì)胞的增殖， 阻滯細(xì)胞周期， 誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡， 為臨床治療提供了新思路。此外本研究對(duì)EME1在肝癌中發(fā)生發(fā)展限于細(xì)胞的功能性實(shí)驗(yàn)， 后續(xù)還需對(duì)動(dòng)物模型和分子機(jī)制進(jìn)行下一步的探索。

倫理學(xué)聲明： 本研究于2020年7月14日通過(guò)解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)審批， 批號(hào)： 2020055D。

利益沖突聲明： 本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明： 紀(jì)冬負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)及擬定寫(xiě)作思路； 陳椿、 王可欣、 賀夢(mèng)雯進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究及撰寫(xiě)論文； 王春艷、劉妍、 紀(jì)冬指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。

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收稿日期：2023-10-11； 錄用日期：2023-12-11

本文編輯：王瑩