趙品楠，羅龍龍

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，國(guó)家安全特需藥品全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens，CP）又稱魏氏梭菌（C.Welchii），主要存在于土壤、污水以及人和動(dòng)物腸道中，可引發(fā)多種疾病，包括人氣性壞疽、食物中毒、動(dòng)物壞死性腸炎和腸毒血癥等，嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全［1］。美國(guó)病理學(xué)家William H.Welch 于1982 年在1 例尸檢過程中分離得到CP，CP 的獨(dú)特表現(xiàn)是在被感染的血管中能觀察到氣泡。開放性創(chuàng)傷使CP 感染的控制更加困難。第一次世界大戰(zhàn)（一戰(zhàn)）期間，約1%的士兵死于CP感染［2］。二戰(zhàn)期間，由于戰(zhàn)爭(zhēng)波及到更多國(guó)家，武器機(jī)械化程度更高，殺傷性更強(qiáng)，導(dǎo)致的傷亡人數(shù)和受傷程度大幅上升，戰(zhàn)傷使感染CP 的比例大幅增加，氣性壞疽發(fā)生率由一戰(zhàn)的1%增長(zhǎng)至10%［3］。國(guó)內(nèi)同樣發(fā)生過CP群體感染事件。2008年汶川地震時(shí)，由于大面積開放性創(chuàng)傷、惡劣環(huán)境及炎熱天氣，CP迅速傳播，出現(xiàn)近百例氣性壞疽患者［4］。另外，CP可以引起大規(guī)模禽類壞死性腸炎和羊腸毒血癥，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。因此，CP對(duì)公共衛(wèi)生的影響不容小覷，如何有效控制CP 感染引起的各種疾病的發(fā)生，找到有效的防治方案迫在眉睫。目前，針對(duì)CP 感染的主要治療手段還是及時(shí)清創(chuàng)并大量使用抗生素，但由于多重耐藥菌株的大量出現(xiàn)、耐藥譜的擴(kuò)大以及不同血清型混合感染等問題，亟需新型的預(yù)防和治療策略。本文簡(jiǎn)述CP 的主要致病因子、致病機(jī)制和基因工程抗體治療研究進(jìn)展，為CP感染防治提供參考。

1 主要致病因子和致病機(jī)制

CP 是一種革蘭陽性粗大桿菌，有莢膜，無鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)；芽孢位于次級(jí)端，呈橢圓形；抗熱能力很強(qiáng)，可在114 ℃的高溫下存活1～4 h，這也是其廣泛存在、傳播力強(qiáng)的主要原因。CP 屬于厭氧菌，但并非絕對(duì)厭氧，在微量氧的情況下也能生長(zhǎng)。該細(xì)菌培養(yǎng)有兩大特點(diǎn)：①菌落在血平板上形成雙層溶血環(huán)（內(nèi)環(huán)由θ 毒素引起完全溶血，外環(huán)由α 毒素引起不完全溶血）；②在牛乳培養(yǎng)基中因分解乳糖產(chǎn)酸而使酪蛋白凝固，同時(shí)產(chǎn)生大量氣體，將凝固的酪蛋白沖成蜂窩狀，該現(xiàn)象被稱為“洶涌發(fā)酵”。

水解酶和外毒素是CP 最主要的致病因子。CP 可分泌近20 余種毒素，其中最主要的致病毒素為α，β，ε 和τ 毒素及腸毒素（C.perfringensenterotoxin，CPE）和壞死性腸炎B 樣毒素（necrotic enteritis B-like toxin，NetB）。另外，根據(jù)其主要產(chǎn)生的毒素可將CP 分為7 種血清型，分別是A 型（α 毒素）、B 型（α，β 和ε 毒素）、C 型（α 和β 毒素）、D 型（α 和ε 毒素）、E 型（α 和τ 毒素）、F 型（α 毒素和CPE）和G 型（α 毒素和NetB）［2］。由于各型CP 的宿主和主要致病毒素不同，其導(dǎo)致的疾病也不同，其中A型為最常見類型，主要引起人氣性壞疽、食物中毒和家禽壞死性腸炎等；B，C 和G 型導(dǎo)致綿羊和反芻動(dòng)物壞死性腸炎等；D 和E 型引起動(dòng)物腸毒血癥；F型引起人食物中毒和抗生素相關(guān)性腹瀉等。

1.1 α毒素

1.1.1 分子結(jié)構(gòu)

研究發(fā)現(xiàn)，各型CP 均可產(chǎn)生α 毒素。α 毒素是A 型CP最主要的毒力因子，也是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)既有酶活性又有毒素特性的細(xì)菌蛋白［5］。α毒素由370個(gè)氨基酸組成，具有磷脂酶C 活性，編碼基因位于細(xì)菌染色體的穩(wěn)定區(qū)域，包括β 折疊組成的膜結(jié)合C端結(jié)構(gòu)域、α 螺旋組成的催化N 端結(jié)構(gòu)域和含有神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合位點(diǎn)的中心環(huán)結(jié)構(gòu)域［6］，在鈣離子存在時(shí)結(jié)合至宿主細(xì)胞膜上［7］，通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致細(xì)胞裂解壞死。N端和C端單獨(dú)存在時(shí)無溶血活性，只有兩者共同作用時(shí)α毒素才具有毒性［8］。

1.1.2 致病機(jī)制

α 毒素同時(shí)含磷脂酶和鞘磷脂酶活性，可水解質(zhì)膜上的卵磷脂和鞘磷脂，產(chǎn)生二?；视秃蜕窠?jīng)酰胺［6］；還可通過與Gi型GTP結(jié)合蛋白的相互作用激活內(nèi)源性磷脂酶和鞘磷脂酶［9］，通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)和信號(hào)通路破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，引起細(xì)胞裂解，并促使白細(xì)胞介素8（interlukin-8，IL-8）、活性氧和鈣離子升高，從而表現(xiàn)出毒素的細(xì)胞毒性、致死性和溶血活性等［10］。此外，α 毒素作用不僅限于膜破壞，還能特異性結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂類糖，隨后促進(jìn)其聚集和酪氨酸激酶A的激活，觸發(fā)IL-8釋放，繼而通過招募和激活中性粒細(xì)胞引起細(xì)胞急性炎癥，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［11-12］（圖1）。Oda等［13］報(bào)道，IL-8升高可促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白黏附，促使嗜中性粒細(xì)胞在血管內(nèi)皮上積聚，最終導(dǎo)致氣性壞疽發(fā)生。還有研究報(bào)道，α 毒素可誘導(dǎo)外周血中性粒細(xì)胞分化［14］，該作用歸因于外周血中性粒細(xì)胞中含神經(jīng)節(jié)苷脂類糖的脂筏改變［15］。在病理方面，α 毒素能夠影響免疫細(xì)胞如嗜中性粒細(xì)胞向感染組織轉(zhuǎn)移（機(jī)制目前未知），因此其可潛在地減少感染部位的病原體清除。α 毒素還可導(dǎo)致血管收縮，減少組織的血液供應(yīng)，從而產(chǎn)生有利于CP 生長(zhǎng)的低氧環(huán)境。另外，α 毒素所引發(fā)的代謝中的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)（花生四烯酸和蛋白激酶C）是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要原因［2］。人氣性壞疽主要由A 型CP 導(dǎo)致，尤其發(fā)生在戰(zhàn)爭(zhēng)或地震環(huán)境中。由于α 毒素能分解肌肉和組織中的糖類物質(zhì)，從而產(chǎn)生大量氣體，造成氣腫；同時(shí)血管通透性增加，局部發(fā)生水腫，擠壓周圍軟組織和血管，影響血供，造成組織壞死。

圖1 α毒素致病機(jī)制.↑：升高；：磷酸化.

1.2 腸毒素

1.2.1 分子結(jié)構(gòu)

流行病學(xué)研究表明，CPE 是引起F 型CP 的人類食物中毒及非食源性腹瀉的主要毒素［16］，該毒素缺乏與其他毒素一級(jí)氨基酸序列的同源性，但在結(jié)構(gòu)上屬于成孔毒素家族［17］。CPE基因位于染色體或質(zhì)粒上，毒素的表達(dá)僅發(fā)生在孢子形成期間［18］。CPE由含有319個(gè)氨基酸的單一蛋白組成［19］，CPE 蛋白由無毒的C端受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和N端細(xì)胞毒性結(jié)構(gòu)域組成，其在孔形成期間介導(dǎo)寡聚化和膜插入［20］。

1.2.2 致病機(jī)制

緊密連接蛋白是CPE 的細(xì)胞受體，對(duì)于維持由上皮和內(nèi)皮細(xì)胞形成的緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用［21］。初始CPE 與緊密連接蛋白的結(jié)合導(dǎo)致小復(fù)合物形成，6 個(gè)小復(fù)合物的相互作用可導(dǎo)致CPE 低聚和質(zhì)膜上孔的形成，最終形成六聚體復(fù)合物1（hexamer complex-1，CH-1）［22］。該復(fù)合物將來自CPE 的β-發(fā)卡環(huán)組裝成β-桶狀結(jié)構(gòu)，其插入膜中形成增強(qiáng)離子內(nèi)流的活性孔，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［23］（圖2）。CPE 孔可滲透小分子，特別是陽離子［24］。CPE 較低劑量即可引起鈣離子內(nèi)流，誘導(dǎo)鈣蛋白酶活化觸發(fā)胱天蛋白酶3 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；而CPE 較高劑量引起大量鈣離子內(nèi)流，可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的鈣蛋白酶活化并導(dǎo)致混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域依賴性壞死性細(xì)胞凋亡。CPE 對(duì)人類健康危害極大，在腸道中其不但引起上皮細(xì)胞死亡，導(dǎo)致體液積聚和電解質(zhì)損失，導(dǎo)致腹瀉；而且還誘導(dǎo)腸上皮組織損傷，包括絨毛縮短、上皮壞死和脫屑，使得CPE 進(jìn)入血循環(huán)并進(jìn)入肝，在肝中與緊密連接蛋白3 結(jié)合，誘導(dǎo)可能危及生命的高鉀血癥［25］。典型F 型CP 的CPE 黏附于腸黏膜上皮，阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸運(yùn)和吸收，且通過改變細(xì)胞膜的通透性，造成小分子的流失進(jìn)而引起腹瀉或食物中毒。

圖2 腸毒素致病機(jī)制.CH-1：六聚體復(fù)合物1.

1.3 ε毒素

1.3.1 分子結(jié)構(gòu)

ε 毒素屬于氣溶素樣成孔毒素家族，是B 型和D 型CP 菌的主要致病毒素，可引起腸毒血癥。腸毒血癥是一種高度致死性疾病，對(duì)家養(yǎng)反芻動(dòng)物，特別是綿羊養(yǎng)殖具有重大影響［26］。在小鼠中其半數(shù)致死劑量（LD50）為100 ng·kg-1，是繼肉毒桿菌毒素和破傷風(fēng)毒素之后已知的第3種最有效的細(xì)菌毒素［27］。由于這種高效力，ε 毒素被認(rèn)為是一種潛在的生物戰(zhàn)劑，并已被美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心歸為B 類生物戰(zhàn)劑［28］。ε 毒素具有3 個(gè)由β-折疊組成的結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域Ⅰ含有1 個(gè)大的α-螺旋，隨后是1 個(gè)環(huán)和1 個(gè)短α-螺旋。在結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ之間，存在另1 個(gè)α-螺旋，隨后是1 個(gè)環(huán)。結(jié)構(gòu)域Ⅱ是由2 個(gè)反向平行的β-折疊和β-發(fā)夾組成的β-夾心。結(jié)構(gòu)域Ⅲ也是具有2 個(gè)β-折疊的β-夾心結(jié)構(gòu)，且這2個(gè)折疊中的第2個(gè)形成毒素的C端［29］。

1.3.2 致病機(jī)制

ε 毒素發(fā)揮毒性作用的過程大致為：ε 毒素被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶激活［26］；活化的ε 毒素與位于細(xì)胞膜區(qū)域中的受體結(jié)合［30］，促進(jìn)中性鞘磷脂酶激活，導(dǎo)致鞘磷脂水解和神經(jīng)酰胺生成［31］，從而促進(jìn)寡聚體形成。寡聚化導(dǎo)致七聚體孔，誘導(dǎo)鉀離子快速丟失，氯離子和鈉離子進(jìn)入，隨后鈣離子增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷［31-32］（圖3）。有研究表明，這些七聚體也被內(nèi)化并引起細(xì)胞損傷［33］。腸中ε毒素的作用可導(dǎo)致體液聚積和黏膜出血，小腸和大腸的組織病理變化包括黏膜充血和糜爛及中度多形核細(xì)胞浸潤(rùn)等。ε 毒素除被腸道吸收外，其他靶器官如腎、肺和腦中也發(fā)現(xiàn)了該毒素［34］。

圖3 ε毒素致病機(jī)制.+：促進(jìn).

2 臨床治療和耐藥性

目前，臨床上針對(duì)CP 感染最常用的治療方法還是大劑量使用抗生素，對(duì)于嚴(yán)重的氣性壞疽需采取緊急外科處理，包括及時(shí)反復(fù)沖洗傷口和切除壞死組織等。但由于該菌導(dǎo)致的疾病具有發(fā)病急、病程短和死亡率高等特點(diǎn)，臨床用藥具有一定的滯后性，很難達(dá)到較好的治療效果。另外，盡管抗生素可用于大部分細(xì)菌感染，大幅降低細(xì)菌感染后的死亡率，然而全球許多常見菌正在對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致長(zhǎng)期慢性感染性疾病頻發(fā)，CP 也不例外。青霉素、四環(huán)素、氯霉素和甲硝唑是臨床治療CP 感染的常規(guī)藥物［35］，但由于抗生素的不規(guī)范使用和濫用，使得CP 耐藥性不斷增強(qiáng)甚至發(fā)生多重耐藥。2004 年，瑞典、丹麥和挪威分離的CP 菌株均存在對(duì)四環(huán)素的耐藥，耐藥率分別為10%，29%和80%，并且通過PCR 擴(kuò)增到了2 個(gè)抗性基因tetA（P）和tetB（P）［36］，它們分別編碼外排蛋白和核糖體保護(hù)型蛋白［37］，通過干擾抗生素與核糖體的結(jié)合發(fā)揮作用。Gholamiandehkordi 等［38］從肉雞中分離的CP對(duì)四環(huán)素耐藥率高達(dá)66%。Kartalidis 等［39］報(bào)道，CP 中存在糖肽類抗生素耐藥基因，且萬古霉素耐藥基因的存在已得到證實(shí)。眾所周知，抗生素抑菌機(jī)制主要是抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成或抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，包括細(xì)菌滅活酶的產(chǎn)生、細(xì)菌藥物靶點(diǎn)改變和細(xì)菌細(xì)胞膜通透性改變等［40］。而CP 主要致病物質(zhì)是其產(chǎn)生的外毒素和水解酶，并非細(xì)菌本身。因此，抗生素對(duì)CP 感染的治療既達(dá)不到完全有效又會(huì)產(chǎn)生耐藥性。目前疫苗預(yù)防和抗體治療已成為研究的突破點(diǎn)。

3 基因工程治療性疫苗和抗體

隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展和醫(yī)藥研究進(jìn)入新階段，抗體藥物呈現(xiàn)蓬勃發(fā)展的態(tài)勢(shì)，在腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病和感染性疾病等方面均取得突破性的進(jìn)展，也因此逐漸成為新藥開發(fā)的熱點(diǎn)。單克隆抗體藥物經(jīng)歷了從鼠源單抗、人鼠嵌合抗體、人源化抗體到全人源化抗體的發(fā)展［41］，上述技術(shù)的迭代逐步優(yōu)化抗體藥物的免疫原性和半衰期，對(duì)疾病和治療效果呈跨越式提高，不良反應(yīng)也明顯降低［42］。傳統(tǒng)的單克隆抗體具有完整的“Y”字形抗體結(jié)構(gòu)，包括與抗原結(jié)合的Fab 段和誘導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用的可結(jié)晶片段（Fc 段）。然而隨著抗體工程化技術(shù)的發(fā)展和對(duì)抗體藥物的深入研究，近年來衍生出了多種非天然的新型抗體結(jié)構(gòu)模式，包括抗體-融合蛋白［43］、雙特異性抗體［44］和抗體偶聯(lián)藥物［45］等。臨床實(shí)踐證明，應(yīng)用抗體治療CP 感染具有一定的療效，無論是鼠源性單抗還是全人源單鏈抗體，均針對(duì)CP 分泌的外毒素，協(xié)同抗生素對(duì)CP 繁殖的抑制，產(chǎn)生更加有效的保護(hù)作用［46］。

3.1 抗α毒素疫苗和抗體

目前，許多抗CPα 毒素的疫苗被認(rèn)為是CP 感染有效的預(yù)防劑。Hoang 等［47］等報(bào)道，表達(dá)α 毒素的重組枯草芽孢桿菌是針對(duì)壞死性腸炎的候選口服疫苗。Uppalapati 等［48］研制出二價(jià)重組蛋白，這可能是針對(duì)CP 診斷和治療領(lǐng)域的一種新型干預(yù)措施。研究發(fā)現(xiàn)，缺乏任何酶和毒素活性的膜結(jié)合C端結(jié)構(gòu)域可能是α 毒素疫苗的主要免疫原［49］。最近，Shreya 等［50］報(bào)道了用二價(jià)嵌合蛋白（由α 毒素和CPE 的C 端結(jié)構(gòu)域組成）免疫小鼠可預(yù)防A 型CP感染。

除疫苗外，針對(duì)α 毒素的抗體因具有高效的中和效應(yīng)被廣泛關(guān)注。Logan等［51］和Singh等［52］通過將骨髓瘤細(xì)胞與用戊二醛滅活或甲醛滅活的α毒素免疫的小鼠脾細(xì)胞相融合，制備了抗α 毒素的鼠單克隆抗體。該單克隆抗體與α毒素反應(yīng)強(qiáng)烈并特異性結(jié)合，可中和α毒素的磷脂酶C活性、溶血活性和致死作用。趙寶華等［53］利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和分子克隆技術(shù)制備單鏈抗體scFv-1A8，其由抗α 毒素雜交瘤細(xì)胞系的重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成，并用柔性的短接頭肽連接。該單鏈抗體在體外能中和α 毒素的磷脂酶C 活性，在小鼠模型中對(duì)致死量α毒素攻擊具有保護(hù)作用。scFv 的優(yōu)點(diǎn)是其相對(duì)分子質(zhì)量較低，滲透性較強(qiáng)［54］。Wang 等［55］等從天然合成的噬菌體展示文庫(kù)中制備了抗α毒素的人源單鏈抗體，并以小鼠為模型檢測(cè)了其預(yù)防和治療效果。為證明scFv 中和毒素的潛力，將α 毒素與scFv 預(yù)孵育，隨后測(cè)試其卵磷脂酶和溶血活性以及iv 給予小鼠后的致死作用。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該單鏈抗體可抑制卵磷脂酶和溶血活性。另外，用2 倍LD50的α 毒素攻擊小鼠，發(fā)現(xiàn)在30 min 內(nèi)用scFv 處理小鼠的存活率可達(dá)80%。上述結(jié)果均表明，制備的抗A 型CPα 毒素人源單鏈抗體可用于預(yù)防和治療α毒素相關(guān)疾病。但由于存在人抗鼠免疫反應(yīng)［56］、單鏈抗體結(jié)合力低和易被腎清除等缺點(diǎn)，治療效果被限制。

王冬冬等［57］在抗A 型CPα 毒素單鏈抗體的基礎(chǔ)上，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了雙價(jià)單鏈抗體。通過體外檢測(cè)該抗體抑制α毒素水解卵磷脂的活性和溶血活性以及小鼠攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)，初步研究該雙價(jià)單鏈抗體的生物學(xué)活性。結(jié)果表明，構(gòu)建的雙價(jià)單鏈抗體scFv2-5 和scFv2-15 均正確，并且與α 毒素具有特異結(jié)合活性，scFv2-15 和scFv2-5 與抗原的結(jié)合活性明顯高于scFv，且scFv2-15 中和毒素的能力較scFv2-5 和scFv 具有明顯優(yōu)勢(shì)。邱玥等［58］構(gòu)建了抗A 型CPα 毒素單鏈抗體，是利用全人源噬菌體抗體庫(kù)篩選獲得的抗α 毒素的全人源scFv 抗體。他們構(gòu)建5種不同組分的重組表達(dá)質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入表達(dá)菌，獲得5 個(gè)單分子抗體的表達(dá)菌。利用EILSA 檢測(cè)該5 種單分子抗體蛋白的抗原免疫結(jié)合活性。結(jié)果顯示，scFv-CH2-CH3（scFv-Fc）的結(jié)合活性最高。隨后進(jìn)行攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該抗體對(duì)α毒素感染具有很好的治療作用，且半衰期較長(zhǎng)。

此外，自20 世紀(jì)90 年代納米抗體被發(fā)現(xiàn)以來，其已經(jīng)成為動(dòng)物和人類疾病預(yù)防和治療的新型小分子抗體藥物［59-60］。納米抗體是衍生自駱駝科動(dòng)物（單峰駝、駱駝和美洲駝）及鯊魚等血清中天然存在的重鏈（缺乏輕鏈和重鏈1結(jié)構(gòu)域）抗體［61］。與傳統(tǒng)抗體相比，納米抗體具有多個(gè)突出的理化性質(zhì)，如相對(duì)分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性高、靶向性強(qiáng)和水溶性好等，且可在細(xì)菌中進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，生產(chǎn)成本大大降低［62-63］。盡管具備上述優(yōu)勢(shì)，但納米抗體和常規(guī)單抗藥物存在同樣的問題，即口服遞送仍不成功，且費(fèi)用昂貴。研究發(fā)現(xiàn)，微生物載體為納米抗體的口服遞送提供了機(jī)會(huì)。例如，硅乳桿菌、乳球菌、沙門氏菌和大腸桿菌被工程化后可將靶分子直接遞送至疾病部位，可實(shí)現(xiàn)更經(jīng)濟(jì)、更有效的疾病治療。使用載體遞送不僅保護(hù)靶分子免受胃腸道環(huán)境的影響，還可使其有效性最大化并使脫靶效應(yīng)最小化［64］。此外，微生物載體還具有制備簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)勢(shì)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，重組乳桿菌已廣泛用作活載體以遞送治療性和預(yù)防性分子［65-66］。乳桿菌對(duì)CP 有較強(qiáng)拮抗活性，可抑制毒素產(chǎn)生，減少促炎細(xì)胞因子，改善腸道病變和免疫應(yīng)答，糾正微生物生態(tài)失調(diào)，恢復(fù)與亞臨床壞死性腸炎相關(guān)的性能缺陷［67-68］。目前，乳桿菌已經(jīng)用作納米抗體的有效遞送、表達(dá)系統(tǒng)，用于不同胃腸道感染性疾病的治療。Dharanesh 等［69］使用重組乳桿菌作為活載體用于原位遞送抗CP NetB 和α 毒素的納米抗體，這些納米抗體中和NetB 和α 毒素協(xié)同重組乳桿菌的腸道調(diào)節(jié)活性，可大大降低家禽壞死性腸炎的發(fā)生率。實(shí)踐證明，來自載體活菌和納米抗體的雙重作用是解決復(fù)雜疾病如壞死性腸炎的突破口，這種治療策略對(duì)其他類似復(fù)雜疾病的治療潛力也值得探討。

3.2 抗腸毒素疫苗和抗體

由于在小腸內(nèi)CPE 可誘導(dǎo)大量的上皮細(xì)胞脫落和纖毛縮短，各種組織病理損傷可造成相關(guān)細(xì)胞水分和電介質(zhì)轉(zhuǎn)移的改變，進(jìn)而引起腹瀉癥狀，并且孢子形成的CP 耐熱，煮熟食物幾乎不能降低其致病性［70］。因此，目前與CPE相關(guān)的疾病既難預(yù)防也無有效治療手段［71］。膜蛋白的緊密連接蛋白家族是已知的CPE 受體，還可控制緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能，為細(xì)胞間分子輸運(yùn)制造障礙。CPE 通過緊密連接蛋白與上皮細(xì)胞結(jié)合，使緊密連接蛋白屏障功能失效，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，破壞腸道穩(wěn)態(tài)［72］。Hanna 等［73］使用合成抗原結(jié)合片段（sFab）文庫(kù)發(fā)現(xiàn)了2個(gè)結(jié)合緊密連接蛋白4和CPE C端復(fù)合物的合成抗原結(jié)合片段，為CPE 相關(guān)的胃腸道疾病治療提供了框架和策略。然而，鑒于CPE 感染不常見，目前針對(duì)該毒素的疫苗或抗體的研究報(bào)道很少，還有待研究。

3.3 抗ε毒素疫苗和抗體

由于ε 毒素致病機(jī)制復(fù)雜，對(duì)人類和動(dòng)物多個(gè)器官均具有較強(qiáng)的毒性作用，目前仍然無針對(duì)該毒素的完善的預(yù)防或治療策略。Garcia 等［74］報(bào)道，用本氏煙草產(chǎn)生的中和單克隆抗體（c4D7）可預(yù)防和治療CP ε 毒素中毒。Jiang 等［75］報(bào)道，ETX-Y71A可作為CP 的無毒突變體，在小鼠和綿羊中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。但上述方案尚未得到臨床驗(yàn)證。

3.4 抗體-抗生素偶聯(lián)藥物策略

除上述抗CP治療性抗體（表1）外，為提高對(duì)耐藥細(xì)菌的治療效果，借助抗體偶聯(lián)藥物的設(shè)計(jì)原理，研究人員還提出了一種用于治療細(xì)菌感染的抗體-抗生素偶聯(lián)藥物策略，其主要結(jié)構(gòu)包括可特異性靶向識(shí)別細(xì)菌的抗體以及用于殺死細(xì)菌的抗生素有效載荷［76］。研究發(fā)現(xiàn)，數(shù)千個(gè)抗體-抗生素偶聯(lián)藥物可與單個(gè)細(xì)菌結(jié)合，并可被吞噬至細(xì)菌體內(nèi)釋放出足夠濃度的游離抗生素［77］，以此提高藥物的有效性（降低藥物劑量和不良反應(yīng)），從而降低耐藥性?？贵w-抗生素偶聯(lián)藥物策略通過將抗體和抗生素的藥理學(xué)屬性結(jié)合到單個(gè)藥物中，為感染性疾病的防治提供全新的治療手段。盡管目前還未開發(fā)出針對(duì)CP 感染的抗體-抗生素偶聯(lián)藥物，但這些非臨床研究案例將大大促進(jìn)治療CP 感染的抗體-抗生素偶聯(lián)藥物的發(fā)展，在一定程度上解決CP 耐藥問題。

表1 抗產(chǎn)氣莢膜梭菌治療性抗體

4 結(jié)語

CP 感染是自然界現(xiàn)存最具危害性的革蘭陽性細(xì)菌之一。因此，針對(duì)CP 做好科學(xué)有效的預(yù)防策略，不僅能夠提高動(dòng)物生產(chǎn)數(shù)量和質(zhì)量，也能消除其給人類健康帶來的威脅。面對(duì)CP 抗生素治療后耐藥性激增，預(yù)防性疫苗、治療性抗體以及抗體-抗生素偶聯(lián)藥物可在一定程度上阻止其耐藥進(jìn)程。目前，針對(duì)預(yù)防和治療CP 感染的疫苗和抗體逐漸成為大家關(guān)注和研究的重點(diǎn)，無論是單鏈抗體、雙價(jià)單鏈抗體，其結(jié)合活性、中和活性以及保護(hù)活性均有待提高。更重要的是，對(duì)具有重大臨床應(yīng)用價(jià)值的候選藥物，需開展進(jìn)一步的非臨床和臨床研究，以滿足臨床上對(duì)CP 感染治療的需求。相信隨著生物科技的迅猛發(fā)展，在應(yīng)對(duì)感染性疾病方面不再局限于傳統(tǒng)的抗生素療法，越來越多的新型生物療法將不斷涌現(xiàn)，為人類對(duì)抗“頑固性耐藥菌”感染提供更多有效的措施。