金夢(mèng)軍 楊成德 李統(tǒng)華 OSEI Richard 蔡鋒鋒 馬婷

摘要

為明確球刺盤孢Colletotrichum?coccodes產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶（CWDEs）在其侵染馬鈴薯過(guò)程中的作用，本文對(duì)球刺盤孢離體和活體條件下產(chǎn)生的CWDEs種類及活性進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)RTqPCR測(cè)定了球刺盤孢侵染過(guò)程中多聚半乳糖醛酸酶（PG）基因的表達(dá)情況。通過(guò)定性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，球刺盤孢能夠產(chǎn)生果膠酶、纖維素酶和蛋白酶;定量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，球刺盤孢可產(chǎn)生羧甲基纖維素酶（Cx）、β葡萄糖苷酶（βGlu）、PG和聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）。在活體條件下，球刺盤孢可在馬鈴薯莖稈內(nèi)產(chǎn)生PG、PMG和多聚半乳糖醛酸反式消除酶（PGTE），且酶活分別于接種后48、72?h和144?h達(dá)到最大值，分別為26.50、77.61?U/mL和0.16?U/mg。分別將羧甲基纖維素鈉和果膠誘導(dǎo)后的酶液接種至馬鈴薯莖稈可引起植物組織浸腐，與球刺盤孢引起的典型癥狀相似。除此之外，球刺盤孢的4個(gè)PGs基因均在其侵染后24?h和48?h顯著共上調(diào)表達(dá)。綜上所述，該研究結(jié)果表明，果膠酶在球刺盤孢致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞

球刺盤孢;?馬鈴薯;?細(xì)胞壁降解酶;?多聚半乳糖醛酸酶

中圖分類號(hào)：

Q?939.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023263

The?role?of?cell?walldegrading?enzymes?of?Colletotrichum?coccodes?during?its?infection

JIN?Mengjun，?YANG?Chengde*，?LI?Tonghua，?OSEI?Richard，?CAI?Fengfeng，?MA?Ting

（Biocontrol?Engineering?Laboratory?of?Crop?Diseases?and?Pests?of?Gansu?Province，?College?of?Plant

Protection，?Gansu?Agricultural?University，?Lanzhou?730070，?China）

Abstract

To?determine?the?function?of?cell?walldegrading?enzymes?（CWDEs）?secreted?by?Colletotrichum?coccodes?during?infecting?potato?stems，?the?types?and?activities?of?CWDEs?secreted?by?C.coccodes?both?in?vivo?and?in?vitro?were?investigated，?the?gene?expression?levels?of?four?polygalacturonases?（PG）?of?C.coccodes?were?also?assessed?using?RTqPCR.?The?qualitative?measurement?results?indicated?that?C.coccodes?secretes?pectinase，?cellulase，?and?protease?on?detection?plates?in?vitro，?and?the?qualitative?determination?results?demonstrated?that?it?secretes?carboxymethyl?cellulase?（Cx），?βglucosidase?（βGlu），?polygalacturonase?（PG），?and?polymethylgalacturonase?（PMG）?on?detection?medium?in?vitro.?In?addition，?C.coccodes?produces?PG，?PMG?and?polygalacturonic?acid?transeliminase?（PGTE）?during?its?infection?to?potato?stems?in?vivo，?with?peak?activities?of?26.50，?77.61?U/mL?and?0.16?U/mg?48?h，?72?h?and?144?h?postinoculation，?respectively.?Inoculating?crude?enzymes?induced?by?sodium?carboxymethylcellulose?and?pectin?onto?potato?stems?could?cause?potato?stem?rotting?similar?to?the?typical?symptoms?caused?by?C.coccodes?on?potato?stems.?Moreover，?four?PGs?of?C.coccodes?showed?significantly?upregulated?coexpression?24?h?and?48?h?postinoculation.?Collectively，?these?data?demonstrated?the?important?role?of?pectinase?in?the?pathogenic?process?of?C.coccodes.

Key?words

Colletotrichum?coccodes;?Solanum?tuberosum;?cell?walldegrading?enzymes;?polygalacturonase

馬鈴薯是我國(guó)重要農(nóng)作物之一，2021年，中國(guó)馬鈴薯總產(chǎn)量約占全球總產(chǎn)量的23%，居世界首位［1］。然而，隨著種植面積增加，馬鈴薯晚疫病［2］、枯萎病［3］、瘡痂?。?］和炭疽?。?］等病害發(fā)生越來(lái)越普遍。其中，由球刺盤孢Colletotrichum?coccodes引起的炭疽病是馬鈴薯生產(chǎn)上的一種毀滅性病害，可在馬鈴薯整個(gè)生長(zhǎng)期發(fā)生，侵染后在感病植株的根、塊莖和莖稈上形成典型的黑色小顆粒，即分生孢子盤［6］，導(dǎo)致葉片干枯［7］，整株萎蔫、壞死，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率可達(dá)到30%～50%［8］。目前，炭疽病的發(fā)病面積和造成的經(jīng)濟(jì)損失還在持續(xù)上升。2019年，球刺盤孢引起的馬鈴薯炭疽病在中國(guó)河北和墨西哥被首次發(fā)現(xiàn)，造成嚴(yán)重?fù)p失［9］。因此，了解球刺盤孢的致病因子對(duì)有效防治馬鈴薯炭疽病具有重要意義。

寄主植物細(xì)胞壁包含纖維素、果膠、半纖維素等組分，其作為保護(hù)屏障，可抑制病原菌的侵入［10］。然而，病原菌分泌的細(xì)胞壁降解酶（cell?wall?degrading?enzymes，?CWDEs），如纖維素酶和果膠酶等能夠打破這種屏障，促進(jìn)病原菌侵入寄主植物體內(nèi)［11］，加速病害的發(fā)展。如尖孢刺盤孢C.acutatum產(chǎn)生的CWDEs幫助其侵入植株，引起橡膠樹(shù)炭疽病［12］。真菌可分泌不同種類的CWDEs［13］，而CWDEs?的多樣性也反映了植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和病原菌生活方式的多樣性［14］。有學(xué)者認(rèn)為，病原菌的致病性與CWDEs的活性相關(guān)，CWDEs的活性越高，該菌株的致病性越強(qiáng)［15］。豆類殼球孢M(jìn)acrophomina?phaseolina不同菌株在侵染玉米、向日葵和西瓜種子的過(guò)程中產(chǎn)生的CWDEs活性不同，其致病性也存在差異［16］。從咖啡樹(shù)上分離的33株盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢?C.gloeosporioides均可以產(chǎn)生淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、漆酶和果膠酶［多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）

、聚甲基半乳糖醛酸酶（polymethylgalacturonase，PMG）

和果膠裂解酶］，其中致病力較高的菌株?19和?124?可以分泌高活性的CWDEs［17］。尖孢刺盤孢引起的橡膠樹(shù)炭疽病中，葉片上病斑大小與果膠裂解酶活性具有相關(guān)性，且在發(fā)病的葉片中檢測(cè)到了?β葡萄糖苷酶和纖維素二糖酶［12］。因此，病原菌分泌的CWDEs?在其侵染寄主植物的過(guò)程中可能作為毒力因子發(fā)揮致病作用，尤其是纖維素酶和果膠酶［1819］。

致病菌在侵染寄主植物時(shí)首先分泌果膠酶降解植物細(xì)胞壁，被降解的細(xì)胞壁在為病原菌提供碳源的同時(shí)還能促進(jìn)纖維素酶和半纖維素酶降解植物細(xì)胞壁中的其他組分，最終加速病原菌在寄主體內(nèi)的擴(kuò)展［20］。有研究表明，果膠酶的活性決定著病原菌的致病性，是導(dǎo)致植物發(fā)病的重要因素之一［21］。實(shí)生鏈核盤菌Monilinia?fructicola在侵染蟠桃時(shí)會(huì)分泌PMG和PG，且引起褐腐等癥狀［22］。在馬鈴薯病害的研究中，多種病原菌在侵染過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生水解酶，且果膠酶的活性隨著培養(yǎng)基的不同而發(fā)生變化［23］。對(duì)33株盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢分泌的果膠酶（PG和PMG）活性進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其與病原菌的致病性相關(guān)［17］。除此之外，康振生等［24］采用免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察禾谷鐮孢Fusarium?graminearum侵染小麥穗組織時(shí)發(fā)現(xiàn)，病原菌產(chǎn)生的果膠酶可引起寄主細(xì)胞壁松弛。PGs屬于糖苷水解酶28家族（GH28），能夠催化果膠和半乳糖醛酸中1，4αD半乳糖醛酸鍵的水解，降解植物細(xì)胞壁中果膠成分，促進(jìn)病原菌順利侵入［25］。PGs在離體和活體條件下的活性與病原真菌的毒力大小相關(guān)［15］，如Alternaria?patula［26］和小新殼梭孢Neofusicoccum?parvum［27］的毒力常與PGs的活性呈正相關(guān)。將來(lái)自豆刺盤孢Colletotrichum?lindemuthianum的PG在農(nóng)桿菌內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)后，接種至煙草葉片時(shí)可引起過(guò)敏性壞死反應(yīng)（hypersensitive?response，HR）［28］。平頭刺盤孢C.truncatum侵染大豆時(shí)，PG首先被“激活”，并協(xié)助?PMG?和果膠裂解酶降解大豆細(xì)胞壁成分［29］。以上研究表明，PG在病原真菌的致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而，根據(jù)之前相關(guān)報(bào)道，球刺盤孢的致病機(jī)制常與附著孢和侵入釘?shù)男纬桑?0］以及果膠酸裂解酶［31］相關(guān)，而關(guān)于其產(chǎn)生的其他細(xì)胞壁降解酶在其致病過(guò)程中是否發(fā)揮毒力作用研究較少。

因此，本研究以球刺盤孢為研究對(duì)象，通過(guò)定性和定量方法測(cè)定其在寄主體內(nèi)和體外產(chǎn)生的主要果膠酶和纖維素酶的種類及其活性，并確定其是否在球刺盤孢致病過(guò)程中發(fā)揮作用，以期明確球刺盤孢分泌的CWDEs種類，及其與球刺盤孢致病性之間的相關(guān)性，通過(guò)RTqPCR確定PG基因在球刺盤孢侵染過(guò)程中的表達(dá)情況，為球刺盤孢果膠酶致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1?材料和方法

1.1?材料

1.1.1?供試菌株與植物

馬鈴薯炭疽病病原菌：球刺盤孢Colletotrichum?coccodes，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病原細(xì)菌及生物多樣性實(shí)驗(yàn)室提供。供試植物：馬鈴薯，?品種‘大西洋。

1.1.2?供試試劑

50?mmol/L的檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液（pH?5.0）、醋酸醋酸鈉緩沖液（pH?5.0）和甘氨酸氫氧化鈉緩沖液（GlyNaOH，pH?9.0）；1%的羧甲基纖維素鈉（CMC）（pH?5.0）、水楊苷（pH?5.0）、果膠（pH?5.0）和多聚半乳糖醛酸（pH?5.0）；3?mmol/L?CaCl2；1?mol/L?NaCl；3，5二硝基水楊酸（Dinitrosalicylic?acid，DNS）（棕色瓶保存）;均由實(shí)驗(yàn)室配制。

1.1.3?供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：用于球刺盤孢的活化；

馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（PDB）：用于球刺盤孢孢子懸浮液制備。

細(xì)胞壁降解酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基：2?g?KNO3，0.5?g?KCl，0.01?g?FeSO4，1?g?K2HPO4，0.5?g?MgSO4·7H2O，10?g?碳源（柑橘果膠：用于果膠酶誘導(dǎo);羧甲基纖維素鈉：用于纖維素酶誘導(dǎo)），1?000?mL雙蒸水。用于球刺盤孢分泌的細(xì)胞壁降解酶的定量測(cè)定。

葡萄糖酵母提取物蛋白胨培養(yǎng)基（glucose?yeast?extracts?peptone?medium，GYP）：1?g葡萄糖，0.1?g酵母提取物，0.5?g蛋白胨，16?g瓊脂，2?g可溶性淀粉，1?000?mL蒸餾水。用于細(xì)胞壁降解酶的定性分析。

果膠瓊脂培養(yǎng)基（pH?5.0）：5?g果膠，1?g酵母提取物，15?g瓊脂，1?000?mL蒸餾水。用于果膠酶活性的定性分析。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?球刺盤孢細(xì)胞壁降解酶分泌活性的定性測(cè)定

球刺盤孢于PDA平板25℃黑暗培養(yǎng)7?d，打取5?mm菌餅轉(zhuǎn)接至纖維素酶、蛋白酶和果膠酶檢測(cè)培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)7?d。以只接種5?mm?PDA瓊脂培養(yǎng)基的平板為對(duì)照。通過(guò)染色觀察球刺盤孢分泌纖維素酶、蛋白酶和果膠酶的能力，每處理組接4皿。具體測(cè)定方法如下：

纖維素酶分泌活性定性測(cè)定：將5?mm球刺盤孢菌餅接種至含有0.5%羧甲基纖維素鈉（sodium?carboxymethylcellulose，CMC）（pH?6.0）的GYP平板。25℃黑暗培養(yǎng)7?d后，將0.2%剛果紅溶液平鋪于平板表面染色30?min，ddH2O漂洗干凈后，用1?mol/L?NaCl脫色15?min。如接種球刺盤孢的培養(yǎng)基背景由紅色變?yōu)辄S色，說(shuō)明其具有產(chǎn)纖維素酶的能力［10］。

蛋白酶［10］和果膠酶［32］分泌活性定性測(cè)定：將5?mm球刺盤孢菌餅分別接種至含有0.4%明膠（pH?4.0）的GYP平板和果膠瓊脂培養(yǎng)基上。25℃培養(yǎng)7?d后，分別用10%飽和硫酸銨溶液和1%十六烷基三甲基溴化銨水溶液浸沒(méi)15?min，如菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明圈，表明球刺盤孢具有產(chǎn)生蛋白酶和果膠酶的能力。

1.2.2?球刺盤孢細(xì)胞壁降解酶分泌活性的定量測(cè)定［3334］

1.2.2.1?培養(yǎng)基中球刺盤孢細(xì)胞壁降解酶粗酶液的提取及純化

分別在250?mL的細(xì)胞壁降解酶誘導(dǎo)培養(yǎng)液和PDB培養(yǎng)液中接種10個(gè)球刺盤孢菌餅（5?mm），于搖床（HNY203T，天津歐諾儀器股份有限公司）中25℃、120?r/min振蕩培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168?h和192?h過(guò)濾菌絲，培養(yǎng)液10?000?r/min?離心30?min，收集上清液，即為待測(cè)粗酶液。利用60%飽和硫酸銨對(duì)所得粗酶液進(jìn)行濃縮。具體為：將粗酶液與60%飽和硫酸銨混合，4℃靜置5?h，4℃?14?000?r/min離心25?min，棄上清，將沉淀溶解于50?mmol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液（pH?5.0）中，4℃透析48?h，得到純化酶液。

1.2.2.2?球刺盤孢侵染馬鈴薯莖稈后細(xì)胞壁降解酶的提取

將球刺盤孢接種至PDB中，25℃，120?r/min振蕩培養(yǎng)獲得孢子懸液（108個(gè)/mL），將其接種至馬鈴薯莖稈，于接種后24、48、72、96、120?h和144?h分別收集馬鈴薯發(fā)病部位及周圍的組織樣本（每個(gè)時(shí)間段收集混合樣品共1?g）于無(wú)菌研缽中，加入1?mol/L?NaCl（9?mL/g組織）進(jìn)行研磨，收集研磨勻漿液，4℃、10?000?r/min?離心20?min，收集上清液于4℃保存。以接種無(wú)菌水后研磨的馬鈴薯組織上清液為對(duì)照。以球刺盤孢侵染后馬鈴薯體內(nèi)CWDEs活性與無(wú)菌水接種后CWDEs活性的差值表示球刺盤孢侵染莖稈時(shí)所分泌的CWDEs活性。每個(gè)時(shí)間段收集3份樣品用于試驗(yàn)。

1.2.2.3?標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：在8個(gè)空的10?mL離心管中分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2?mL和1.4?mL濃度為1?mg/mL的葡萄糖溶液，補(bǔ)足蒸餾水至2?mL，分別加入2?mL?DNS，使葡萄糖濃度分別為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30?mg/mL和0.35?mg/mL，混勻后煮沸5?min，自來(lái)水冷卻，加入5?mL蒸餾水。以含有0?mg/mL葡萄糖的溶液為對(duì)照，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定不同濃度葡萄糖溶液的OD540。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)濃度的OD540為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

D半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法同葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，以D半乳糖醛酸［用50?mmol/L的檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液（pH?5.0）配制］代替1?mg/mL葡萄糖，且自來(lái)水冷卻后的混合液用蒸餾水定容至10?mL。最后，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定不同濃度D半乳糖醛酸的OD540，以不加D半乳糖醛酸的混合液為對(duì)照。以D半乳糖醛酸的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的OD540為縱坐標(biāo)，繪制D半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線：用蒸餾水將1?mg/mL的牛血清蛋白分別稀釋為0、20、60、100、140、180、220?μg/mL?和260?μg/mL，再分別加入5?mL考馬斯亮藍(lán)G250，混勻后靜置2?min。以含0?mg/mL牛血清蛋白的混合液作為空白調(diào)零，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各管OD595。以牛血清蛋白的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的OD595為縱坐標(biāo)，繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將1?mL待測(cè)粗酶液與5?mL考馬斯亮藍(lán)G250混勻，靜置2?min后測(cè)定OD595，試驗(yàn)重復(fù)3次。

以加入1?mL?50?mmol/L?醋酸鈉緩沖液（pH?5.0）的混合液為對(duì)照，再根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶液蛋白濃度［35］。

1.2.2.4?細(xì)胞壁降解酶活性的定量測(cè)定

羧甲基纖維素酶和β葡萄糖苷酶活性：

將1?mL待測(cè)酶液與1?mL檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液（50?mmol/L，pH?5.0）混合，加入1?mL底物［1%?CMC和1%水楊苷分別為測(cè)定

羧甲基纖維素酶（Cx）和β葡萄糖苷酶（βGlu）酶活性的底物］，50℃保溫30?min后加入2?mL?DNS，于沸水中加熱終止反應(yīng)（測(cè)定Cx和βGlu活性的離心管分別加熱10?min和5?min），分別測(cè)定各樣品于540?nm處的吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葡萄糖濃度。對(duì)照組是先加入DNS終止反應(yīng)，再加入底物，其他步驟與處理組相同。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。將1個(gè)酶活力單位定義為：在50℃和pH?5.0的條件下，1?mL酶液水解CMC或水楊苷1?h產(chǎn)生1?mg葡萄糖所需酶量。

酶活力（U/mL）=（As-A0）/（K×V×T）×Dr，式中，As：樣品酶的OD540;A0：空白樣品酶的OD540;K：標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率;Dr：稀釋倍數(shù);V：取樣量（mL）;T：反應(yīng)時(shí)間（h）。

PG和PMG活性：測(cè)定方法與上述方法相似。其中，測(cè)定PG和PMG活性的底物分別為1%多聚半乳糖醛酸和1%果膠，50℃保溫60?min。根據(jù)D半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算PG和PMG酶活力。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。將1個(gè)酶活力單位定義為：在50℃和pH?5.0條件下，1?mL酶液水解1?h多聚半乳糖醛酸或果膠產(chǎn)生1?mg?D半乳糖醛酸所需酶量。

酶活力（U/mL）=（As-A0）/（K×V×T）×Dr，

式中，As：樣品酶的OD540;A0：空白樣品酶的OD540;K：標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率;Dr：稀釋倍數(shù);V：取樣量（mL）;T：反應(yīng)時(shí)間（h）。

多聚半乳糖醛酸反式消除酶（polygalacturonic?acid?transeliminase，PGTE）和果膠甲基反式消除酶（pectin?methyltranseliminase，PMTE）活性：分別用1%多聚半乳糖醛酸和1%果膠作為底物進(jìn)行酶活性檢測(cè)。具體操作方法：1?mL待測(cè)粗酶液中加入1?mL?50?mmol/L?GlyNaOH（pH?9.0）緩沖溶液，再加入1?mL底物和1?mL?3?mmol/L?CaCl2溶液，混勻，30℃條件下反應(yīng)60?min，立即加入2?mL?DNS終止反應(yīng)，自來(lái)水冷卻后，加入蒸餾水，定容至6?mL，測(cè)定其OD232。其中，對(duì)照組先加入DNS終止反應(yīng)后再加入底物。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。1個(gè)酶活力單位定義為：在30℃和pH?5.0?條件下，1?mL酶液1?min水解多聚半乳糖醛酸或果膠產(chǎn)生1?μmol不飽和醛酸所需酶量。

酶活性（U/mg）=（ΔOD232×0.1×Dr）/（0.17×C×T），式中，△OD232：OD232（反應(yīng)T時(shí)間后）-?OD232（反應(yīng)初期）;Dr：稀釋倍數(shù);0.17：每釋放0.1?μmol不飽和醛酸，在232?nm處增加的OD232值;C：粗酶液蛋白濃度（mg/mL），根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算;T：反應(yīng)時(shí)間（h）。

1.2.3?經(jīng)果膠和纖維素誘導(dǎo)的球刺盤孢粗酶液對(duì)馬鈴薯莖稈的浸解作用

在細(xì)胞壁降解酶培養(yǎng)基中分別利用CMC和果膠對(duì)球刺盤孢進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)96?h后，采用1.2.2.1的方法提取粗酶液并純化。分別取100?μL純化的纖維素酶和果膠酶液接種至健康的馬鈴薯莖稈（用5號(hào)昆蟲(chóng)針針刺造成微傷口，且利用75%乙醇進(jìn)行表面消毒）。以接種球刺盤孢為陽(yáng)性對(duì)照組，以接種無(wú)菌水為陰性對(duì)照組。72?h后，觀察并記錄纖維素粗酶液和果膠粗酶液對(duì)馬鈴薯莖稈組織的浸解作用。

1.2.4?球刺盤孢侵染過(guò)程中PG基因的相對(duì)表達(dá)量

選擇4個(gè)具有信號(hào)肽且在侵染馬鈴薯莖稈過(guò)程中上調(diào)表達(dá)的PGs基因［Cluster14407.17878，?Cluster14407.16352、Cluster83170.0和Cluster84997.0，屬于糖苷水解酶28家族（GH28）］，采用RTqPCR（QuantStudio5，ABI，美國(guó)）測(cè)定其在球刺盤孢侵染馬鈴薯后3、6、12、24、48、72?h和96?h?的表達(dá)情況，以收集于PDA平板的球刺盤孢菌絲和分生孢子的轉(zhuǎn)錄本作為對(duì)照組（0?h）。采用OMEGA真菌RNA提取試劑盒（OMEGA?Biotek，?Georgia，?美國(guó)）提取球刺盤孢樣本的RNA，以此為模板，利用PrimeScriptTM?Ⅱ?1st?Strand?cDNA?Synthesis?Kit（TaKaRa?Biotechnology?Co.，?Ltd.，?北京，中國(guó)）合成球刺盤孢的單鏈cDNA。利用Primer?Premier?6.0設(shè)計(jì)PGs基因的RTqPCR引物，以球刺盤孢的18S?rRNA作為內(nèi)參基因（表1）［31］。RTqPCR的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃?10?min；40個(gè)循環(huán)（95℃?15?s，60℃?30?s，72℃?30?s）；熔解曲線（95℃?15?min，60℃?60?s，95℃?15?s）。擴(kuò)增體系為（20?μL）：10?μL?2x?SYBR?Green?qPCR?Master?Mix，上、下游引物各1?μL?（10?μmol/L），1～100?ng?球刺盤孢cDNA，0.4?μL?ROX?Reference?Dye（No.2）。利用2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，其中ΔΔCt=（Ct處理組目標(biāo)基因-?Ct處理組18S?rRNA）-（Ct對(duì)照組目標(biāo)基因-?Ct對(duì)照組18S?rRNA）［36］，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

2?結(jié)果與分析

2.1?球刺盤孢細(xì)胞壁降解酶活性定性測(cè)定結(jié)果

球刺盤孢在離體條件下具有產(chǎn)生CWDEs的能力。分別在以羧甲基纖維素鈉和明膠作為誘導(dǎo)底物的GYP培養(yǎng)基上，球刺盤孢可以分泌纖維素酶和蛋白酶，在果膠瓊脂培養(yǎng)基上可分泌

果膠酶。其中，將球刺盤孢接種至含有0.5%?CMC的GYP平板，培養(yǎng)7?d后，通過(guò)染色可明顯觀察到菌絲覆蓋的培養(yǎng)基背景色由染色后的紅色變?yōu)辄S色（圖1a），說(shuō)明培養(yǎng)基中有纖維素酶的產(chǎn)生;于含有0.4%明膠的GYP平板上，球刺盤孢菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明水解圈（圖1b），說(shuō)明有蛋白酶產(chǎn)生;用1%十六烷基三甲基溴化銨水溶液浸沒(méi)接種球刺盤孢的果膠瓊脂平板后，其菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明圈（圖1c），說(shuō)明球刺盤孢能夠產(chǎn)生果膠酶水解培養(yǎng)基中的果膠進(jìn)而形成水解圈;同時(shí)，對(duì)照組平板均無(wú)明顯變化?（圖1a′，b′和c′）。

2.2?球刺盤孢細(xì)胞壁降解酶活性的定量測(cè)定結(jié)果

2.2.1?標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別測(cè)定不同濃度葡萄糖、D半乳糖醛酸和牛血清蛋白在540、540?nm和595?nm處的吸光度，以此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：y=6.916?4x+0.017?9（R2=0.999?6），y=5.371?4x-0.036?6（R2=0.998?5）和?y=0.006?2x+0.016?1（R2=0.997?3）。

2.2.2?培養(yǎng)基中球刺盤孢分泌的細(xì)胞壁降解酶活性

離體條件下，在細(xì)胞壁降解酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中球刺盤孢可分泌

Cx、βGlu、PG和PMG，其酶活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。其中，Cx和βGlu活性均在培養(yǎng)120?h時(shí)達(dá)到峰值，其酶活性分別為0.657?9?U/mL（圖2a）和0.6145?U/mL（圖2b），但與培養(yǎng)144?h時(shí)的酶活性無(wú)顯著差異

（P<0.05）;在底物為果膠的細(xì)胞壁降解酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，球刺盤孢分泌的PG和PMG活性分別于培養(yǎng)后96?h和72?h達(dá)到峰值，分別為103.553?U/mL（圖2c）和137.849?U/mL（圖2d），達(dá)到峰值之后，PG活性相比PMG活性出現(xiàn)大幅度降低。由此可見(jiàn)，球刺盤孢經(jīng)果膠誘導(dǎo)能夠產(chǎn)生大量的PG和PMG，且產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性為：PMG＞PG＞Cx＞βGlu。

在PDB培養(yǎng)基中，球刺盤孢僅能產(chǎn)生PG和PMG。其中，PG和PMG活性分別于培養(yǎng)后120?h和96?h達(dá)到峰值，其酶活性分別為79.309?U/mL（圖3a）和163.955?U/mL（圖3b），達(dá)到峰值后其活性均顯著下降（P<0.05）。球刺盤孢于PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～192?h內(nèi)，PG和PMG活性的變化范圍分別為19.445～79.309?U/mL和114.02～163.955?U/mL，?與含有底物的細(xì)胞壁誘導(dǎo)培養(yǎng)基中

所產(chǎn)生的PG和PMG活性相似，且PMG＞PG。

2.2.3?球刺盤孢侵染馬鈴薯莖稈后分泌的細(xì)胞壁降解酶活性

將球刺盤孢接種至馬鈴薯莖稈，檢測(cè)其侵染過(guò)程中PG、PMG、PGTE和PMTE的活性。結(jié)果表明，在接種后24～144?h，其在莖稈內(nèi)分泌的PG、PMG和PGTE活性均大于0?U/mL?（或U/mg）（圖4a～c），但未檢測(cè)到PMTE活性。其中，PG活性在接種后48?h達(dá)到最大值，為26.50?U/mL（圖4a）;PMG活性在接種后72?h達(dá)到峰值，為77.61?U/mL（圖4b），顯著高于其他互作時(shí)間段的酶活性（P<0.05）。除此之外，在球刺盤孢接種馬鈴薯莖稈后24～120?h，PGTE活性較低，接種后144?h達(dá)到最大值，為0.16?U/mg（圖4c）。該結(jié)果表明，球刺盤孢在侵染馬鈴薯莖稈的過(guò)程中，能夠在馬鈴薯莖稈體內(nèi)產(chǎn)生較多的PMG，其次為PG和PGTE，但不能產(chǎn)生PMTE。

2.2.4?球刺盤孢細(xì)胞壁降解酶對(duì)馬鈴薯莖稈的浸解作用

將羧甲基纖維素鈉（圖5a）和果膠（圖5b）誘導(dǎo)后的濃縮酶液接種至馬鈴薯莖稈72?h后，其接種部位組織被浸解，出現(xiàn)褐色和梭形壞死癥狀，與接種球刺盤孢（圖5c）的發(fā)病癥狀相似。其中，與接種纖維素酶液后的馬鈴薯莖稈相比，果膠酶液在馬鈴薯莖稈上的活性較高，對(duì)植物細(xì)胞壁組織的浸解作用較強(qiáng)，能夠明顯造成馬鈴薯莖稈變褐。接種無(wú)菌水的馬鈴薯莖稈并未表現(xiàn)出任何組織壞死等癥狀（圖5d）。結(jié)果表明，果膠酶在球刺盤孢侵染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可作為毒力因子，加速對(duì)馬鈴薯莖稈的浸解，可促進(jìn)球刺盤孢的順利侵入。

2.2.5?球刺盤孢侵染過(guò)程中PG基因的相對(duì)表達(dá)量

采用RTqPCR對(duì)4個(gè)含有信號(hào)肽，且具有多聚半乳糖醛酸酶活性的PGs基因［屬于糖苷水解酶28家族（GH28）］在球刺盤孢侵染過(guò)程中的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Cluster14407.17878?和Cluster14407.16352在球刺盤孢侵染的整個(gè)過(guò)程中（3～96?h）持續(xù)上調(diào)表達(dá)。其中，Cluster14407.17878在接種后24?h顯著上調(diào)表

達(dá)（P<0.05），其相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的21.38倍;Cluster14407.16352在接種后48?h顯著上調(diào)表達(dá)（P<0.05），其相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的45.50倍

。除此之外，Cluster83170.0在接種后24?h開(kāi)始上調(diào)表達(dá)，且在24?h時(shí)表達(dá)量最高，為對(duì)照的41.36倍，在接種后96?h的表達(dá)量顯著低于其他互作時(shí)間段的表達(dá)量（P<0.05）。Cluster84997.0僅在接種后24?h和48?h上調(diào)表達(dá)。通過(guò)RTqPCR測(cè)定發(fā)現(xiàn)，球刺盤孢的4個(gè)PGs基因主要在其侵染馬鈴薯后24?h和48?h共表達(dá)（圖6）。

3?結(jié)論與討論

植物細(xì)胞壁含有多種組分，還能抵御病原菌的入侵。然而，為了能夠打破寄主植物的物理屏障順利進(jìn)入寄主植物細(xì)胞，并在寄主體內(nèi)定殖和擴(kuò)展，病原菌會(huì)分泌大量的CWDEs降解植物細(xì)胞壁組分，以加速其侵染過(guò)程［15］。通常，果膠酶、纖維素酶和蛋白酶的活性與病原菌的致病性相關(guān)［37］。球刺盤孢在含誘導(dǎo)底物的平板上可以產(chǎn)生果膠酶、纖維素酶和蛋白酶。同時(shí)，在纖維素和果膠誘導(dǎo)下可產(chǎn)生Cx、βGlu、PG和PMG。果膠酶是致病真菌產(chǎn)生的一類重要的細(xì)胞壁降解酶，在病原菌早期致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其降解植物細(xì)胞壁果膠成分，從而促進(jìn)病原菌的侵入［3839］。在本研究中，PG和PMG在離體和活體條件下均于培養(yǎng)后或接種后24?h被檢測(cè)到，其活性經(jīng)底物誘導(dǎo)培養(yǎng)96?h和72?h達(dá)到峰值，且高于Cx和βGlu的活性。但有研究表明，立枯絲核菌Rhizoctonia?solani經(jīng)果膠誘導(dǎo)48?h才能產(chǎn)生PG和PMG，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，其活性逐漸增加，分別于培養(yǎng)10?d和12?d達(dá)到峰值［40］。本研究中，球刺盤孢在細(xì)胞壁降解酶誘導(dǎo)培養(yǎng)液中產(chǎn)生最多的CWDEs是PMG，其次是PG、Cx和βGlu，?其中，PMG的活性范圍為86.59～137.849?U/mL，在誘導(dǎo)后72?h達(dá)到峰值。在山藥組織中，草酸青霉Penicillum?oxalicum的βGlu酶活性低于果膠酶和Cx［41］，本研究結(jié)果與此一致。本研究結(jié)果表明，球刺盤孢在果膠誘導(dǎo)下會(huì)產(chǎn)生大量的果膠酶，果膠酶可能是病原菌的一個(gè)致病因子。

通過(guò)活體接種發(fā)現(xiàn)，球刺盤孢侵染馬鈴薯后?48?h?和72?h，馬鈴薯莖稈內(nèi)PG和PMG活性最高，分別為26.50?U/mL和77.61?U/mL。但有研究表明，Colletotrichum可在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量PG，而在寄主植物活體組織內(nèi)檢測(cè)不到PG［12］，這與本研究結(jié)果不同。PG在球刺盤孢侵染馬鈴薯的過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。此外，在球刺盤孢侵染馬鈴薯莖稈后24～48?h，莖稈內(nèi)PG活性相比其他互作時(shí)間段高，說(shuō)明PG可能在球刺盤孢的活體營(yíng)養(yǎng)階段協(xié)助病原菌侵入寄主植物并引起病害癥狀。有研究表明，PGTE可在玉米彎孢霉葉斑病菌Curvularia?lunata侵染玉米后72?h產(chǎn)生，并在外源鐵的作用下可導(dǎo)致植物病害發(fā)生［33］。球刺盤孢在侵染馬鈴薯時(shí)，馬鈴薯莖稈內(nèi)也檢測(cè)到PGTE，但在侵染后24～120?h內(nèi)其活性水平較低，于侵染后144?h活性顯著升高，說(shuō)明PGTE可能在球刺盤孢的死體營(yíng)養(yǎng)階段發(fā)揮作用。在馬鈴薯莖稈上接種CMC和果膠誘導(dǎo)的酶液，進(jìn)一步證實(shí)了果膠酶和纖維素酶具有降解植物細(xì)胞壁的作用，且果膠誘導(dǎo)的粗酶液相比CMC誘導(dǎo)的粗酶液在馬鈴薯莖稈上引起的浸腐癥狀更明顯。同樣，Babalola［42］認(rèn)為，纖維素酶和果膠酶能夠促進(jìn)Fusarium?compactum侵入分枝列當(dāng)Orobanche?aegyptiaca，并造成其死亡率大于50%。以上研究結(jié)果表明，球刺盤孢分泌的果膠酶可能在降解馬鈴薯植株細(xì)胞壁和促進(jìn)球刺盤孢侵染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，尤其是PG和PMG。

除此之外，BenDaniel等［31］設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，克隆了球刺盤孢的果膠裂解酶基因，并證實(shí)其可作為致病因子影響球刺盤孢的致病性。而在本文中，通過(guò)對(duì)球刺盤孢侵染馬鈴薯后上調(diào)表達(dá)的4個(gè)PGs基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，初步確定其與球刺盤孢的侵染過(guò)程具有相關(guān)性。其中，這4個(gè)PGs基因在球刺盤孢侵染后24?h共同顯著上調(diào)表達(dá)，而通過(guò)生理生化檢測(cè)，球刺盤孢產(chǎn)生的PG活性峰值出現(xiàn)在其侵染馬鈴薯后48?h，這主要是因?yàn)椴≡砩谋憩F(xiàn)常受控于基因表達(dá)的調(diào)控，因此基因的表達(dá)往往早于生理生化特征的表現(xiàn)［43］，證實(shí)了本試驗(yàn)的結(jié)論。除此之外，Cluster14407.17878?和?Cluster14407.16352在球刺盤孢侵染馬鈴薯后3～96?h內(nèi)持續(xù)上調(diào)表達(dá)。Cluster83170.0和?Cluster84997.0在侵染馬鈴薯后24?h開(kāi)始被誘導(dǎo)表達(dá)，其中，Cluster84997.0僅在侵染馬鈴薯后24?h和48?h表達(dá)，表明其可能在球刺盤孢侵染中期參與對(duì)馬鈴薯細(xì)胞壁的降解，而玉蜀黍黑粉菌Ustilago?maydis分泌的PG在其侵染后10?d才能被檢測(cè)到［44］，說(shuō)明PG家族內(nèi)的不同基因在不同病原菌的不同侵染時(shí)期發(fā)揮重要作用。糖苷水解酶28家族（GH28）的CWDEs通常具有協(xié)同作用和功能冗余現(xiàn)象，其中一個(gè)基因編碼的CWDEs活性會(huì)受到其他CWDEs的影響［45］。有報(bào)道表明，缺少多聚半乳糖醛酸酶基因pgxB的黑曲霉Aspergillus?niger對(duì)蘋果果實(shí)的致病性明顯降低，但是，通過(guò)RTqPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，同一家族內(nèi)其他PG基因（pgal、pgall、pgaA、pgaC、pgaD和?pgaE）的表達(dá)量明顯增加，且PG活性也明顯升高［46］。在本試驗(yàn)中，球刺盤孢分泌的PG活性在其侵染后48?h最高，而球刺盤孢的4個(gè)PGs基因在其侵染后24?h顯著共上調(diào)表達(dá)，且不同時(shí)間段4個(gè)PG基因的表達(dá)量存在差異，該結(jié)果表明，這4個(gè)PGs基因可能在球刺盤孢侵染馬鈴薯的整個(gè)過(guò)程具有協(xié)同作用。然而，關(guān)于它們?cè)谇虼瘫P孢致病過(guò)程中的作用，以及它們各自之間的互作機(jī)制，還需有待進(jìn)一步研究。

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