李揚(yáng)秋

0 引言

近年來，免疫檢查點(diǎn)（immune checkpoint,IC）阻斷作為一種新型的免疫治療方式在多種實(shí)體腫瘤取得良好的效果，使一些晚期患者再次獲得疾病緩解[1-2]。在血液腫瘤中，利用IC抑制劑（IC inhibitor, ICI）的治療首選于淋巴瘤的應(yīng)用中，近期的臨床研究顯示，對于難治復(fù)發(fā)和老年急性髓性白血病（acute myeloid leukemia, AML）和骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes, MDS）患者缺乏其他有效的治療方案，ICI治療可使一部分患者獲得完全或部分緩解。不同臨床試驗(yàn)所報(bào)告的療效差別較大，這也與不同試驗(yàn)的入組標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，最主要的是與患者的T細(xì)胞免疫狀態(tài)密切相關(guān)[3]。如程序性死亡分子1（PD-1）抑制劑的治療，主要的效應(yīng)途徑是抑制患者免疫細(xì)胞中PD-1的表達(dá)，PD-1表達(dá)的增加是免疫細(xì)胞（主要是T細(xì)胞）處于耗竭狀態(tài)和功能減退的主要原因。因此，IC阻斷治療主要是逆轉(zhuǎn)患者的T細(xì)胞耗竭狀態(tài)，可以理解為靶向T細(xì)胞的免疫治療途徑，了解患者治療前后T細(xì)胞免疫狀態(tài)，采取針對性的策略，是腫瘤免疫治療一個(gè)重要的研究內(nèi)容。

1 血液腫瘤中T細(xì)胞耗竭狀況

T細(xì)胞耗竭主要表型是T細(xì)胞上高表達(dá)多種IC蛋白，如PD-1、CTLA-4（細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4）、TIM-3（T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3）、LAG-3（淋巴細(xì)胞活化基因-3）和BTLA（B和T淋巴細(xì)胞弱化子）等。正常情況下，IC通過調(diào)節(jié)協(xié)同抑制分子激活負(fù)性刺激信號通路，傳遞抑制性信號，從而抑制T細(xì)胞的過度活化和增殖及自身免疫性疾病的發(fā)生。而其高表達(dá)和過度活化，可能是腫瘤發(fā)生的一種誘因，而在實(shí)體腫瘤或白血病狀態(tài)下，其表達(dá)上調(diào)與腫瘤外環(huán)境或腫瘤和白血病細(xì)胞釋放某些免疫抑制因子有關(guān)。各種原因誘導(dǎo)的T細(xì)胞高表達(dá)IC導(dǎo)致了T細(xì)胞進(jìn)入功能耗竭狀態(tài)，表現(xiàn)為活性和功能缺陷，也稱之為耗竭性T細(xì)胞。其作用機(jī)制如：PD-1與PD-L1結(jié)合后，PD-1胞質(zhì)區(qū)ITSM（免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序）結(jié)構(gòu)域中的絡(luò)氨酸發(fā)生磷酸化，募集SHP-2磷酸酶，使下游的Syk和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）及T細(xì)胞受體（TCR）信號通路中的Zap-70、TCRζ等去磷酸化，導(dǎo)致TCR/CD28信號減弱，從而傳遞負(fù)性調(diào)控信號，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡和功能耗竭[4-5]。

近年來，不少研究通過不同的檢測技術(shù)包括流式細(xì)胞術(shù)分析T細(xì)胞耗竭表型和細(xì)胞因子分泌水平及用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析T細(xì)胞耗竭亞群及其功能狀態(tài)等，從不同的層面描述血液腫瘤患者T細(xì)胞耗竭的情況。不同研究發(fā)現(xiàn)血液腫瘤患者均出現(xiàn)不同程度的T細(xì)胞耗竭表型和功能異常，如對B細(xì)胞-急性淋巴細(xì)胞白血?。˙ cell-acute lymphoblastic leukemia, B-ALL）患者外周血和骨髓T細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，可以觀察到患者出現(xiàn)不同程度的T細(xì)胞耗竭狀態(tài)并有明顯的異質(zhì)性，而且不同T細(xì)胞亞群的耗竭狀態(tài)也不盡相同，外周血中T細(xì)胞耗竭主要涉及效應(yīng)記憶T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞群，而骨髓T細(xì)胞耗竭則發(fā)生于T細(xì)胞分化的更早階段，在初始T細(xì)胞和中心記憶T細(xì)胞中均可檢測到T細(xì)胞耗竭，這與既往認(rèn)為白血病骨髓微環(huán)境具有免疫抑制作用相對應(yīng)。另一方面，從T細(xì)胞耗竭分期融入到CD8+T細(xì)胞耗竭分期包括前體耗竭型CD8+T細(xì)胞（progenitor CD8_Ex cells）、中間期耗竭型CD8+T細(xì)胞（intermediate CD8_Ex cells）、終末耗竭型CD8+T細(xì)胞（terminal CD8_Ex cells）和增殖性耗竭型CD8+T細(xì)胞（proliferative CD8_Ex cells）等四期，也可以發(fā)現(xiàn)不同患者T細(xì)胞耗竭所處分期不盡相同，T細(xì)胞主要處于耗竭早期者其臨床預(yù)后較好[6]。這也是ICI治療效果不一的主要原因之一。

2 AML患者T細(xì)胞免疫狀態(tài)與預(yù)后

AML患者均存在不同程度的T細(xì)胞免疫缺陷，與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。AML狀態(tài)下多種因素造成包括白血病骨髓微環(huán)境和白血病細(xì)胞分泌的抑制因子等可導(dǎo)致T細(xì)胞分化、增殖和活化功能缺陷的耗竭狀態(tài)。有關(guān)AML患者T細(xì)胞免疫缺陷的研究時(shí)有進(jìn)展，從分子水平的層面顯示了患者胸腺近期輸出功能降低，T細(xì)胞受體（TCR）亞家族譜系缺失、介導(dǎo)TCR活化的信號通路相關(guān)分子表達(dá)異常，從細(xì)胞水平層面發(fā)現(xiàn)各種功能性T細(xì)胞亞群的分布異常，如具有識別新抗原功能的初始T細(xì)胞減少，具有高增殖能力的中心記憶T細(xì)胞和干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞比例減少，取之以代的是趨向終末分化的效應(yīng)記憶T細(xì)胞增多，同時(shí)，這些T細(xì)胞上抑制性受體表達(dá)上調(diào)而進(jìn)入耗竭狀態(tài)，提示患者整體的T細(xì)胞應(yīng)答能力下降?？偟膩碚f，AML患者T細(xì)胞，無論是αβ T細(xì)胞還是γδ T細(xì)胞均顯示系統(tǒng)性的衰老和耗竭狀態(tài)，而CD8+T細(xì)胞終末分化更為明顯[7-9]。這些T細(xì)胞免疫缺陷的程度與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

在AML中，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀⑼庵苎獑渭?xì)胞水平的分析、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型、或者基因水平檢測IC的表達(dá)水平及其臨床意義均有較多研究報(bào)道。有關(guān)AML中T細(xì)胞免疫狀態(tài)和IC異常表達(dá)的關(guān)系最早的研究是在AML小鼠模型中報(bào)道的。多個(gè)研究表明PD-1/PD-L1通路在AML疾病的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵的作用。我們和國外研究人員已相繼有比較系統(tǒng)的報(bào)道AML患者T細(xì)胞耗竭的一些新改變特點(diǎn)?；颊咄庵苎凸撬鑄細(xì)胞均不同程度高表達(dá)一種或多種免疫抑制受體如PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT和BTLA等，同時(shí)也與耗竭表型CD57和CD244共表達(dá)，尤其表達(dá)這些耗竭表型的CD8+T細(xì)胞亞群增多更為明顯[10-13]。而且骨髓T細(xì)胞受累更為明顯，PD-1+和TIGIT+CD8+T細(xì)胞在難治復(fù)發(fā)AML中升高更明顯，且與老年AML不良預(yù)后相關(guān)[14]，AML緩解期耗竭表型T細(xì)胞比例有所下降。表達(dá)IC的T細(xì)胞以PD-1+T細(xì)胞增加最為明顯，提示在T細(xì)胞免疫抑制中PD-1通路可能起主要作用。除了αβT細(xì)胞高表達(dá)各種免疫抑制受體之外，同樣發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞高表達(dá)PD-1、CTLA-4和BTLA等。如高比例TIGIT+CD226-γδT細(xì)胞與AML較短生存期相關(guān)[15]，另一方面，在AML細(xì)胞和AML干細(xì)胞上，可以檢測到PD-1配體PD-L1和PD-L2的高表達(dá)。更為特別的是，AML細(xì)胞尤其是白血病干細(xì)胞高表達(dá)TIM-3及其配體galectin-9（Gal-9），TIM-3和Gal-9是一對具有自分泌效應(yīng)的抑制性受體[16]，而且高表達(dá)TIM-3和Gal-9也與AML化療抵抗相關(guān)[17]。除了患者T細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞高表達(dá)IC與AML患者預(yù)后不良相關(guān)外，越來越多的研究也顯示AML骨髓細(xì)胞共表達(dá)多個(gè)IC，如高表達(dá)PD-1/CTLA-4、PD-L2/CTLA-4與患者總生存率顯著降低相關(guān)[9,18-19]。此外，有研究分析異基因造血干細(xì)胞移植（all-HSCT）后AML復(fù)發(fā)的相關(guān)因素，發(fā)現(xiàn)受者外周血耗竭性T細(xì)胞水平與復(fù)發(fā)相關(guān)，如TIGIT+CD161+CD4+T細(xì)胞與移植后AML復(fù)發(fā)密切相關(guān)[20]。

因此，IC高表達(dá)誘導(dǎo)T細(xì)胞耗竭，以及AML細(xì)胞中高表達(dá)IC均與AML的發(fā)生發(fā)展、臨床療效和生存均有密切關(guān)系。由于AML細(xì)胞和白血病干細(xì)胞也高表達(dá)IC分子，如PD-L1、PD-L2、TIM-3、CTLA-4等，利用ICI治療AML時(shí)，不僅通過逆轉(zhuǎn)患者T細(xì)胞耗竭狀態(tài)而發(fā)揮抗白血病作用，同樣也可能達(dá)到靶向AML白血病干細(xì)胞而抑制增殖的目的[21]。

3 靶向T細(xì)胞耗竭的AML免疫治療

在ICI應(yīng)用于實(shí)體腫瘤免疫治療的同時(shí)，也開始有臨床研[3]究嘗試PD-1抑制劑在AML、CML和淋巴瘤等血液腫瘤中的應(yīng)用，但樣本量比較少，相對臨床療效不明顯，這也可能由于白血病的T細(xì)胞免疫抑制程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)較實(shí)體腫瘤嚴(yán)重，因此，有關(guān)ICIs在白血病中的應(yīng)用進(jìn)展緩慢。然而，AML缺乏理想的免疫治療手段，也隨著對AML中T細(xì)胞耗竭的認(rèn)識的深入，調(diào)整ICIs治療方案針對難治復(fù)發(fā)AML、造血干細(xì)胞移植后復(fù)發(fā)和老年AML的臨床試驗(yàn)逐漸增加，但我們看到臨床療效差別很大。不同的臨床試驗(yàn)，難治復(fù)發(fā)AML的CR或血細(xì)胞計(jì)數(shù)未完全恢復(fù)（complete response with incomplete count recovery, CRi）率從13%到72%不等[3]。這些差異與不同入組病例，聯(lián)合用藥有一定的關(guān)聯(lián)，另一個(gè)重要的因素可能與AML患者T細(xì)胞耗竭和衰老的程度以及所涉及的失調(diào)的IC分子相關(guān)。不同的ICI如CTLA-4（2002年）、PD-1（2008年）、CD47（2015年）、PD-L1（2016年）、TIM-3 （2019年）、CD70（2019年）、LAG3（2021年）、TIGIT（2021年）等也逐步進(jìn)入臨床試驗(yàn)[22]。例如，在AML小鼠模型中證實(shí)，當(dāng)AML發(fā)生時(shí)共表達(dá)PD-1和TIM-3的CD8+T細(xì)胞比例增加（表現(xiàn)為分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2的能力下降），單獨(dú)抑制PD-1/PD-L1通路或者TIM-3/Gal-9通路治療AML小鼠療效不確切，而共同阻斷兩個(gè)通路，腫瘤清除率明顯增大，生存時(shí)間明顯延長，這提示了在AML中，共同阻斷PD-1/PD-L1和TIM-3/Gal-9通路可能有利于恢復(fù)耗竭性CD8+T細(xì)胞的功能[23]。我們的研究也顯示AML患者在外周血和骨髓CD4+和CD8+亞群中PD-1+TIM-3+細(xì)胞均明顯增加[11]。一項(xiàng)allo-HSCT治療AML的研究顯示：在患者骨髓CD4+和CD8+T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)耗竭表型，骨髓CD8+T細(xì)胞表達(dá)PD-1、CTLA-4和TIM-3水平在復(fù)發(fā)組明顯高于無復(fù)發(fā)組。這也提示白血病骨髓微環(huán)境對T細(xì)胞的免疫抑制作用，與ICIs對免疫微環(huán)境的調(diào)控作用相呼應(yīng)。所以，在造血干細(xì)胞移植后，聯(lián)合ICI治療是一種預(yù)防復(fù)發(fā)的策略[24]。因此，在明確患者T細(xì)胞IC異常高表達(dá)的特點(diǎn)后，聯(lián)合多種ICI治療可能是逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞耗竭的理想途徑，但也可能會增加其他的不良反應(yīng)，因此，尋找能同時(shí)靶向不同IC的方式值得探討。例如，溴結(jié)構(gòu)域與超末端結(jié)構(gòu)域（BET）蛋白抑制劑JQ1既可通過降低免疫檢查點(diǎn)PD-1和TIM-3的表達(dá)而改善AML細(xì)胞中耗竭T細(xì)胞的功能，同時(shí)還可以下調(diào)AML細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，通過靶向PD-1/PD-L1而改善AML的抗腫瘤免疫應(yīng)答，而且，BET抑制劑還能直接抑制AML細(xì)胞的增殖，提示BET抑制劑具有雙重靶向治療AML的作用[25]。此外，通過一些表觀遺傳調(diào)控藥物（如阿扎胞苷）治療也可能通過逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞耗竭而重塑患者T細(xì)胞功能[26]。

4 靶向T細(xì)胞免疫治療AML策略

除了T細(xì)胞耗竭而功能缺陷之外，AML患者的免疫抑制狀態(tài)還包括了髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）增加、NK細(xì)胞功能減低、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）增加以及一些免疫抑制分子的高表達(dá)等，因此，AML患者免疫治療策略需考慮到多方面的協(xié)調(diào)作用。整體的治療策略包括阻斷Treg、修復(fù)DC細(xì)胞功能、增強(qiáng)NK功能和過繼性NK細(xì)胞輸注、阻斷T細(xì)胞耗竭和衰老、過繼性T細(xì)胞輸注等[27]。目前，免疫治療的重點(diǎn)是抗體和細(xì)胞治療，對于AML來說，CD33和CD123可作為免疫治療的主要靶點(diǎn)，但CD33的單抗早期試驗(yàn)效果不甚理想，后期進(jìn)行一系列修飾改良后，有一定的臨床效應(yīng)，目前正在開展Ⅲ期臨床試驗(yàn)用于難治性AML。在CD3-CD19雙抗（BiTE）介導(dǎo)T細(xì)胞抗B細(xì)胞腫瘤取得很好的臨床效果之后，利用同樣的原理，以針對AML干細(xì)胞為目的CD3-CD33、CD3-CD123（LIL-3RA）或CD3-CD371（CLL1）的BiTE雙抗應(yīng)運(yùn)而生，期待有較好的療效。而正在全面啟動(dòng)的是CAR-T細(xì)胞的治療嘗試，多數(shù)針對AML的CAR-T細(xì)胞還處于臨床前的研究，以CD33，CD123，CLL1、Lewis Y 、FLT3和NKG2D作為靶點(diǎn)的二代CAR-T細(xì)胞則已開展用于難治性復(fù)發(fā)AML的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)中[28-29]。但CAR-T細(xì)胞用于AML治療仍然有待很多理論知識、技術(shù)和實(shí)踐的綜合努力。另一方面，在髓性白血病中具有代表性的腫瘤相關(guān)抗原（TAA）—WT1、PRAME和survivin也用于構(gòu)建TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞，具有抗AML的效應(yīng)，WT1-TCR-T細(xì)胞（HLA-A2+）治療AML的臨床試驗(yàn)也取得了一定的療效[27,30]。

從這些臨床研究可以看到，不同免疫治療方案其療效不盡相同。深入研究AML患者的T細(xì)胞免疫缺陷機(jī)制，基于多組學(xué)的研究可以將AML免疫缺陷特點(diǎn)首先分為兩種免疫狀態(tài)：IFN-γ為主基因信號（“IFN-γ dominant” gene signature）型和非炎癥基因信號（“non-inflamed” gene signature）型[31]，前者由于白血病微環(huán)境導(dǎo)致IC高表達(dá)而形成T細(xì)胞耗竭導(dǎo)致T細(xì)胞功能缺陷，可稱為T細(xì)胞耗竭型，后者則由于缺乏T細(xì)胞浸潤而無法產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，即所謂的“免疫沙漠型”，針對前者，免疫治療策略以靶向IC逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞耗竭為主，而針對T細(xì)胞缺少型，只有過繼性免疫細(xì)胞治療包括HSCT才能發(fā)揮療效。

因此，針對AML的T細(xì)胞免疫治療，首先建議對AML的T細(xì)胞免疫狀態(tài)進(jìn)行分析，基于檢測結(jié)果確定患者的免疫類型后，選擇合適的治療方案，才能達(dá)到更理想的效果。

利益沖突聲明：

本文作者聲明不存在利益沖突。