祁 艷 綜述,張臻昊,劉 玉,劉欣夢,陳娜娜,勞可靜 審校

(西安醫(yī)學院/基礎與轉化醫(yī)學研究所,陜西 西安 710000)

阿爾茨海默病(AD)是一種起病隱匿、病理復雜的神經(jīng)退行性疾病,臨床特征包括不可逆腦損傷、認知障礙、日常生活自理能力下降,最終可發(fā)展為癡呆和死亡。據(jù)統(tǒng)計,AD已發(fā)展為最常見的癡呆和世界范圍內(nèi)老年人殘疾增加的主要原因[1]。目前,AD臨床診斷主要依靠影像學技術結合認知測試[2-3],通常確診時已發(fā)展到中晚期。雖然AD尚無有效的治療方法,但早期診斷和干預仍有利于減少神經(jīng)損傷,延緩病情進展,從而提高患者的生活質(zhì)量。

AD患者的病理學特征主要為β淀粉樣蛋白(Aβ)在大腦中細胞外沉積形成老年斑,Tau蛋白的過度磷酸化造成腦神經(jīng)細胞內(nèi)的神經(jīng)元纖維纏結[4-5]。在AD極早期,腦脊液(CSF)中某些蛋白標志物Aβ40、Aβ42、總Tau蛋白(T-tau)、過度磷酸化Tau蛋白(P-tau)等水平會發(fā)生改變[6]。然而,臨床上為了實現(xiàn)CSF中標志物的檢測,常需要通過腰椎穿刺獲取CSF。但該方式為有創(chuàng)操作,對患者傷害較大,且價格昂貴,患者可接受度有限,不利于AD的早期診斷。MONTAGNE等[7]研究發(fā)現(xiàn),AD患者血腦屏障存在損傷,導致CSF中某些蛋白標志物能夠在疾病早期穿越血腦屏障,進入外周血循環(huán),從而使得血液蛋白標志物水平在發(fā)病極早期就發(fā)生很明顯變化。因此,外周血中AD蛋白標志物的無創(chuàng)檢測技術因樣本采集方便、創(chuàng)傷小,成為最具潛力的早期篩查和隨診手段,為AD早期診斷帶來了新希望[8]。然而AD蛋白標志物在外周血中水平極低,傳統(tǒng)免疫分析方法無法實現(xiàn)其水平的精準定量分析。近年來發(fā)展的一些免疫分析新技術,其靈敏度大大提高,被廣泛應用于超微量蛋白標志物的分析[9-11]。本文對AD早期外周血生物標志物及其檢測技術的研究進展進行了綜述。

1 外周血中AD相關生物標志物

1.1Aβ Aβ由淀粉樣前體蛋白經(jīng)過β-分泌酶和γ-分泌酶連續(xù)裂解形成,最常見的是包含40個氨基酸的Aβ40與42個氨基酸的Aβ42[12]。在健康人腦組織中,Aβ的生成與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài);在AD患者腦組織中,Aβ表達水平過量,清除作用減弱,導致其在細胞膜外逐漸沉積形成老年斑,對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用,使得神經(jīng)元變性,最終導致AD的發(fā)生[4,12]。

最初的研究結果顯示,AD組和對照組血液Aβ42水平無顯著差異,提示血液Aβ42水平主要反映外周的情況,而非腦中的Aβ水平。在最近幾項研究中,研究者將免疫沉淀反應質(zhì)譜分析[13-14]及Elecsys免疫分析[15]等高靈敏度分析技術用于血液中Aβ的檢測,由于這些檢測平臺具有更高的精度,并且可以在同一時間內(nèi)測定同一樣品中Aβ42和Aβ40水平,使得血液Aβ42/Aβ40比值在臨床上展示出廣闊的應用前景。如使用免疫沉底質(zhì)譜測定血液中Aβ水平,可以準確預測基于正電子發(fā)射體層攝影(PET)成像的輕度認知障礙(MCI)和AD患者腦淀粉樣蛋白狀態(tài)[14]。淀粉樣PET陰性但血液Aβ42/Aβ40比值異常的患者,在未來有很大風險會發(fā)展為PET陽性,說明血液Aβ42/Aβ40比值可用于預測和篩選淀粉樣PET陽性個體及AD的早期初步篩查[13]。此外,基于Elecsys免疫分析測定血液中Aβ水平的研究同樣表明,在AD發(fā)展的各階段,血液Aβ42/Aβ40水平在預測Aβ狀態(tài)時表現(xiàn)出較高的準確性[15]。以上研究結果均表明,血液Aβ在預測患者腦淀粉樣蛋白狀態(tài)及AD早期診斷方面具有廣闊的應用前景。

1.2Tau蛋白及P-tau Tau蛋白是一種微管相關蛋白,通過與微管蛋白相互作用來維系神經(jīng)元骨架系統(tǒng)的穩(wěn)定[5]。AD發(fā)病機制的另一主流假說是,Tau蛋白的過度磷酸化造成的腦神經(jīng)細胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(NFTs)。研究表明,AD患者腦神經(jīng)細胞內(nèi)NFTs的大量形成會導致神經(jīng)元退化,從而釋放Tau蛋白,使得CSF中Tau水平增加,其水平與MCI向AD的發(fā)展密切相關[16]。

相比CSF中Tau蛋白水平,穿越血腦屏障進入血液中的Tau水平非常低,由于檢測手段受限及大量隊列研究的缺乏,在早期研究中,有關血液Tau蛋白水平作為AD診斷標志物的報道較少見。近年來,由于檢測技術的快速發(fā)展,研究者將單分子陣列(Simoa)和基于電化學發(fā)光技術的MSD檢測系統(tǒng)用于AD患者血液中P-tau181、P-tau231和P-tau217的分析[17-21],使得血液P-tau蛋白水平作為AD早期診斷標志物的研究成為熱點方向。一項研究表明,患者在臨床上被診斷為AD前,血液P-tau181水平就開始升高,在MCI和癡呆期進一步升高,且血液P-tau181水平與CSF P-tau181水平及Tau PET呈正相關[17]。有研究表明,至少在患者死亡前8年,血液P-tau181就能準確預測AD的病理特征[19]。研究表明,AD患者血液P-tau181水平較對照組升高3.5倍左右,且可以有效地將AD與其他神經(jīng)退行性疾病(如額顳癡呆病區(qū))分開[18]。一項針對3個選定的隊列共1 402例患者的研究發(fā)現(xiàn),與其他血液標志物和核磁共振成像相比,P-tau217水平可以更好地將AD和其他神經(jīng)退行性疾病區(qū)分開,其準確性與PET成像結果無顯著差異[20]。在該項研究中,隊列3為PSENI突變攜帶者,研究發(fā)現(xiàn)在不溶性Tau聚集物未被Tau-PET檢測到即AD極早期時,血液P-tau217水平已經(jīng)在AD患者中增加了大約7倍,甚至在認知障礙出現(xiàn)前20年,P-tau217水平就開始上升。最近的一項研究表明,血液P-tau231和P-tau217水平與AD患者腦中早期Aβ沉積最為相關,可以作為臨床前AD患者Aβ病理學狀態(tài)的生物標志物,其能夠在患者大腦出現(xiàn)明顯Aβ斑塊前,更好地捕捉大腦Aβ的變化[21]。以上研究結果表明,Tau蛋白尤其是特定位點P-tau蛋白是具有廣闊發(fā)展前景的AD早期診斷標志物。

1.3神經(jīng)絲輕鏈蛋白(NFL) NFL是一種中間絲蛋白,主要表達于粗有髓軸突中,具有維持神經(jīng)元結構穩(wěn)定和調(diào)節(jié)軸突直徑的作用。當軸突損傷時,NFL將釋放到細胞空間外,導致CSF中NFL水平增加[22]。

在AD患者大腦中,神經(jīng)元變性的發(fā)生會加速NFL向CSF和血液釋放[22]。研究發(fā)現(xiàn),CSF中NFL水平和血液中NFL水平相關,MCI和具有Aβ病理特征的AD患者血液NFL水平均高于健康對照組,且CSF和血液中NFL水平升高與認知能力下降、腦萎縮及腦代謝減退有關[23]。最近一項同時針對認知未受損(CU)、MCI和AD患者的研究發(fā)現(xiàn),MCI和AD患者CSF和血液NFL水平均升高[24]。但在具有Aβ病理特征的CU患者中,只有CSF中NFL水平增加,血液中NFL水平?jīng)]有變化,且在AD轉基因小鼠模型中,隨著Aβ病理特征的發(fā)展,CSF中NFL水平增加要先于血清。因此,對CU個體來說,與血液NFL相比,CSF中NFL可能更適合作為生物標志物進行早期診斷。此外,一項足夠數(shù)量的隊列研究結果表明,雖然AD患者血液和CSF中NFL水平增加,但其增加的特異性并不高,NFL水平在很多其他神經(jīng)退行性疾病的血液和CSF中同樣會升高,尤其是額顳葉癡呆、肌萎縮性側索硬化癥和非典型帕金森病[25]。

總之,CSF和血液中NFL水平升高與AD的發(fā)展密切相關,NFL雖然不是AD特異性的生物標志物,但仍然可能在AD早期篩查、預測病情發(fā)展及藥物試驗預后監(jiān)測中起到不可替代的作用。

1.4外泌體 外泌體是一種長徑在100 nm左右的細胞外囊泡,其中攜帶大量特異性蛋白、脂質(zhì)、RNA、microRNAs、DNA等其他生物活性物質(zhì)。在大腦中,外泌體可以來自包括神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞在內(nèi)的所有細胞,在細胞通信及細胞功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮關鍵作用,外泌體可以通過CSF廣泛傳播至整個大腦,且可以通過血腦屏障釋放到外周血中[26]。

研究表明,外周血中神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞來源的外泌體可以作為生物標志物反映AD患者的病理特征,并可用于AD早期診斷[27]。此外,神經(jīng)源性外泌體中的多種特異性蛋白同樣可以作為生物標志物反映AD的發(fā)展過程。SARDAR SINHA等[28]發(fā)現(xiàn),AD患者大腦分泌的外泌體中Aβ寡聚體水平明顯增加,且通過阻斷腦源性外泌體的形成、分泌或攝取,減少Aβ寡聚體的擴散并降低其毒性。有研究團隊發(fā)現(xiàn),AD患者血液中神經(jīng)源性外泌體內(nèi)p-S396-tau、p-T181-tau及Aβ42水平均明顯升高,其水平不僅可以在患者出現(xiàn)癥狀10年前預測AD的發(fā)生,還可以準確預測患者從MCI發(fā)展為AD的過程[29-30]。最近,一項針對外周血中神經(jīng)源外泌體Aβ42、T-tau、P-tau181的研究發(fā)現(xiàn),外周血神經(jīng)源性外泌體中Aβ42、T-tau和P-tau181水平均可以反映AD患者大腦的病理變化,AD患者Aβ42、T-tau和P-tau181水平均明顯高于MCI患者和對照組患者,且外泌體中3種蛋白水平與其在CSF中的水平高度相關,二者表現(xiàn)出相同的診斷能力[30-31]。該團隊的另一項研究發(fā)現(xiàn),通過聯(lián)合檢測血液外泌體中突觸生長相關蛋白43、神經(jīng)粒素、突觸小體相關蛋白25和synaptotagmin 1水平[32],可以在患者產(chǎn)生認知障礙5～7年前預測AD的發(fā)生。

1.5其他生物標志物 除上述幾大類主要生物標志物外,其他標志物如膠質(zhì)細胞炎癥反應標志物[33-38],氧化應激(OS)生物標志物[39-42],血液中microRNA[43-47]等同樣有望作為新型生物標志物進行AD早期診斷。

神經(jīng)炎癥在AD早期發(fā)病機制中起重要作用[48-49]。研究表明,小膠質(zhì)細胞表達的Ⅱ型髓系細胞觸發(fā)受體(TREM2),與AD患者小膠質(zhì)細胞激活和先天性免疫反應有關,可以作為AD早期譜系神經(jīng)炎癥的潛在標志物[34]。在AD早期,CSF中可溶性水解產(chǎn)物TREM2(sTREM2)水平升高。另一項研究表明,CSF中sTREM2水平與神經(jīng)元變性和Tau病理學標志物相關,在T-tau陽性個體及具有AD病理學特征的T-tau陰性個體CSF中,sTREM2水平隨時間增加[35]。此外,單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)同樣與AD的發(fā)生密切相關。研究表明,血液MCP-1水平在AD早期與神經(jīng)解剖學具有相關性,較高的MCP-1水平與較差的情景記憶力有關[36]。CSF中MCP-1水平升高可能會加劇AD早期的病理進程[37],MCP-1水平高的AD患者認知能力下降更快。在MCI隊列中,聯(lián)合檢測CSF中MCP-1、Tau、P-tau、Aβ可以用來預測MCI發(fā)展為AD的可能性。除此之外,其他多項研究表明,CSF中白細胞介素(IL)-1α、IL-6、腫瘤壞死因子α、C-反應蛋白[33,38]等炎性細胞因子均有可能作為潛在生物標志物預測AD的發(fā)生。

過度OS產(chǎn)生的自由基,尤其是活性氧(ROS)的過度積累會損壞細胞核、線粒體、蛋白質(zhì)和核酸等,從而損傷細胞[50]。在AD早期,Aβ沉積及Tau蛋白過度磷酸化造成的神經(jīng)原纖維纏結會導致過度OS反應,激活AD相關信號通路[51],損傷中樞神經(jīng),加速AD的進程[52]。常見的OS標志物有同型半胱氨酸(Hcy)[39]、NADPH氧化酶[42]、8-羥基脫氧鳥苷[40-41]等。Hcy水平的升高會導致線粒體內(nèi)ROS增加。有研究發(fā)現(xiàn),在平均隨訪9.5年的7 274例受試者中,最終發(fā)展為AD與未發(fā)展為AD的個體相比,Hcy水平顯著升高,較高的Hcy水平會增加老年人患AD的風險[39]。NADPH氧化酶是ROS的主要來源。有研究表明,NADPH氧化酶與個體認知狀態(tài)之間存在很強的相關性,酶活性增加會導致認知下降,與健康人相比,MCI隊列中NADPH氧化酶的活性增加,并在AD隊列中保持升高[42]。

microRNA是一類內(nèi)源性、非蛋白編碼的微小RNA,其通過與靶標信使RNA結合,導致信使RNA降解或抑制信使RNA的翻譯,從而調(diào)控基因的表達[53]。大量研究表明,miRNA的異常表達與AD的發(fā)生密切相關。如AD患者血清miR-29c-3p、miR-19b-3p[43]、miR-501-3p[44]、miR-223[45]水平下調(diào),miR-455-3p[46]、miR-519[45]水平上調(diào)。此外,有研究表明,血漿miR-411[47]水平隨著AD的發(fā)展明顯升高,其可以有效區(qū)分MCI與輕度、中度和重度AD患者。

2 AD蛋白標志物的高靈敏度分析技術

在AD早期,只有少量蛋白標志物能夠從CSF穿越血腦屏障進入外周循環(huán),其在血液中豐度極低(fM級),傳統(tǒng)免疫分析方法無法實現(xiàn)精準定量分析[54-55]。因此,如何在AD發(fā)病早期,實現(xiàn)血液中超微量蛋白標志物的精準定量分析,是目前利用血液蛋白標志物進行AD無創(chuàng)早期診斷面臨的關鍵挑戰(zhàn)。近年來發(fā)展的一些蛋白標志物分析新技術,其靈敏度大大提高,被廣泛應用于神經(jīng)疾病研究領域。

2.1單分子免疫技術 Quanterix公司基于單分子免疫陣列技術的Single-Molecule Arrays(Simoa)系統(tǒng)是最具有代表性的超靈敏蛋白檢測方法[56],其主要原理是以每個微珠為獨立的反應單元,依據(jù)泊松分布,在每個微珠表面負載一個或零個免疫復合物,將微珠分散裝載到飛升級別的微孔陣列中,每個微孔只能容納一個微珠,含有酶標記免疫復合物的微孔會發(fā)生單分子引發(fā)的酶促反應,產(chǎn)生局部高濃度的熒光產(chǎn)物,統(tǒng)計具有熒光信號的陽性微孔個數(shù),即可實現(xiàn)數(shù)字式高靈敏度蛋白分子的定量分析[9]。

與基于檢測整個反應體系輸出的模擬信號的傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測模式相比,數(shù)字式ELISA檢測模式克服了傳統(tǒng)模式在靶標蛋白水平很低時,檢測信號被大量擴散和稀釋,檢測信號無法被有效辨識、方法靈敏度受到顯著限制的缺點[57]。即使待測樣本中靶標蛋白水平極低,只要蛋白分子被微孔捕獲并引發(fā)單分子酶促反應,陽性熒光微孔就可被識別統(tǒng)計。Simoa技術可以實現(xiàn)低水平蛋白標志物的靈敏準確分析,其靈敏度比傳統(tǒng)ELISA提升了1 000倍以上,且結果更加準確。因此該系統(tǒng)常被用于超微量蛋白標志物的準確靈敏檢測,尤其是神經(jīng)系統(tǒng)疾病血液標志物的分析[58]。

此外,基于單分子檢測技術(SMC)的Erenna單分子免疫檢測平臺在檢測低豐度蛋白標志物時也體現(xiàn)出廣闊的應用前景[59-60]。SMC技術基于傳統(tǒng)的三明治夾心免疫分析方法,在磁珠表面形成免疫復合物,經(jīng)過洗脫步驟,將熒光標記的檢測抗體洗脫下來。激光的聚焦效應會形成一個非常狹小的檢測空間“愛里斑”。這個空間集中了多達84%的激光能量,當洗脫下來的熒光標記的檢測抗體通過高能量“愛里斑”時,超過閾值的熒光信號被共聚焦成像系統(tǒng)統(tǒng)計為陽性信號,通過計數(shù)陽性信號,可以實現(xiàn)靶標蛋白的數(shù)字式高靈敏度分析。該技術融合了獨特的洗脫步驟和可靠的數(shù)字計數(shù),與傳統(tǒng)免疫檢測技術相比,信噪比有了顯著的改善,大大提高了檢測靈敏度,被廣泛用于超微量蛋白標志物的靈敏檢測。

2.2Meso Scale Discovery(MSD) 基于電化學發(fā)光的MSD技術也被廣泛用于超高靈敏度蛋白標志物分析[61]。該技術的主要原理如下:在石墨電極微孔板里包被捕獲抗體,加入靶標蛋白和釕復合物標記的檢測抗體,形成免疫復合物,釕復合物能夠在氧化電極上產(chǎn)生電化學信號,從而實現(xiàn)靶標蛋白的定量分析[10]。該技術的樣本用量只需25 μL,不僅可以實現(xiàn)低至0.05 pg/mL檢測限的高靈敏度蛋白分析,還可以通過點陣技術,在石墨電極板里實現(xiàn)每孔同時檢測10個指標、4個數(shù)量級的寬動態(tài)檢測范圍[62]。因此,MSD技術常用于檢測血液中的微量蛋白質(zhì)生物標志物[63]。

2.3免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析技術(IP-MS) IP-MS在分析外周血AD生物標志物中表現(xiàn)出廣闊的應用前景[13-14]。該方法首先通過免疫沉淀技術,利用抗體的特異性親和力,從豐富的血漿蛋白中分離和富集靶標蛋白及內(nèi)標蛋白,然后利用質(zhì)譜儀檢測靶標蛋白水平,對質(zhì)譜結果的內(nèi)標蛋白信號進行歸一化處理,最終換算得到靶標蛋白水平。如在SCHINDLER等[13]研究中,利用IP-MS實現(xiàn)了血漿Aβ的高靈敏度分析,其具體原理如下:來源于人體內(nèi)的天然Aβ包含有14N同位素標記的氨基酸,將一定濃度15N標記的內(nèi)標Aβ加入待測血漿中,利用免疫沉淀分離富集靶標蛋白Aβ,然后利用質(zhì)譜儀檢測靶標蛋白Aβ,得到Aβ同工型(Aβ38、Aβ40和Aβ42)的每個同位素(14N和15N)的質(zhì)譜圖,對所選靶標蛋白的離子峰面積進行求和。Aβ42水平計算公式為:14N同位素標記的Aβ42離子峰面積總和除以15N同位素標記的Aβ42離子峰面積總和乘以15N標記的內(nèi)標Aβ42水平,用同樣的方法計算Aβ40水平。最終得到的Aβ42/Aβ40比值可用于腦淀粉樣變性的預測。

3 小 結

本文探討了一系列存在于外周血中的AD早期標志物及其高靈敏度分析方法。在眾多生物標志物中,研究最廣泛且最有可能成為未來AD早期診斷發(fā)展方向的標志物有Aβ42/Aβ40、特定位點P-tau蛋白(P-tau181、P-tau217、P-tau231)及NLF。其中,Aβ42/Aβ40可以很好地反映大腦中淀粉樣蛋白狀態(tài),特定位點P-tau蛋白在區(qū)分AD和其他神經(jīng)退行性疾病上具有獨特的優(yōu)勢,NFL在預測病情發(fā)展及藥物試驗預后監(jiān)測中具有很好的診斷效果。此外,近年來超靈敏蛋白分析技術的快速發(fā)展,使得外周血中多種極低含量生物標志物的準確聯(lián)合檢測成為可能,這對于實現(xiàn)AD早期診斷具有非常重要的臨床意義。

雖然有關AD患者外周血中生物標志物的研究已經(jīng)取得了一系列成果,但仍存在一些亟須解決的問題:(1)由于樣本數(shù)量受限,部分研究中生物標志物的準確性還未被廣泛充分驗證,仍需要擴大樣本量繼續(xù)進行研究驗證;(2)部分研究時間不夠,需要繼續(xù)密切關注患者疾病發(fā)展情況,進行多年縱向研究;(3)需要更多的研究來確定如何最優(yōu)地結合多種生物標志物進行綜合分析,如Aβ42/Aβ40、P-tau、NFL及其他生物標志物或結合個體突變基因、認知測試進行系統(tǒng)分析;(4)每個實驗室所使用的血液樣本處理操作程序和標志物檢測手段不同,需要統(tǒng)一操作程序和檢測方法,提高研究結果的重復性和可靠性。

外周血中AD相關生物標志物研究正在朝著臨床應用發(fā)展,但明確AD不同發(fā)展階段、各個生物標志物的臨床診斷臨界值,并應用于AD早期診斷仍有很長一段路要走。相信隨著AD生物標志物研究的更加深入及檢測技術和評估方案的進一步提升,AD血液生物標志物在AD早期診斷和干預、抗AD藥物研發(fā)、預后等方面將體現(xiàn)出廣闊的應用前景。