孟 燁，昝麗霞，2，3，張文夷，高 寧，杜小平，4

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省四主體一聯(lián)合茶產(chǎn)業(yè)校企聯(lián)合研究中心，陜西 漢中 723000；3.陜西理工大學(xué)茶葉種植與加工研究所，陜西 漢中 723000；4.安康市富硒產(chǎn)品研發(fā)中心，陜西 安康 725028）

生物活性肽Bp（Bioactive peptides）是由2～20 個氨基酸組成的序列，分子量＜6 kDa，是源于蛋白質(zhì)的功能性化合物[1]，其內(nèi)含有人體自身無法合成的8種氨基酸，比例接近于FAO/WHO 的推薦模式，可供人體直接所吸收，具有抗氧化、降血壓、降血脂、增強免疫力等功能，有助于維持機體健康和預(yù)防慢性疾病[2]。Bp 來源主要分為內(nèi)源性Bp 和外源性Bp，內(nèi)源性Bp 是由組織內(nèi)特異性蛋白水解酶作用于各種功能性組織蛋白而產(chǎn)生的，是許多哺乳動物調(diào)節(jié)系統(tǒng)的介質(zhì)；外源性Bp 是指人體以外的肽類物質(zhì)，主要從食物中獲取，在進入人體后先通過胃酸和胃蛋白酶將蛋白質(zhì)分解成片段，然后在小腸中進一步分解為氨基酸和2～6個殘基的寡肽，再經(jīng)特異的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進入小腸上皮細胞，從而釋放到血液中[3-4]。目前Bp 的制備方法有酶解法、微生物發(fā)酵法和化學(xué)水解法三大類，不同的制備方法得到的肽的純度、理化性質(zhì)和功能活性不同，其中酶法制備的多肽易被人體消化吸收，且生產(chǎn)條件溫和、易控制，因此最為常用。

食品加工行業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)品，如小麥經(jīng)加工制粉后的副產(chǎn)物麥麩、大豆制油后的豆粕或茶飲品加工后的茶渣等，這些副產(chǎn)物中都含有較高的膳食纖維、多糖和蛋白等功能成分，若將其當(dāng)成飼料或廢物處理，不僅資源浪費，還會對環(huán)境造成污染[5-7]，而利用酶解法可將食品加工行業(yè)的副產(chǎn)品制作成植物活性肽。因此，探討植物活性肽的制備技術(shù)十分重要。基于此，本文在介紹酶法制備植物活性肽傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，討論了酶法制備植物活性肽的技術(shù)改進，并對生物活性肽的生理活性研究最新進展進行了概述。

1 酶法制備植物活性肽的傳統(tǒng)方法

酶法水解是目前提取植物多肽最常用的方法，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，具有高效、安全和酶解過程可調(diào)控性的優(yōu)點。酶法水解常用的蛋白酶有堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等，不同活性位點的蛋白酶對酶解速率、產(chǎn)物的生理活性及穩(wěn)定性影響很大。如喬楊波等[8]用酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶分別對蠶豆蛋白進行酶解，發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶水解產(chǎn)物的得率最高、菠蘿蛋白酶的酶解產(chǎn)物具有良好的降血糖活性，而酸性蛋白酶的酶解產(chǎn)物具有良好的清除DPPH自由基效果。

酶法水解具體流程為原料處理、酶解反應(yīng)、分離純化和產(chǎn)品制備4步。原料處理是指清洗、破碎、浸泡等，目的是為了使材料成為更適合酶解的狀態(tài)；酶解反應(yīng)是酶解過程的核心，不同的材料都有其不同的酶解工藝，包括但不限于酶解溫度、時間、酶用量等，反應(yīng)結(jié)束要對其進行水浴滅酶處理；分離純化是酶解工藝的重要步驟,其目的是將酶解產(chǎn)物與原料分離開來，并去除雜質(zhì)；產(chǎn)品制備是將分離純化后的酶進行濃縮、干燥、包裝制成產(chǎn)品等。

在分離純化過程中，Wasana Wongngam 等[9]就用超濾、粒徑排除層析和反相層析分離玉米蛋白粉酶解產(chǎn)物，共發(fā)現(xiàn)了KLPPVGYP、QLVELLR、DLLGCS、AGCGAAVGTLQ、LSNPY、DPNTY 和LDDGAAKYPY 7 個新多肽。

2 酶法制備植物活性肽的技術(shù)改進

2.1 超聲輔助蛋白酶解

超聲波是指頻率高于人類能聽到的聲音頻率范圍的機械波，頻率＞20 kHz，輸出源通常是一個振動體，并將機械振動轉(zhuǎn)化為超聲波能量，這些超聲波能量以波的形式在液體、固體和氣體等不同介質(zhì)中傳播。在對水解材料進行超聲預(yù)處理或水解過程中使用高強度超聲時，超聲波的振動會通過影響液體中的氫鍵和疏水作用，間接地促使空化效應(yīng)的產(chǎn)生。這些空化效應(yīng)可能會進一步對蛋白質(zhì)的疏水相互作用產(chǎn)生影響，導(dǎo)致蛋白質(zhì)形態(tài)的改變，而這些改變可能更易于蛋白質(zhì)特定位點被水解酶識別和結(jié)合，從而促進蛋白質(zhì)的水解反應(yīng)。Shanfen Huang 等[10]在玉米蛋白粉酶解時，引入了發(fā)散型超聲和能量聚集型超聲預(yù)處理方法，發(fā)現(xiàn)用頻率為40 kHz 的發(fā)散型超聲預(yù)處理1 h 比能量聚集型超聲預(yù)處理得到的產(chǎn)物ACE 抑制活性更高，苦味肽濃度更低。陳妍等[11]采用超聲聯(lián)合堿性蛋白酶酶解豌豆蛋白，結(jié)果表明超聲處理增加了酶的速率常數(shù)，且產(chǎn)物具有較好的乳化活性和抗氧化活性。

2.2 微波輔助蛋白酶解

該法常常用于和蛋白酶一起提取植物多肽，當(dāng)微波輻射通過樣品中的溶劑時，水分子之間的摩擦和碰撞開始加劇，溶劑中的溫度迅速升高，熱能會傳遞到蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，其氫鍵、非共價鍵等結(jié)構(gòu)會受到熱能的影響發(fā)生破壞，易于蛋白質(zhì)裂解位點的暴露，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的快速分解[12]。于麗娜等[13]以冷榨花生蛋白粉為原料，優(yōu)化了微波輔助酶解提取α-葡萄糖苷酶抑制肽的工藝，結(jié)果表明在微波功率為1 000 W、底物濃度9.77%、加酶量0.94%、溫度59 ℃、pH 值為9.0 的條件下α-葡萄糖苷酶抑制率最高。Tian Shuangqi 等研究了微波輔助酶解制備的小麥胚芽多肽的理化性質(zhì)和功能特性，表明微波輔助提高了體系反應(yīng)速率，增加了多肽的產(chǎn)率和溶解度，且具有清除自由基的抗氧化功能。

2.3 高靜水壓輔助蛋白酶解

高靜水壓（HHP）輔助制備Bp，該法涉及對裝載液體或固體食品的軟包裝材料施加適宜壓力，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)展開，暴露出更多的活性位點，從而促進蛋白質(zhì)的水解過程[14]。然而，加壓和減壓過程中會引發(fā)變形和復(fù)性等復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，這些反應(yīng)可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集或影響酶的活性和水解能力，而不能產(chǎn)生水解產(chǎn)物。Yu XinXin 等[15]在高壓靜水處理乳清蛋白對其結(jié)構(gòu)的影響研究中就很好的證實了這一點，研究表明低壓下表面游離SH 含量沒有明顯變化，壓力上升到400～600 MPa時，表面游離SH 含量急劇增加，而在壓力超過300 MPa時，總游離SH 含量顯著下降，這說明了HHP 處理誘導(dǎo)的乳清蛋白結(jié)構(gòu)改變可能涉及多種變性機制，包括展開和聚集。因此，HHP 參數(shù)及酶種類特性的不同都會對蛋白的水解度、Bp 的分子量分布極其功能特性具有一定影響。Muhammad Amer Nazir等[16]在不同高壓靜水條件下用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和Alcalase 制備甘薯血管緊張素I 轉(zhuǎn)換酶抑制肽，在MW＜3 kDa 的肽段中，100 MPa 下Alcalase 制備的多肽比例最高，并從中鑒定出了5 個具有良好ACE 抑制活性的肽段。由于用HHP輔助蛋白酶解不需要使用高溫或有機溶劑等對環(huán)境有害的條件，降低了生產(chǎn)成本和廢物產(chǎn)生。已經(jīng)發(fā)展為一種新穎、有效、環(huán)保的生物活性肽制備技術(shù)。

2.4 脈沖電場輔助蛋白酶解

脈沖電場輔助提取Bp 需要對樣品施加短時高強度的電場，使細胞膜發(fā)生電穿孔，促進細胞內(nèi)外物質(zhì)的交換，包括酶的進入和目標(biāo)生物活性肽的釋放。同時極化蛋白質(zhì)分子、破壞蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)中的非共價鍵來改變蛋白的構(gòu)象，增強生物活性肽的產(chǎn)生[17]。脈沖電場參數(shù)的選擇會直接影響到電場對細胞膜的作用強度和持續(xù)時間，進而影響生物活性肽的釋放和提取效果。適當(dāng)選擇和優(yōu)化脈沖電場參數(shù)可以在不損害樣品的情況下提高生物活性肽的提取效率并增強多肽的活性。Zhang Shuyu 等[18]從松子蛋白中提取了RGAVLH 多肽，用脈沖電場處理松子肽RGAVLH，并與未處理的RGAVLH 相比，RGAVLH 的β-折疊結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，暴露了活性位點，從而提高了免疫調(diào)節(jié)活性。Wang Ke等[19]以抗氧化活性為指標(biāo)用響應(yīng)面優(yōu)化了脈沖電場處理10～30 kDa玉米肽的工藝條件，在電場強度15 kV/cm，脈沖頻率為2 000 Hz的條件下，樣品的結(jié)構(gòu)和官能團都發(fā)生了改變，抗氧化活性提高了32.1%。

3 生物活性肽的生理活性

3.1 抗氧化

人體在代謝過程中會產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，活性氧的過量產(chǎn)生或清除能力不足可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激的累積，進而引發(fā)炎癥、細胞損傷、組織衰老和器官功能下降。目前，抗氧化劑能在一定程度上幫助中和活性氧并減少氧化應(yīng)激的損害，但長期或過量使用抗氧化劑會帶來一些其他潛在危害。而生物活性肽中的氨基酸殘基能夠捕捉自由基，穩(wěn)定其電子，從而保護細胞免受氧化損傷，因此，抗氧化肽作為天然抗氧化劑因其安全性高、吸收好、來源廣泛而備受關(guān)注。

Shi Hui 等[20]從牛蒡中分離鑒定出了D2-G1S-1 和G2-G1S-2 兩條多肽，均表現(xiàn)出強大的抗氧化活性，將其在秀麗隱桿線蟲進行體內(nèi)實驗，結(jié)果表明這兩條肽段均能在不以降低生物體生長為代價的前提下延長氧化應(yīng)激抗性，減少脂肪、ROS 和脂褐素的積累，并能通過調(diào)節(jié)IGF-1 信號延長線蟲的壽命。李琳等[21]研究了英國紅蕓豆抗氧化肽組分（BRKBPAPC）在斑馬魚體內(nèi)的抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)實驗組斑馬魚體內(nèi)的CAT、SOD 等多種抗氧化活性酶活力都得到了顯著提高。高劑量的BRKBPAPC 還對AAPH 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激起到到了改善作用。這些研究結(jié)果為抗氧化肽在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的開發(fā)研究提供了堅實的理論依據(jù)。

3.2 降血壓

近年來，心血管疾病的死亡率急劇上升，而高血壓期間血壓升高被確定為是與心血管疾病密切相關(guān)的因素，因此，改善高血壓成了降低心血管疾病相關(guān)死亡率的關(guān)鍵目標(biāo)。人體內(nèi)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RSA）和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS）是調(diào)節(jié)血壓的主要途徑，其中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）是高血壓發(fā)病的主要介質(zhì)，主要功能是將血管緊張素I（Ang-I）轉(zhuǎn)化為血管緊張素II（Ang-II）。Ang-II 能夠收縮血管，增加血管阻力，導(dǎo)致血壓升高[22]。而這些抗氧化肽肽對ACE 具有靶向作用，從而起到延緩血壓升高的作用。Lu Xiang等從大蒜蛋白中提取出兩條肽段（MGR 和HDCF）并在大鼠探究了兩條肽段對RAS 的調(diào)控機制，結(jié)果表明MGR 和HDCF 可以抑制ACE-AngII-AT1 軸的新生激活，從而減少Ang-I 和Ang-II 的過量產(chǎn)生和血壓升高。何海艷等[23]的研究表明，低于1 kDa 南瓜籽肽具有較好的降血壓活性，對大鼠灌胃6 h 后能有效的降低收縮壓21.42 mmHg左右，是一種良好的降血壓功能食品原料。

3.3 降血糖

降血糖肽與α-葡萄糖苷酶作用的實質(zhì)是通過多肽分子對多糖與酶之間的結(jié)合產(chǎn)生競爭，降低酶與多糖之間的結(jié)合率。從而減少葡萄糖的降解，達到降低血糖的作用。馮雪等人將提取的桑葉多肽喂養(yǎng)代謝紊亂的大鼠，通過測量血糖含量證實了其具有良好的降血糖效果。趙婉宏等[24]用以玉米蛋白粉為原料提取分離出的不同超濾組分的玉米肽喂養(yǎng)斑馬魚，在斑馬魚組織中BCA 含量、葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇、高低密度脂蛋白的含量后發(fā)現(xiàn)＜1 ku 的組分對糖尿病斑馬魚糖脂指標(biāo)改善效果最好，且該組分里具有調(diào)節(jié)血糖作用的亮氨酸和谷氨酸含量最高。

3.4 降尿酸

尿酸是人體內(nèi)嘌呤代謝的產(chǎn)物，含量過高會導(dǎo)致痛風(fēng)、腎臟疾病等各種疾病的發(fā)生。其產(chǎn)生機制是人體代謝產(chǎn)物中的次黃嘌呤被黃嘌呤氧化酶（XO）氧化為黃嘌呤，進而氧化為尿酸。降尿酸肽又稱為黃嘌呤氧化酶抑制肽，可以通過抑制XO 的活性來降低黃嘌呤的氧化速率，達到降低尿酸含量的目的。Li Qingyong等[25]從核桃粕中提取出了WMH 和DWMH 兩條新型降尿酸肽，DWMH 在大鼠體內(nèi)與別嘌呤醇具有相似的降尿酸作用，且兩條肽能促進腎功能衰竭的改善。降尿酸肽的相關(guān)研究起步較晚，且大多集中在魚類，植源性食品中降尿酸肽的相關(guān)研究更是少之又少，這也為該領(lǐng)域的研究提供了機遇和挑戰(zhàn)。

3.5 降血脂

血脂是機體代謝的能量來源，但當(dāng)機體代謝出現(xiàn)異常時會引起血脂含量升高，并伴隨多種并發(fā)癥。膽固醇在肝中降解產(chǎn)生的膽汁酸有助于脂質(zhì)在腸道的吸收，而Bp 能與膽汁酸結(jié)合，進而有效減少膽固醇的吸收。白寶清等[26]使用堿性蛋白酶對紫蘇籽粕蛋白進行酶解，分離出3 個組分，用G2 組分灌胃高脂模型組小鼠，結(jié)果顯示小鼠體內(nèi)的TC（總膽固醇）、TG（甘油三酯）和LDL-C（低密度脂蛋白膽固醇）含量明顯降低，表明紫蘇籽粕活性肽G2具有降血脂的功效。周亭屹等[27]將酶解的西蘭花肽進行分離純化和細胞實驗篩選，將效果較好的凝膠分離組分G15-II 進行動物實驗，發(fā)現(xiàn)高劑量組肽段G15-II 能降低大鼠血液TC 和TG 含量水平，同時提高HDL-C含量，可見西蘭花肽具有明顯的輔助降血脂作用。

4 結(jié)語

植物是生物活性肽提取的天然寶庫，植源性生物活性肽因其特有的氨基酸組成將成為一類非常具有發(fā)展?jié)摿Φ幕衔?。采用酶法制備植物多肽的好處不僅僅在于條件溫和、安全性高，更重要的是不同的酶解條件可以產(chǎn)生不同的植物功能多肽并具有不同的產(chǎn)品性質(zhì)。而酶法制備技術(shù)的創(chuàng)新更是提高了小分子多肽的得率，能有效增強植物多肽的功能活性。目前，在植源性生物活性肽的研究中，制備技術(shù)、結(jié)構(gòu)鑒定和活性測定的方法相對成熟，且主要集中在體外活性測定和細胞內(nèi)活性研究，植物活性肽在體內(nèi)的作用機制和人體臨床驗證實驗的研究還不夠，無法將其作為功能性食品和藥物進行商業(yè)化生產(chǎn)。未來的研究其功能活性和人類健康的關(guān)系上，提高生物活性肽的利用率。