周永平 黃玉鋒 張燕 馬超 陳紅松 桂富榮 周忠實(shí)

摘要

卵黃原蛋白（vitellogenin，Vg）作為雌性多功能生殖蛋白，為卵黃發(fā)生提供所需的儲備能源。為明確Vg基因在廣聚螢葉甲Ophraella?communa生殖過程中的潛在作用，本研究通過RTPCR技術(shù)克隆得到廣聚螢葉甲的3個Vg基因，其OcVg1，OcVg2和OcVg3開放閱讀框（ORF）分別為5?310、5?322?bp和5?298?bp，對應(yīng)編碼1?768、1?772和1?764個氨基酸。其OcVgs蛋白具有LLTP超家族的保守結(jié)構(gòu)域：LPD_N、DUF1943和VWD結(jié)構(gòu)域;多位于N端的多聚絲氨酸區(qū)（polyserine?domains），保守的GL/ICG、R/KXXR/K、DGXR基序和C端半胱氨酸殘基等。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，OcVgs與鞘翅目昆蟲聚為一支。時空表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，OcVgs基因在不同組織及發(fā)育階段的表達(dá)動態(tài)相似，在脂肪體中特異性高表達(dá)（P<0.05）;在成蟲羽化后的性成熟階段的表達(dá)量最高，幼蟲期的表達(dá)水平可以忽略不計(jì)（P<0.05）。研究結(jié)果為深入理解廣聚螢葉甲生殖作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

廣聚螢葉甲;?卵黃原蛋白基因;?克隆;?序列分析;?表達(dá)水平

中圖分類號：

S?433.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023141

Identification?and?expression?analysis?of?Vg?genes?in?Ophraella?communa

ZHOU?Yongping1，2，?HUANG?Yufeng3，?ZHANG?Yan2，?MA?Chao2，?CHEN?Hongsong2，4，GUI?Furong1*，?ZHOU?Zhongshi2，4*

（1.?College?of?Plant?Protection，?Yunnan?Agricultural?University，?Kunming?650201，?China;?2.?Institute?of?Plant

Protection，?Chinese?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Beijing?100193，?China;?3.?Livestock?and?Veterinary

Station?in?Lixian?County，?Longnan?City，?Gansu?Province，?Longnan?742200，??China;?4.?Institute?of?Plant

Protection?Research?Institute，?Guangxi?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Nanning?530007，?China）

Abstract

Vitellogenin?（Vg）?as?a?female?multifunctional?reproductive?protein，?which?plays?an?important?role?in?vitellogenesis.?This?study?aimed?to?clarify?the?potential?role?of?the?Vg?gene?in?the?reproductive?process?of?Ophraella?communa.?Three?Vg?genes?were?cloned?by?RTPCR，?and?the?open?reading?frames?of?OcVg1，?OcVg2，?and?OcVg3?were?5?310，?5?322，?and?5?298?bp，?respectively，?encoding?1?768，?1?772，?and?1?764?amino?acids.?OcVg?proteins?have?the?conserved?domain?of?the?LLTP?superfamily，?including?LPD_N，?DUF1943，?and?VWD?domains.?Polyserine?domains?located?at?the?Nterminal，?with?the?conserved?GL/ICG，?R/KXXR/K，?DGXR?motifs，?and?Cterminal?cysteine?residues.?The?OcVgs?clustered?with?those?of?Coleoptera?insects?by?constructing?a?phylogenetic?tree.?Spatiotemporal?expression?analysis?showed?that?the?expression?dynamics?of?OcVg?genes?in?different?tissues?and?developmental?stages?were?similar，?with?high?specificity?in?fat?bodies?（P<0.05）.?The?expression?level?was?the?highest?at?the?sexual?maturity?stage?after?adult?emergence，?and?the?expression?level?at?the?larval?stage?could?be?ignored?（P<0.05）.?The?results?of?this?study?lay?the?foundation?for?a?deeper?understanding?of?the?molecular?mechanism?of?the?reproductive?function?of?O.?communa.

Key?words

Ophraella?communa;?vitellogenin?gene;?clone;?sequence?analysis;?expression?level

卵黃發(fā)生是昆蟲生殖調(diào)控的先決條件，包括產(chǎn)卵前后的胚胎和子代發(fā)育的維持［12］。在所有卵生動物中，雌性生殖成功的關(guān)鍵取決于卵黃原蛋白（vitellogenin，Vg）的生物合成及被發(fā)育的卵母細(xì)胞所攝取和吸收的情況［35］。Vg蛋白主要在脂肪體中合成，分泌到血淋巴中，通過卵泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞間隙轉(zhuǎn)運(yùn)到卵母細(xì)胞膜上，然后通過卵黃原蛋白受體（vitellogenin?receptor，VgR）介導(dǎo)的內(nèi)吞作用運(yùn)輸?shù)铰殉?，被發(fā)育的卵母細(xì)胞選擇性攝?。?，6］，最終經(jīng)修飾、剪切、加工和蛋白酶水解后以卵黃蛋白（vitellin，Vn）晶體的形式沉積在卵子內(nèi)部，為發(fā)育的卵母細(xì)胞及受精卵提供不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)，包括氨基酸、脂肪、碳水化合物、磷、硫和其他微量元素［7］。在大多數(shù)昆蟲中，Vg作為卵黃蛋白Vn?的前體蛋白，占可溶性卵黃蛋白的60%～90%，其氨基酸大約占84%?（主要是谷氨酸和天冬氨酸），糖類占1%～14%?（主要是寡聚甘露糖）以及占比不到16%的脂類物質(zhì)［3，89］。Vg作為卵黃蛋白中含量最為豐富的一類蛋白而被廣泛研究。在卵黃發(fā)生和卵子形成過程中的大部分能源物質(zhì)來源于Vg，也就是說，Vg蛋白在雌性生殖過程扮演著不可替代的角色。

Vg是一類同源性較高的大分子磷酸化糖脂復(fù)合蛋白，在大脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（LLTP）超家族中占主導(dǎo)地位，其伴隨著龐大的基因數(shù)目［3］。研究表明，Vg蛋白一般由6～7?kb的mRNA轉(zhuǎn)錄本所編碼，完整的開放閱讀框（open?reading?frame，ORF）大約為1?800個氨基酸，等電點(diǎn)（PI）為6.1～6.3，分子量為200～700?kD，前體蛋白被糖基化、磷酸化、蛋白裂解、脂化和硫酸化等修飾，水解為由1～4個亞基組成的天然卵黃原蛋白，包括一個分子量140～180?kD的大亞基和一個40～60?kD的小亞基［3，1011］。目前，已有7個目50多種昆蟲的Vg基因序列被克隆，主要集中在鱗翅目、雙翅目、膜翅目和半翅目［1213］。通常來說，Vg蛋白一級結(jié)構(gòu)包含幾個保守的結(jié)構(gòu)域或氨基酸基序（motif），如信號肽序列，多位于N端的多聚絲氨酸區(qū)（polyserine?domains），特殊功能的GL/ICG、R/KXXR/K、DGXR基序和C端的9個半胱氨酸殘基［3，1215］。此外，Vg蛋白還具有典型的結(jié)構(gòu)域特征，包括保守的N端脂質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域（lipid?protein?Nterminal?domain，LPD_N）、未知功能的DUF1943（domain?of?unknown?function，DUF1943）和血管性血友病因子D型結(jié)構(gòu)域（Von?Willebrand?factor?type?D?domains，VWD）［6，16］。在所有卵生動物中，Vg蛋白的定量通常被認(rèn)為是評估雌性生育能力的常規(guī)手段［17］。

眾所周知，豚草的入侵對我國農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)、農(nóng)業(yè)牧業(yè)生產(chǎn)和生物多樣性產(chǎn)生巨大影響，并且導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，引起花粉過敏癥（枯草熱）以及一些呼吸系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重威脅著人類的身心健康［1822］。隨著綠色植保概念的提出，天敵昆蟲的商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注。廣聚螢葉甲作為重大入侵雜草豚草Ambrosia?artemisiifolia的一種重要的專食性天敵，其高繁殖能力和世代重疊多是有效控制豚草的關(guān)鍵要素，其幼蟲和成蟲取食豚草葉片或幼嫩組織［19］，可將整株植物吃光吃凈呈現(xiàn)火燒狀，達(dá)到顯著的控制豚草效果［2324］。Vg作為雌性多功能生殖蛋白，為發(fā)育的卵母細(xì)胞和胚胎生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，其含量的多少將直接影響雌性的繁殖水平［6］。因此，本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合RTPCR技術(shù)克隆獲得了廣聚螢葉甲3個Vg基因，通過實(shí)時熒光定量PCR（RTqPCR）檢測了OcVgs基因在不同發(fā)育階段和組織中的mRNA表達(dá)水平，旨在為探究廣聚螢葉甲Vg基因的生物學(xué)功能和作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。本研究填補(bǔ)了廣聚螢葉甲Vg基因的研究空白，同時為優(yōu)化該葉甲的繁殖能力奠定了良好基礎(chǔ)，對保護(hù)和更好地利用我國廣聚螢葉甲資源具有重要意義。

1?材料與方法

1.1?供試寄主和蟲源

廣聚螢葉甲成蟲采自廣西壯族自治區(qū)來賓市金雞鎮(zhèn)（109°23′E，23°43′N），帶回實(shí)驗(yàn)室置于室內(nèi)飼養(yǎng)，條件設(shè)置：溫度（26±1）℃，相對濕度（70±5）%，光周期L∥D=14?h∥10?h［28］。

1.2?總RNA提取與cDNA鏈合成

使用TRIzol（美國Invitrogen公司）法提取廣聚螢葉甲的總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品的完整性，用紫外分光光度計(jì)Nanophoto?meter?P330s?（IMPLEN，?Germany）檢測RNA濃度和質(zhì)量，A260/A280在1.9～2.1之間，A260/A230在1.8～2.2之間時可用于下一步試驗(yàn)。以1?μg?RNA樣品為模板，采用Super?Script?FirstStrand?Synthesis?System?（北京全式金公司）?合成cDNA第一鏈：10?μL?2×TS?Reaction?Mix，1?μL?Olig（dT）18，1?μL?TransScript?RT/RI?Enzyme?Mix，1?μg?RNA，1?μL?gDNA?Remover，補(bǔ)齊ddH2O至20?μL，混合液用移液槍輕輕吹打數(shù)次混合均勻，放入PCR儀中42℃?30?min，85℃?5?s。合成好的cDNA存于－20℃冰箱備用。

1.3?廣聚螢葉甲Vg基因的克隆

根據(jù)廣聚螢葉甲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選到的Vg基因unigene序列（未發(fā)表），利用Primer?Premier?5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：TransStart?Taq?DNA?Polymerase?0.5?μL，?上、下游引物各1?μL，dNTPs?1?μL，10×PCR?buffer?2.5?μL，模板cDNA?0.5?μL，ddH2O補(bǔ)齊至25?μL。PCR反應(yīng)程序：94℃變性5?min;94℃變性30?s，55℃退火30?s，72℃延伸?1?min，35個循環(huán);72℃?10?min。目的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用AxyPrep?DNA凝膠回收試劑盒（美國Axygen公司）進(jìn)行產(chǎn)物回收純化，并測定其濃度;將純化產(chǎn)物連接到克隆載體pEASYT3克隆載體（北京全式金公司）上，連接體系為：1?μL?pEASYT3?Cloning?Vector和4?μL純化產(chǎn)物混合，室溫連接，并轉(zhuǎn)化至Trans1T1感受態(tài)細(xì)胞中，待細(xì)胞復(fù)蘇后，取200?μL涂在含有氨芐抗生素的培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。最后，通過藍(lán)白斑篩選和菌液PCR驗(yàn)證獲得陽性克隆，并把菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4?生物信息學(xué)分析

使用DNAman軟件對測序結(jié)果進(jìn)行校正和剪接，獲得Vg基因的完整序列;利用網(wǎng)站（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf）查找開放閱讀框（ORF），并用EditSeq軟件將ORF核苷酸序列推導(dǎo)為氨基酸序列。使用SMART在線網(wǎng)站（http：∥smart.embl.de/）預(yù)測蛋白的結(jié)構(gòu)域，利用DNAman軟件進(jìn)行氨基酸序列多重比較，對Vg蛋白序列進(jìn)行BLAST，使用MEGA?7.0軟件鄰接法（neiighborjoining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用SignalP?（https：∥services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP5.0）預(yù)測蛋白信號肽，在線軟件（https：∥web.expasy.org/protparam/）計(jì)算蛋白的相對分子量（Mr）、等電點(diǎn)（PI），使用TMHMMServerv?（https：∥services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM2.0）進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)分析。在線網(wǎng)站（https：∥web.expasy.org/protscale）分析卵黃原蛋白的疏水性，使用軟件（https：∥services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetNGlyc1.0）分析糖基化位點(diǎn)及NetPhos3.1分析磷酸化位點(diǎn)。利用SWISSMODEL（https：∥swissmodel.expasy.org/）預(yù)測蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型。最后，將廣聚螢葉甲的3個Vg基因序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中。

1.5?OcVgs基因的時空表達(dá)分析

為明確廣聚螢葉甲Vg基因在不同組織和發(fā)育階段的表達(dá)水平，收集卵150粒、幼蟲（1齡30頭、2齡20頭和3齡8頭）、蛹（2日齡蛹和老熟蛹）和成蟲（性成熟前后的雌、雄成蟲）各5頭。在磷酸鹽緩沖液（PBS，pH?7.4）中解剖羽化后5日齡雌蟲的不同組織，包括頭、胸、翅、腸道、卵巢和脂肪體。每組樣品共解剖3～5頭雌蟲，每組樣品4個生物學(xué)重復(fù)，取完用液氮速凍，存于-80℃冰箱。

根據(jù)設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以各樣品的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR（RTqPCR）。使用廣聚螢葉甲體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的RPL4基因?yàn)閮?nèi)參基因［25］。利用2×TransStartTipGreen?qPCR?SuperMix染料的熒光標(biāo)記法檢測基因的表達(dá)量，反應(yīng)體系：2×TransStartTipGreen?qPCR?SuperMix?10?μL、上下游引物各0.4?μL、cDNA模板?1?μL、ddH2O?8.2?μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30?s;94℃變性5?s，60℃退火30?s，40個循環(huán)。

1.6?數(shù)據(jù)處理

采用2-ΔΔCT計(jì)算法對目的基因的相對表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算，ΔΔCT=（CT試驗(yàn)組目標(biāo)基因-CT試驗(yàn)組內(nèi)參基因）-（CT對照組目標(biāo)基因-CT對照組內(nèi)參基因）。采用SPSS?19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（Oneway?ANOVA）和Duncan氏多重比較，顯著性水平為0.05，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示，并用軟件GraphPad?Prism?6.0作圖分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?廣聚螢葉甲Vg基因的克隆與鑒定

利用設(shè)計(jì)的Vg基因特異性引物進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增，得到了廣聚螢葉甲3個Vg基因的CDS序列，分別命名為OcVg1、OcVg2和OcVg3，

GenBank登錄號分別為OQ164771、OQ818861和OQ818862，序列長度分別為5?310、5?322?bp和5?298?bp?（圖1），

2.2?OcVgs序列分析

生物信息學(xué)分析表明，OcVgs與其他昆蟲的Vg蛋白的理化性質(zhì)相似。其OcVg1、OcVg2和OcVg3的蛋白質(zhì)分子量分別為202.64、203.21?kD和202.48?kD;其氨基酸的等電點(diǎn)（PI）分別為5.50、6.37和5.96。利用在線SMART網(wǎng)站進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測，如圖2所示，廣聚螢葉甲Vg蛋白屬于脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋（large?lipid?transfer?protein，LLTP）超家族，具有LLTP家族3個高度保守的結(jié)構(gòu)域，包括LPD_N、DUF1943和VWD結(jié)構(gòu)域。

多重序列比對發(fā)現(xiàn)（圖3），OcVgs含有幾個保守氨基酸基序、殘基和切割位點(diǎn)，如位于N端的多聚絲氨酸區(qū)（polyserine?domains），特殊功能的GL/ICG、R/KXXR/K、DGXR基序和C端半胱氨酸殘基等。如表2所示，通過SignalP?5.0?Server信號肽預(yù)測，OcVgs蛋白N端均含一段氨基酸殘基為信號肽序列。OcVgs具有一定的親水性，無明顯跨膜區(qū)，不屬于膜蛋白，推測該蛋白需要其受體VgR的介導(dǎo)作用。OcVgs氨基酸序列含有豐富的糖基化和磷酸化位點(diǎn)，推測該蛋白的糖基化和磷酸化的修飾在蛋白功能行使中發(fā)揮重要角色。利用SwissModel軟件進(jìn)行同源模型建模，預(yù)測了OcVgs蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)（圖4）。

2.3?OcVgs系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA?7.0軟件中鄰接法（neighborjoining，NJ）對不同目昆蟲的Vg氨基酸序列進(jìn)行多重比較，并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹。結(jié)果如圖5所示，OcVg1、OcVg2、OcVg3與鞘翅目昆蟲親緣關(guān)系最近，整齊地聚集在一支，與鞘翅目昆蟲玉米根螢葉甲Diabrotica?virgifera?virgifera的相似性較高。

2.4?OcVgs基因的時空表達(dá)分析

利用RTqPCR技術(shù)對OcVgs基因在不同組織的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，廣聚螢葉甲的3個Vg基因在不同組織部位的表達(dá)模式相似。3個OcVgs基因在雌成蟲體內(nèi)的脂肪體中均特異性高表達(dá)，顯著高于其他組織，在頭、翅、腸道組織中的表達(dá)水平極其微弱。OcVg1基因在脂肪體的mRNA轉(zhuǎn)錄水平高于其他組織400倍左右;同樣，OcVg2基因在脂肪體的mRNA轉(zhuǎn)錄水平高于其他組織600倍左右;而OcVg3基因在脂肪體的mRNA轉(zhuǎn)錄水平高于其他組織上千倍（圖6）。

同樣，OcVg1、OcVg2和OcVg3基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)動態(tài)相似（圖7），其廣聚螢葉甲的3個Vg基因的表達(dá)趨向于成蟲羽化后開始高表達(dá)，特別是性成熟之后;在幼蟲期和化蛹初期表達(dá)量極低，僅為雌成蟲羽化后表達(dá)量的千分之幾（P<0.05）。

3?結(jié)論與討論

昆蟲卵黃發(fā)生內(nèi)在機(jī)理和調(diào)控機(jī)制是昆蟲生理學(xué)和生物化學(xué)的一個重要研究領(lǐng)域［26］。在卵生動物中，繁殖的成功與否主要取決于卵黃原蛋白的生物合成和積累［31］，其胚胎的生長發(fā)育主要依靠發(fā)育中的卵母細(xì)胞積累大量的卵黃蛋白提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)［3，67］。Vg的合成和攝取是昆蟲生殖調(diào)控過程中的關(guān)鍵事件［1011］。1954年，Telfer等［28］首次在天蠶蛾Hyalophora?cecropia的血淋巴中發(fā)現(xiàn)了一種雌性特異蛋白參與卵黃的形成，后來Bell等［29］將其命名為卵黃原蛋白?；蚪M測序技術(shù)和分子生物學(xué)的快速發(fā)展，極大地促進(jìn)了昆蟲學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展研究。在卵黃發(fā)生過程中，Vg合成及被卵母細(xì)胞所攝取是保證雌性成功繁殖的先決條件［5，11］。在大多數(shù)卵生動物中，Vg蛋白作為雌性多功能生殖蛋白，最基本的功能就是為發(fā)育的卵母細(xì)胞和組織提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)［3031］。

迄今為止，Vg基因在許多昆蟲物種中被克隆和鑒定，并且它們的數(shù)量在不同物種間有所不同，含有多個基因拷貝數(shù)。在本文中，我們克隆和鑒定得到了廣聚螢葉甲的3個Vg基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析以及OcVgs基因的時空表達(dá)分析。OcVgs蛋白含有LLTP家族的典型結(jié)構(gòu)域，包括LPD_N、DUF1943和VWD結(jié)構(gòu)域［67，1213］;含有幾個保守的結(jié)構(gòu)域或氨基酸基序，如多聚絲氨酸區(qū)（polyserine?domains）、GL/ICG、R/KXXR/K、DGXR和C端半胱氨酸等［3，68，11］，這些結(jié)果表明Vg蛋白在物種的進(jìn)化上高度保守。Vg作為多效性蛋白，其保守的位點(diǎn)、基序和不同的剪切形式能發(fā)揮著特定的生物學(xué)功能［32］。SfVg序列包含RXXR的裂解位點(diǎn)，在Vg初級蛋白的成熟過程中發(fā)揮重要作用［15］。Vg蛋白C末端與脂質(zhì)的攝取、運(yùn)輸和傳遞有關(guān)［33］。Vg蛋白N端具有重要的蛋白識別、修飾區(qū)域，其多聚絲氨酸區(qū)域是昆蟲Vg最顯著的特征之一［34］。

大量研究表明，不同物種間的Vg基因個數(shù)存在差異［3，14］。例如：西方蜜蜂Apis?mellifera中有一個Vg基因［33］，秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis?elegans中高達(dá)6個Vg基因［35］，蓮草直胸跳甲Agasicles?hygrophila、褐飛虱Nilaparvata?lugens均有3個Vg基因［12，36］。隨著長期的適應(yīng)進(jìn)化，選擇突變和基因漂流的壓力，導(dǎo)致Vg衍化出新的功能。因此，昆蟲中Vg基因數(shù)量的變化可能反映了進(jìn)化選擇和適應(yīng)環(huán)境的策略［6］。許多昆蟲可多個Vg基因共同作用，以確保提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì)供卵母細(xì)胞的生長和發(fā)育，強(qiáng)大的繁殖能力以更好地適應(yīng)環(huán)境。眾所周知，Vg和VgR對昆蟲的成功繁殖至關(guān)重要，以Vg分子標(biāo)記評估繁殖力可作為一種常規(guī)手段和方法［36］。在本文中，我們從廣聚螢葉甲中成功獲得了Vg基因的3個轉(zhuǎn)錄本，可能多個基因相互作用能促進(jìn)卵黃發(fā)生，為發(fā)育的卵母細(xì)胞提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì)。然后，這3個Vg基因在廣聚螢葉甲生殖過程中是否具有相同的生理功能，還有待進(jìn)一步深入研究。

本研究通過RTPCR技術(shù)克隆得到了廣聚螢葉甲的3個Vg基因。一方面，填補(bǔ)了廣聚螢葉甲Vg基因的研究空白;另一方面，為深入理解廣聚螢葉甲的生殖分子機(jī)制和適合度產(chǎn)生的內(nèi)在機(jī)制奠定基礎(chǔ)，對保護(hù)和利用我國廣聚螢葉甲資源具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

［1］?SWEVERS?L.?Vitellogenesis?and?postvitellogenic?maturation?of?the?insect?ovarian?follicle?［J］.?Gill，?2005，?1：?87155.

［2］?JING?Yupu，?AN?Hongli，?ZHANG?Shanjing，?et?al.?Protein?kinase?C?mediates?juvenile?hormone?dependent?phosphorylation?of?Na+/K+ATPase?to?induce?ovarian?follicular?patency?for?yolk?protein?uptake?［J］.?Journal?of?Biological?Chemistry，?2018，?293（52）：?2011220122.

［3］?TUFAIL?M，?TAKEDA?M.?Molecular?characteristics?of?insect?vitellogenins?［J］.?Journal?of?Insect?Physiology，?2008，?54：?14471458.

［4］?ZHU?Shiming，?LIU?Fangfang，?ZENG?Huanchao，?et?al.?Insulin/IGF?signaling?and?TORC1?promote?vitellogenesis?via?inducing?juvenile?hormone?biosynthesis?in?the?American?cockroach?［J/OL］.?Development，?2020，?147（20）：?188805.?DOI：?10.1242/dev.188805.

［5］?ROY?S，?SAHA?T?T，?ZOU?Z，?et?al.?Regulatory?pathways?controlling?female?insect?reproduction?［J］.?Annual?Review?of?Entomology，?2018，?63：?489511.

［6］?WU?Zhongxia，?YANG?Libin，?HE?Qiongjie，?et?al.?Regulatory?mechanisms?of?vitellogenesis?in?insects?［J/OL］.?Frontiers?in?Cell?and?Developmental?Biology，?2021，?8：?593613.?DOI：?10.3389/fcell.2020.593613.

［7］?馬杰，?張士璀.?卵黃蛋白的結(jié)構(gòu)和功能［J］.?魯東大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），?2012，?28（3）：?252260.

［8］?董勝張，?葉恭銀，?劉朝良.?昆蟲卵黃蛋白分子進(jìn)化的研究進(jìn)展［J］.?昆蟲學(xué)報(bào)，?2008，?51（11）：?11961209.

［9］?VEERANA?M，?KUBERA?A，?NGERNSIRI?L.?Analysis?of?the?vitellogenin?gene?of?rice?moth，?Corcyra?cephalonica?Stainton?［J］.?Archives?of?Insect?Biochemistry?and?Physiology，?2014，?87（3）：?126147.

［10］戈林泉，?吳進(jìn)才.?昆蟲卵黃蛋白及其激素調(diào)控的研究進(jìn)展［J］.?昆蟲知識，?2010，?47（2）：?236246.

［11］UPADHYAY?S?K，?SINGH?H，?DISIT?S，?et?al.?Molecular?characterization?of?vitellogenin?and?vitellogenin?receptor?of?Bemisia?tabaci?［J/OL］.?PLoS?ONE，?2016，?11（5）：?e0155306.?DOI：?10.1371/journal.pone.0155306.

［12］SHEN?Yan，?CHEN?Yuanzhi，?LOU?Yihan，?et?al.?Vitellogenin?and?vitellogeninlike?genes?in?the?brown?planthopper?［J/OL］.?Frontiers?in?Physiology，?2019，?10：?1181.?DOI：?10.3389/fphys.2019.01181.

［13］梁慧芳，?曾凡榮，?毛建軍.?大眼長蝽卵黃原蛋白基因克隆、序列分析及表達(dá)研究［J］.?生物技術(shù)通報(bào)，?2015，?31（10）：?149156.

［14］LEE?J?M，?HATAKEYAMA?M，?NISHIMORI?Y，?et?al.?Vitellogenin?of?the?cicada?Graptopsaltria?nigrofuscata?（Homoptera）：?analysis?of?its?primary?structure?［J］.?Insect?Biochemistry?and?Molecular?Biology，?2000，?30（1）：?17.

［15］SAPPINGTON?T?W，?RAIKHEL?A?S.?Molecular?characteristics?of?insect?vitellogenins?and?vitellogenin?receptors?［J］.?Insect?Biochemistry?and?Molecular?Biology，?1998，?28（5/6）：?277300.

［16］TREWITT?P?M，?HEILMANN?L?J，?DEGRUGILLIER?S?S，?et?al.?The?boll?weevil?vitellogenin?gene：?nucleotide?sequence，?structure，?and?evolutionary?relationship?to?nematode?and?vertebrate?vitellogenin?genes?［J］.?Journal?of?Molecular?Evolution，?1992，?34（6）：?478492.

［17］SUN?Yang，?XIAO?Liubin，?CAO?Guangchun，?et?al.?Molecular?characterisation?of?the?vitellogenin?gene?（AlVg）?and?its?expression?after?Apolygus?lucorum?had?fed?on?different?hosts?［J］.?Pest?Management?Science，?2016，?72（9）：?17431751.

［18］萬方浩.?重要農(nóng)林外來入侵物種的生物學(xué)與控制［M］.?北京：?科學(xué)出版社，?2005.

［19］CARDARELLI?E，?MUSACCHIO?A，?MONTAGNANI?C，?et?al.?Ambrosia?artemisiifolia?control?in?agricultural?areas：?Effect?of?grassland?seeding?and?herbivory?by?the?exotic?leaf?beetle?Ophraella?communa?［J］.?NeoBiota，?2018，?38：?122.

［20］王建軍，?趙寶玉，?李明濤，?等.?生態(tài)入侵植物豚草及其綜合防治［J］.?草業(yè)科學(xué)，?2006，?23（4）：?7175.

［21］ZHOU?Zhongshi，?WAN?Fanghao，?GUO?Jianying.?Common?ragweed?Ambrosia?artemisiifolia?L.，?in?biological?invasions?and?its?management?in?China?［M］.?New?York：?Springer，?2017：?99109.

［22］周忠實(shí)，?郭建英，?萬方浩，?等.?豚草防治措施綜合評價［J］.?應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，?2008，?19（9）：?19171924.

［23］孟玲，?李保平.?新近傳入我國大陸取食豚草的廣聚螢葉甲［J］.?中國生物防治，?2005，?21（2）：?6569.

［24］ZHOU?Zhongshi，?GUO?Jianying，?CHEN?Hongsong，?et?al.?Effects?of?temperature?on?survival，?development，?longevity?and?fecundity?of?Ophraella?communa?（Coleoptera：?Chrysomelidae），?a?biological?control?agent?against?invasive?ragweed，?Ambrosia?artemisiifolia?L.?（Asterales：?Asteraceae）?［J］.?Environmental?Entomology，?2010，?39（3）：?10211027.

［25］ZHANG?Yan，?CHEN?Jiqiang，?CHEN?Guangmei，?et?al.?Identification?and?validation?of?reference?genes?for?quantitative?gene?expression?analysis?in?Ophraella?communa?［J/OL］.?Frontiers?in?Physiology，?2020，?11：?355.?DOI：?10.3389/fphys.2020.00355.

［26］龔和，?翟啟慧.?昆蟲卵黃原蛋白和卵黃發(fā)生［J］.?昆蟲學(xué)報(bào)，?1979，?22（2）：?219236.

［27］HUSAIN?M，?RASOOL?K?G，?TUFAIL?M，?et?al.?Molecular?characterization，?expression?pattern?and?RNAimediated?silencing?of?vitellogenin?receptor?gene?in?almond?moth，?Cadra?cautella?［J］.?Insect?Molecular?Biology，?2020，?29（4）：?417430.

［28］TELFER?W?H.?Immunological?studies?of?insect?metamorphosis.?II.?The?role?of?a?sexlimited?blood?protein?in?egg?formation?by?the?Cecropia?silkworm?［J］.?Journal?of?General?Physiology，?1954，?37（4）：?539558.

［29］BELL?W?J，?TELFER?W?H，?PAN?L.?Vitellogenic?blood?protein?synthesis?by?insect?fat?body?［J］.?Science，?1969，?25（3891）：?393394.

［30］HU?Kui，?TIAN?Ping，?TANG?Yan，?et?al.?Molecular?characterization?of?vitellogenin?and?its?receptor?in?Sogatella?furcifera，?and?their?function?in?oocyte?maturation?［J/OL］.?Frontiers?in?Physiology，?2019，?10：?1532.?DOI：?10.3389/fphys.2019.01532.

［31］HAN?Shipeng，?WANG?Da，?SONG?Peng，?et?al.?Molecular?characterization?of?vitellogenin?and?its?receptor?in?Spodoptera?frugiperda?（J.?E.?Smith，?1797），?and?their?function?in?reproduction?of?female?［J/OL］.?International?Journal?of?Molecular?Sciences，?2022，?23（19）：11972.?DOI：?10.3390/ijms231911972.

［32］霍巖，?陳曉英，?方榮祥，?等.?卵黃蛋白原的產(chǎn)生及其非營養(yǎng)功能的研究現(xiàn)狀［J］.?生物技術(shù)通報(bào)，?2018，?34（2）：?6673.

［33］LEIPART?V，?HALSKAU?，?AMDAM?G?V.?How?honey?bee?vitellogenin?holds?lipid?cargo：?a?role?for?the?Cterminal?［J/OL］.?Frontiers?in?Molecular?Biosciences，?2022，?9：?865194.?DOI：?10.3389/fmolb.2022.865194.

［34］YANO?K，?SAKURAI?M?T，?IZUMI?S，?et?al.?Vitellogenin?gene?of?the?silkworm，?Bombyx?mori：?structure?and?sexdependent?expression?［J］.?FEBS?Letters，?1994，?356：?207211.

［35］PEREZ?M?F，?LEHNER?B.?Vitellogeninsyolk?gene?function?and?regulation?in?Caenorhabditis?elegans?［J/OL］.?Frontiers?in?Physiology，?2019，?10：?1067.?DOI：?10.3389/fphys.2019.01067.

［36］ZHANG?Tao，?ZHANG?Guocai，?ZENG?F，?et?al.?Molecular?cloning?of?the?vitellogenin?gene?and?the?effects?of?vitellogenin?protein?expression?on?the?physiology?of?Harmonia?axyridis?（Coleoptera：?Coccinellidae）?［J/OL］.?Scientific?Reports，?2017，?7（1）：?13926.?DOI：?10.1038/s41598017143393.

（責(zé)任編輯：田?喆）