何偉偉，周長慧，鄭明嵐，李嫚琪，崔文騰，方雅勵，王曉煒，常艷

（1.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 201203；2.國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評檢查長三角分中心，上海 201203；3.深圳市藥品檢驗(yàn)研究院，廣東 深圳 518057）

近年來，基因治療在遺傳疾病和罕見病領(lǐng)域取得顯著成果，越來越多基于病毒載體的基因治療產(chǎn)品被監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)上市。如何安全有效地將外源基因?qū)塍w外細(xì)胞或體內(nèi)組織，是安全高效實(shí)現(xiàn)基因治療的關(guān)鍵。目前主流的基因治療載體分為病毒載體和非病毒載體，其中病毒載體又可分為整合型病毒載體和非整合型病毒載體。整合型病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒（lentivirus，LV）載體等；非整合型病毒載體包括腺病毒載體和腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）載體等。AAV和LV載體在目前臨床試驗(yàn)中應(yīng)用較為廣泛［1］。

病毒載體因其自身優(yōu)勢在基因治療中表現(xiàn)突出，但也暴露了相關(guān)安全問題，如遺傳毒性。病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性是由炎癥、隨機(jī)插入干擾正?；?、原癌基因的激活和插入突變等導(dǎo)致的［2-3］。通常表現(xiàn)為基因表達(dá)失調(diào)，甚至導(dǎo)致克隆擴(kuò)增和腫瘤發(fā)生［4-5］。載體介導(dǎo)的遺傳毒性可受病毒類型、整合位點(diǎn)和靶細(xì)胞類型的影響，不同載體具有不同細(xì)胞特異性整合傾向［6］。國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（International Conference on Harmonization，ICH）指南S2（R1）中描述了傳統(tǒng)的遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)組合試驗(yàn)，該試驗(yàn)存在局限于檢測DNA損傷或突變及只能得到短期結(jié)果的缺點(diǎn)［2］，因此不適用于評估載體介導(dǎo)的遺傳毒性。面對復(fù)雜多變的病毒載體整合特點(diǎn)及可能引發(fā)的相關(guān)安全問題，對病毒載體進(jìn)行潛在遺傳毒性風(fēng)險評估勢在必行。本文對目前應(yīng)用廣泛的AAV 和LV 載體的生物學(xué)特性和整合途徑進(jìn)行簡介，對已有的病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性評價方法進(jìn)行綜述，并對建立準(zhǔn)確快速的病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性的評價體系進(jìn)行展望，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 AAV和LV載體

1.1 AAV載體

AAV 屬于細(xì)小病毒科依賴病毒屬，是一類微小、無被膜的線性單鏈DNA 病毒［7］，同時也是一種缺陷型病毒，需要輔助病毒的存在才能感染宿主細(xì)胞，產(chǎn)生新病毒顆粒。無輔助病毒存在時，野生型AAV（wild type-AAV，WT-AAV）只能整合到19號染色體長臂上，形成潛伏感染，隨宿主細(xì)胞染色體復(fù)制而復(fù)制［7-8］。與WT-AAV 不同，重組AAV（recombination AAV，rAAV）載體通常是將WT-AAV 中的rep基因和cap基因用目的基因所取代，只保留AAV 基因組兩端的2 個反向重復(fù)序列。rAAV 作為基因治療載體，通過在載體上移除rep與cap消除其整合能力，因此缺乏rep介導(dǎo)的主動整合，在宿主細(xì)胞中主要形成反向重復(fù)序列融合片段，稱為環(huán)狀連接游離體或游離串聯(lián)體［9］。rAAV 載體能同時感染分裂期和靜止期細(xì)胞，在未分裂細(xì)胞中，這些rAAV 載體基因組在宿主細(xì)胞生命周期中保持完整；在分裂細(xì)胞中，游離DNA 不隨宿主細(xì)胞DNA 復(fù)制，rAAV 載體的DNA 通過細(xì)胞分裂而丟失［10-11］。然而，rAAV 載體仍能以低頻率隨機(jī)整合到靶細(xì)胞基因組中，可能是宿主細(xì)胞DNA修飾酶介導(dǎo)了該整合過程，同時造成了潛在的遺傳毒性風(fēng)險［9］。

多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，rAAV 載體整合有2種方式。一種是隨機(jī)整合，發(fā)生在DNA 損傷位點(diǎn)的非同源位置，通過非同源末端與宿主基因組連接發(fā)生整合；另一種是靶向整合，通過同源重組發(fā)生在特定位點(diǎn)［12］。rAAV 載體的整合位點(diǎn)通常位于活性轉(zhuǎn)錄單元和相關(guān)注釋附近，整合事件發(fā)生在CpG 島和富含GC 片段的頻率逐步增加，這與活性轉(zhuǎn)錄有關(guān)［13-14］。但不同物種間也存在整合位點(diǎn)偏好性，如新生小鼠的整合“熱點(diǎn)”包括Rian 位點(diǎn)、白蛋白和甲胎蛋白［15］；犬的整合“熱點(diǎn)”有早期生長反應(yīng)基因、細(xì)胞周期蛋白D1 基因、雙特異性磷酸酶1 基因和白蛋白［14］；非人靈長類動物和人類肝細(xì)胞相關(guān)研究也報道了白蛋白中的多個rAAV整合事件［16-17］。rAAV載體之所以能作為基因治療載體，是因其在人類中的低遺傳毒性特征，且無直接證據(jù)表明rAAV載體可在人類中介導(dǎo)宿主的遺傳毒性。目前普遍認(rèn)為，rAAV載體基因組仍然主要以附加體的形式存在于宿主細(xì)胞核［18］。

1.2 LV載體

LV 是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一個屬，為二倍體RNA 病毒，因其潛伏期長而被稱為LV［1］。LV 的基因組整合過程首先從整合酶識別病毒的長末端重復(fù)序列開始，此時整合酶將宿主細(xì)胞的DNA 切斷，產(chǎn)生的黏性末端與病毒的DNA 相連接。整合進(jìn)去的前病毒DNA 會轉(zhuǎn)錄出病毒蛋白的mRNA 和病毒基因組RNA，二者在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中包裝成完整病毒顆粒，并以出芽方式釋放到細(xì)胞外［19-21］。人類免疫缺陷病毒（human immune deficiency virus，HIV）載體是應(yīng)用最早、最廣泛的LV 載體，因其轉(zhuǎn)運(yùn)外源基因穩(wěn)定且高效而成為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)常用的載體工具。研究表明，HIV 載體更傾向于整合到轉(zhuǎn)錄活躍基因的內(nèi)含子中下游區(qū)域［22］，對轉(zhuǎn)錄活躍基因的轉(zhuǎn)錄單位有一定偏好性，但不包括轉(zhuǎn)錄起始單位［23-25］。LV載體整合位點(diǎn)的偏好性還會隨轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的活性狀態(tài)而變化，如HIV 均可整合在靜息狀態(tài)和激活狀態(tài)的CD4+T 細(xì)胞的活性轉(zhuǎn)錄單元中，但激活狀態(tài)的CD4+T 細(xì)胞的整合位點(diǎn)更常見于基因密集、CpG 島密集和G/C 堿基富集的基因組區(qū)域［26］。分裂和非分裂的嚙齒動物細(xì)胞之間的整合也有區(qū)別，相較于非分裂細(xì)胞，自失活（self inactivating，SIN）載體在分裂細(xì)胞中的整合優(yōu)先發(fā)生在基因編碼區(qū)域［27］。此外，對發(fā)生HIV 整合的靶DNA 上的核小體進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析表明，核小體表面的向外DNA主凹槽有利于整合的發(fā)生，由此可以誘導(dǎo)原癌基因（如Evi1和B-Raf）激活［2］。LV 載體在基因治療中表現(xiàn)出高效性和安全性，但隨機(jī)整合的特性仍會引發(fā)難以預(yù)料的插入突變。因此，第1 代～第4 代LV 載體通過改造包膜蛋白、去除輔助蛋白、添加土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，以及開發(fā)SIN 載體和整合缺陷LV（integration-deficient LV）等方式，有效減少載體整合且提高病毒載體滴度［28］。

2 病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性評價方法

以病毒載體為遞送載體的基因治療產(chǎn)品，由于復(fù)雜的生物組成和特殊的作用機(jī)制，介導(dǎo)的遺傳毒性區(qū)別于傳統(tǒng)的遺傳毒性，主要為整合插入導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生基因突變、基因失活/激活或癌變的風(fēng)險，因此其安全性評價不能完全采用化學(xué)藥的傳統(tǒng)毒理學(xué)方法［2-4］。全基因組分析、整合位點(diǎn)分析、核型分析和評估轉(zhuǎn)化潛力試驗(yàn)等方法能夠從不同角度對病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性進(jìn)行評價，具有針對性、高效性、準(zhǔn)確性等特點(diǎn)。

2.1 脫靶修飾的全基因組分析

近年來，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最具潛力的基因編輯工具。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的特異性主要取決于單鏈導(dǎo)向RNA（single guide RNA，sgRNA）的識別序列。由于設(shè)計的sgRNA 可能會與非靶點(diǎn)DNA序列形成錯配，導(dǎo)致非預(yù)期的基因突變效應(yīng)，該效應(yīng)稱為脫靶效應(yīng)。CRISPR/Cas9 技術(shù)在被廣泛應(yīng)用的同時，發(fā)生脫靶效應(yīng)的頻率也在增加［29］。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)需要結(jié)合有效的體內(nèi)遞送方式才可能最終轉(zhuǎn)化為臨床疾病治療工具。目前可借助病毒載體或非病毒載體進(jìn)行遞送，其中AAV載體最為安全。AAV載體能感染分裂和非分裂細(xì)胞，并具有低免疫原性、高組織特異性、高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率等優(yōu)勢［30］。理想的基因編輯遞送工具應(yīng)兼具瞬時和高效的特點(diǎn)，以確保治療的安全性和有效性。而AAV載體作為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送載體，進(jìn)入細(xì)胞后可支持CRISPR/Cas9 系統(tǒng)持續(xù)表達(dá)Cas 蛋白；相較于瞬時表達(dá)，sgRNA 介導(dǎo)的脫靶概率將增大，加之AAV 載體可整合進(jìn)宿主基因組的潛在風(fēng)險，將進(jìn)一步放大sgRNA介導(dǎo)的脫靶效應(yīng)，造成不同程度的遺傳毒性風(fēng)險。全基因組測序技術(shù)是對某物種基因組進(jìn)行測序得到其基因組序列的方法，分為體內(nèi)全基因組脫靶分析方法和體外全基因組脫靶分析方法，已由第1 代測序技術(shù)發(fā)展到第3 代，目前已經(jīng)成為分析脫靶效應(yīng)的主流方法，其中全基因組無偏雙鏈斷裂點(diǎn)測序（genomewide，unbiased identification of double strand breaks enabled by sequencing）和基因組環(huán)化測序（circularization forinvitroreporting of cleavage effects by sequencing）代表了迄今為止最具可擴(kuò)展性和易于復(fù)制的方法［31］。與傳統(tǒng)方法相比，該方法具有更加全面、精準(zhǔn)、高效等優(yōu)勢［32］，不足之處在于成本高、產(chǎn)量低，需要復(fù)雜的生物信息學(xué)知識，且對數(shù)據(jù)存儲和處理有巨大的計算需求。

2.2 基因組DNA的整合位點(diǎn)分析

整合位點(diǎn)分析可精確定位基因組中的插入，為評估縱向修飾基因和移植細(xì)胞群的克隆性提供了一種工具，該技術(shù)已成為整合載體系統(tǒng)以確定安全性和追蹤整合位點(diǎn)的主要基準(zhǔn)。最初病毒載體整合位點(diǎn)分析經(jīng)TaqMan 實(shí)時熒光定量PCR 分離擴(kuò)增，用獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分子雜交實(shí)驗(yàn)來分析整合位點(diǎn)特征［33］。由于PCR與測序技術(shù)的快速發(fā)展，操作復(fù)雜、靈敏度低的分子雜交技術(shù)逐漸被取代，下一代測序（next-generation sequencing）逐漸成為主流的整合位點(diǎn)分析技術(shù)。根據(jù)PCR技術(shù)路線的不同，主要有反向PCR、連接介導(dǎo)型PCR（ligation-mediated-PCR，LM-PCR）和線性擴(kuò)增介導(dǎo)型PCR（linear amplification mediated-PCR，LAM-PCR）。

2.2.1 反向PCR

反向PCR 技術(shù)可對已知DNA 片段相鄰的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究。此方法在分子生物學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，可檢測病毒、轉(zhuǎn)座子等在基因組中的整合位點(diǎn)和克隆基因的鄰接序列以及建立基因組步移文庫等［34］。首先使用限制性核酸內(nèi)切酶將宿主DNA打斷，然后對病毒載體末端重復(fù)序列設(shè)計反向引物并進(jìn)行擴(kuò)增，從而在連接酶的作用下已知序列（末端重復(fù)序列）與整合位點(diǎn)兩翼的未知序列形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分析判斷其相對分子質(zhì)量后，可進(jìn)行TA 克?。═A cloning）及測序，獲得病毒載體整合位點(diǎn)特征［35］。反向PCR的主要優(yōu)勢在于簡單快速，但其連接酶成環(huán)效率較低，導(dǎo)致使用范圍受限。

2.2.2 連接介導(dǎo)型PCR

LM-PCR 主要通過4 個步驟來實(shí)現(xiàn)［36］：①模板DNA 的片段化處理；②針對病毒載體末端重復(fù)序列設(shè)計引物；③模板片段與接頭連接；④進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物通過測序后即可揭示病毒載體整合位點(diǎn)特征。LM-PCR 具有靈敏度較高、使用通用引物擴(kuò)增均衡、對模板質(zhì)量要求低和產(chǎn)物產(chǎn)量高等優(yōu)勢，同時也存在操作步驟相對繁瑣、面對復(fù)雜模板時易丟失片段等缺點(diǎn)［37-39］。使用限制性內(nèi)切酶對模板DNA進(jìn)行片段化處理，存在酶切偏好的局限性，因此LM-PCR 的衍生體，即剪切延伸引物標(biāo)簽選擇（shearing extension primer tag selection，S-EPTS）/LM-PCR 被開發(fā)，其使用超聲打斷法對模板DNA進(jìn)行片段化處理，隨機(jī)打斷的的方式克服了酶切的偏好性，使得擴(kuò)增效果大幅提高［40］。

Cristina 等［41］使用一種介導(dǎo)人CD18 的LV 載體，對白細(xì)胞黏附缺陷癥Ⅰ型進(jìn)行基因治療，并使用S-EPTS/LM-PCR 進(jìn)行整合位點(diǎn)分析。整合位點(diǎn)分析在Genewerk 實(shí)驗(yàn)室（德國）進(jìn)行，模板DNA用量為500 ng進(jìn)行擴(kuò)增，并使用超聲剪切儀剪切至中位長度400～500 bp。使用長末端重復(fù)序列特異性的生物素化引物對剪切的DNA 進(jìn)行延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物通過磁珠捕獲富集，然后連接到包括分子條形碼在內(nèi)的連接盒上。連接產(chǎn)物經(jīng)2輪指數(shù)PCR擴(kuò)增后采用MiSeq技術(shù)（Illumina平臺）進(jìn)行深度測序，最終在對應(yīng)的樣本中檢測到10個最顯著的插入位點(diǎn)。

2.2.3 線性擴(kuò)增介導(dǎo)型PCR

LAM-PCR 與LM-PCR 不同之處在于，在模板DNA 的片段化處理前引入線性擴(kuò)增，即對目標(biāo)序列（載體-基因組連接部分）設(shè)計特異性引物并進(jìn)行生物素化標(biāo)記，通過磁珠固相選擇去除非目標(biāo)DNA序列，保留的目標(biāo)序列則被進(jìn)行初始預(yù)擴(kuò)增（100個循環(huán)）。該步驟使得LAM-PCR 的靈敏度和特異性大幅提高，是目前識別位于已知DNA 附近的未知DNA 的最敏感方法［42］。LAM-PCR 同樣受到酶切偏好的限制。為此開發(fā)了一種LAM-PCR 的變體，稱為非限制性LAM-PCR，可繞過限制性消化，從而消除整合位點(diǎn)的酶切偏好性，有利于對宿主基因組中的原病毒位置進(jìn)行全面分析［43］。

Helen 等［44］使用LAM-PCR 對轉(zhuǎn)導(dǎo)整合缺陷LV 的平滑肌細(xì)胞DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。磁珠捕獲生物素化的單鏈線性PCR 產(chǎn)物后，進(jìn)行了雙鏈DNA 合成。得到的雙鏈片段分別用Tsp509Ⅰ或MseⅠ酶切，連接盒接頭連接后進(jìn)行2輪指數(shù)擴(kuò)增。對所得到的LAM-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行深度測序并使用局部同源性搜索工具（basic local alignment search tool，BLAT）與人類基因組序列進(jìn)行比對，最終分析了共同插入位點(diǎn)的傾向性。

2.2.4 靶向富集測序

靶向富集測序是一種捕獲基因組特定區(qū)域DNA 并進(jìn)行深度測序的方法［45］，其關(guān)鍵在于靶向富集。當(dāng)前高通量測序的靶向富集方法主要有2種［46］：①雜交捕獲法，主要利用探針雜交富集目標(biāo)片段，適用于基因組目標(biāo)區(qū)域的全面檢測，但依賴于成百上千個寡核苷酸探針的設(shè)計、復(fù)雜的微陣列芯片制造和較長的雜交時間；②多重PCR 擴(kuò)增法，其核心是引物設(shè)計，先通過PCR 擴(kuò)增富集目標(biāo)片段，再進(jìn)行文庫構(gòu)建，適用于研究的目標(biāo)區(qū)域相對較小，對于拷貝數(shù)較低的模板DNA，可產(chǎn)生足夠數(shù)量用于測序的擴(kuò)增子，這種方法能明顯提高效率，節(jié)約時間，降低經(jīng)濟(jì)成本；不足之處在于存在引物互相干擾和非特異性擴(kuò)增等問題［45］。CRISPR/Cas9 靶向富集方法的出現(xiàn)彌補(bǔ)了上述2 種靶向富集方法的不足，該方法具有無PCR 擴(kuò)增、保留堿基修飾信息、實(shí)現(xiàn)高測序深度、低錯誤率和低成本的長讀長測序等優(yōu)點(diǎn)［47］。靶向富集測序在評估病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性時，能夠捕獲和測序載體基因組，并確定載體拷貝數(shù)；可以對一個給定的載體進(jìn)行廣泛的驗(yàn)證，對載體基因組進(jìn)行定量分析，揭示整合位點(diǎn)的整體克隆性并闡明每個細(xì)胞和載體基因組拷貝的整合頻率。

2.3 核型分析

病毒載體與宿主基因組發(fā)生整合，尤其當(dāng)整合發(fā)生在基因組不穩(wěn)定區(qū)域，如衛(wèi)星DNA 序列、回文序列和CpG 島，則更容易自發(fā)斷裂，導(dǎo)致缺失、插入和易位等［48］。因此，精準(zhǔn)確定目的基因在宿主染色體上的位置成為重中之重。核型分析技術(shù)為檢測克隆性異常相關(guān)核型及可能的染色體重排提供了可能。傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)是診斷染色體疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法存在診斷周期長、易培養(yǎng)失敗、操作過程繁瑣復(fù)雜、對技術(shù)人員要求較高等局限［49］。核型分析對染色體的輕微結(jié)構(gòu)異常不能做出明確診斷，尤其是對具有相似條紋或相似片段的染色體易位的診斷有一定難度；而熒光原位雜交技術(shù)可很好克服該局限性，能夠分析一部分染色體顯帶技術(shù)不易分辨的異常［50］。光譜染色體自動核型分析技術(shù)是在熒光原位雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，對染色體結(jié)構(gòu)異常能作出快速而準(zhǔn)確的診斷，更可以揭示常規(guī)分析方法難以識別的染色體易位、重排和一些未知來源的標(biāo)記染色體［51］。

2.4 評估細(xì)胞轉(zhuǎn)化潛力實(shí)驗(yàn)

病毒載體基因組插入到宿主基因組可干擾宿主細(xì)胞鄰近基因的轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)錄后活性，病毒載體中的啟動子或增強(qiáng)子能使癌基因或腫瘤抑制基因表達(dá)失調(diào)，并引起插入突變導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化［3］。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)是研究細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的常用方法，也是體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化的金標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，缺點(diǎn)是不適合進(jìn)行高通量篩選［52-53］。低附著生長實(shí)驗(yàn)是一種快速且可定量的細(xì)胞轉(zhuǎn)化檢測方法，彌補(bǔ)了軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)的不足［54］。此外，還開發(fā)了體外永生化法［55-56］，能夠檢測由于病毒載體插入導(dǎo)致原代小鼠骨髓細(xì)胞中原癌基因Evi1表達(dá)水平的上調(diào)，但耗時較長；還有白細(xì)胞介素2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)［57］和白細(xì)胞介素3非依賴性突變體選擇法［6］，以及利用Cdkn2a-/-易感腫瘤小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以檢測病毒載體介導(dǎo)的插入誘變，但這些試驗(yàn)既耗時又昂貴［58-59］。

3 結(jié)語

我國國家藥品監(jiān)督管理局頒布的《基因治療產(chǎn)品非臨床研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》中指出，基因治療產(chǎn)品將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)或整合到宿主基因組中或?qū)λ拗骰蚪M進(jìn)行編輯，存在潛在的遺傳毒性風(fēng)險。目前對于判斷細(xì)胞基因組插入/修飾是否會產(chǎn)生遺傳毒性、是否最終會發(fā)生癌變依然缺乏系統(tǒng)的認(rèn)知［60］。目前的遺傳毒性檢測策略在很大程度上依賴于檢測相對較短的暴露后對DNA 的影響（損傷或突變）和突變的表達(dá)期，但病毒載體介導(dǎo)的插入誘變，可能需要較長時間才能在患者中顯現(xiàn)出來。雖然小鼠中常見的整合位點(diǎn)顯示與人類癌基因和腫瘤抑制基因有顯著重疊［59］，但仍應(yīng)考慮檢測不太常見的插入位點(diǎn)的范圍。此外，Bokhoven 等［6］提出病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性評估方法需要具備可定量、可再現(xiàn)并能檢測基因功能的獲得/缺失、確定整合位點(diǎn)等。因此，已有的遺傳毒性評價方法需要不斷優(yōu)化，以評估病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性。這些優(yōu)化包括使用受體群體來源的細(xì)胞來避免疾病和（或）年齡因素的影響，以及使用可能增強(qiáng)體外模型的體內(nèi)相關(guān)性并支持長期培養(yǎng)的3D 模型［2，7］。同時，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行新方法開發(fā)與創(chuàng)新。期待能不斷拓寬且加深對病毒載體的認(rèn)識，對其有清晰的、系統(tǒng)的認(rèn)知，從而經(jīng)過科學(xué)、慎重、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)木C合考慮，開發(fā)通用型的病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性評價方法，建立完整的病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性評價體系，以用于早期、準(zhǔn)確、快速地評價病毒載體介導(dǎo)的遺傳毒性。