萬新雨，胡震，楊陽，劉林*

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院骨二科，甘肅蘭州 730000）

近年來，半月板損傷的患病率和發(fā)病率迅速上升，據(jù)報(bào)道，美國(guó)每年超過1 000 000 例半月板手術(shù)，而且這一數(shù)字還在持續(xù)增長(zhǎng)［1］。半月板的損傷與諸多因素有關(guān)，如年齡、職業(yè)、體重和生活方式等，主要分為急性和退行性，青少年患者主要是由于急性扭轉(zhuǎn)或創(chuàng)傷所致，中老年患者主要是慢性重復(fù)性損耗的結(jié)果［2］。目前，半月板損傷的治療選擇可分為保守、手術(shù)和微創(chuàng)介入治療。然而，上述治療方案在促進(jìn)半月板修復(fù)和恢復(fù)膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定的生物力學(xué)特性方面并不令人滿意。因此，找到有效且基本的治療方案已成為解決這些問題的新的研究方向。富血小板血漿（platelet-rich plasma,PRP）含有多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞粘附分子和趨化因子，可參與組織愈合和增殖的過程，也可通過相互作用和相互調(diào)節(jié)激活合成基本產(chǎn)物［3，4］。因此，PRP 促進(jìn)半月板修復(fù)具有良好的發(fā)展前景。

1 半月板損傷的特點(diǎn)

1.1 半月板的解剖

半月板是股骨內(nèi)、外髁與脛骨平臺(tái)之間的兩個(gè)纖維軟骨板。外側(cè)半月板大致呈“O”形，內(nèi)側(cè)半月板大致呈“C”形［5］。半月板由75%的水、20%的I 型膠原蛋白和5%的其他物質(zhì)組成，包括彈性蛋白和蛋白聚糖。半月板的血液供應(yīng)主要來自膝內(nèi)、外側(cè)與膝中動(dòng)脈的動(dòng)脈分支，在關(guān)節(jié)囊及滑膜組織內(nèi)發(fā)出半月板周圍毛細(xì)血管叢，供應(yīng)半月板血液［6］。半月板根據(jù)其血液供應(yīng)情況分為3 區(qū)，即I 區(qū)紅-紅區(qū)，II 區(qū)紅-白區(qū)及III 區(qū)白-白區(qū)［5］；半月板I 區(qū)和II 區(qū)有一定的血液供應(yīng)，因此此處發(fā)生撕裂有一定的愈合能力［7］，III 區(qū)位于半月板內(nèi)側(cè)1/3，完全無血液供應(yīng)，此區(qū)一旦發(fā)生損傷則難以愈合，傳統(tǒng)上III 區(qū)撕裂傾向于半月板部分切除術(shù)［8］。半月板部分切除后易導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，因此，半月板再生修復(fù)技術(shù)是治療半月板損傷非常有前景的一項(xiàng)技術(shù)。

1.2 半月板損傷的分級(jí)

半月板損傷主要的臨床癥狀是膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動(dòng)受限，隨著病情的進(jìn)展出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)彈響、絞鎖［9］。臨床上半月板損傷的分級(jí)主要依靠MRI 的檢查結(jié)果進(jìn)行分級(jí)。目前臨床上最常用的是五分法（0～I(xiàn)V）［10］。

2 PRP 的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展歷程

Matras［11］最早于1982 年將纖維蛋白封閉劑用于頜面外科，對(duì)于術(shù)后止血，促進(jìn)傷口愈合，以及作為組織粘合劑有良好的臨床療效。隨后在1998 年，Marx［12］通過使用的Electro Meds 500 梯度密度細(xì)胞分離器將血液離心成3 種基本成分：紅細(xì)胞、PRP 和缺乏血小板的血漿（platelet-poor plasma,PPP），將提取的PRP 與自體骨移植物結(jié)合應(yīng)用于口腔頜面外科手術(shù)中，并在PRP 中測(cè)得3 倍或更高濃度的血小板，可以預(yù)期對(duì)促進(jìn)傷口愈合和骨再生有深遠(yuǎn)的影響。Ishida 等［13］在2007 年通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了PRP 可以促進(jìn)半月板的愈合。經(jīng)過幾十年的探索以及隨著離心技術(shù)的提升，PRP 技術(shù)發(fā)展迅速，如今多學(xué)科已廣泛應(yīng)用于臨床，并取得了不錯(cuò)的療效。

3 PRP 的制備和分類

PRP 是抽取自體靜脈血通過密度梯度離心的方式分離出的血小板濃縮物，PRP 的制備主要分為兩個(gè)過程。首先，將自體靜脈血通過離心機(jī)分離成3層：上層的PPP、中間層的PRP 及下層的紅細(xì)胞層。然后，去除最下層中的紅細(xì)胞后進(jìn)行第2 次離心步驟，獲取包含＞1 000×103/μl 血小板的中間層作為PRP［14］。盡管對(duì)PRP 研究越來越深入，但是PRP的制備和臨床試驗(yàn)缺乏一種標(biāo)準(zhǔn)化的程序。

由于在制備PRP 時(shí)沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化流程，所以獲取的產(chǎn)物往往在成分及理化性質(zhì)上存在較大差異。Dohan Ehrenfest 等［15］根據(jù)PRP 制品中纖維蛋白密度和白細(xì)胞含量，將不同濃縮血小板分為4 類：（1）白細(xì)胞缺乏或純PRP（pure PRP,P-PRP）：制劑中無白細(xì)胞、纖維蛋白含量低；（2）富含白細(xì)胞的PRP（leucocyte PRP,L-PRP）：含有白細(xì)胞，激活后纖維蛋白含量低；（3）白細(xì)胞缺乏或純富血小板纖維蛋白（pure platelet-rich fibrin,P-PRF）：制劑中不含白細(xì)胞、纖維蛋白含量高；（4）富含白細(xì)胞和血小板的纖維蛋白（leucocyte- and platelet-rich fibrin, LPRF）：含有白細(xì)胞和纖維蛋白。

4 PRP 治療半月板損傷的機(jī)制

PRP 是血漿中的血小板濃縮物，在止血、先天免疫、血管生成、干細(xì)胞遷移、增殖和傷口愈合中具有重要作用［16，17］。當(dāng)PRP 被激活時(shí)，通過內(nèi)分泌、自分泌、旁分泌等方法釋放大量的生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β （transforming growth factor-beta, TGFβ）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor, PDGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor, FGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulinlike growth factor,IGF）、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor, HGF）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）以及有助于軟組織愈合的細(xì)胞因子［18］。PRP 生長(zhǎng)因子的釋放有助于新生血管形成、膠原蛋白合成和常駐干細(xì)胞活化［19］。這些生長(zhǎng)因子通過減少炎癥治愈損傷組織，然后修復(fù)組織的增殖和重塑［20］。PRP 治療半月板損傷和修復(fù)的機(jī)制可能與以下4 點(diǎn)有關(guān)：（1）血管生成：VEGF 和TGF-β 通過促進(jìn)血管生成，增加血管通透性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖，幫助半月板組織的血管重建，改善微環(huán)境［21］；（2）膠原合成：PDGF 通過促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞的有絲分裂，調(diào)節(jié)膠原蛋白合成［22］；IGF 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)蛋白聚糖和膠原蛋白的分泌，并刺激成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的增殖和分化［23，24］。FGF 主要通過促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化來促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生成，以及促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移來增加膠原蛋白的產(chǎn)生［25］；（3）軟骨保護(hù)：TGF-β 通過促進(jìn)金屬蛋白酶抑制劑的表達(dá)，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）的表達(dá)，減少了關(guān)節(jié)軟骨中細(xì)胞外基質(zhì)的降解和軟骨細(xì)胞的凋亡，從而起到軟骨保護(hù)的作用［26］；（4）抗炎作用：IGF 通過抑制核因子κ-B（nuclear factorkappa B, NFκB） 信號(hào)通路，減少白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1beta,IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、白細(xì)胞介素-8 （interleukin-8,IL-8）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和MMP 的mRNA 表達(dá)，從而抑制炎癥過程對(duì)組織的破壞［27］。

5 PRP 治療半月板損傷的實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究

5.1 PRP 體外研究

多名學(xué)者探討了PRP 在體外對(duì)半月板修復(fù)再生的作用，他們首先將細(xì)胞放置于含PRP 的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，隨后檢測(cè)到PRP 釋放的生物活性因子刺激細(xì)胞的遷移和增殖［28～30］。為了進(jìn)一步探討PRP 在體外對(duì)于半月板損傷的修復(fù)療效，Ishida 等［13］通過分離兔半月板白區(qū)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)半月板細(xì)胞在PRP 存在的情況下，DNA 合成多于對(duì)照組（無補(bǔ)充劑），并且PRP 以劑量依賴的方式上調(diào)半月板細(xì)胞的活性，但是當(dāng)加入30%的PPP 時(shí)，半月板細(xì)胞的活力被下調(diào)；在有PRP 存在的混合聚集培養(yǎng)基中，硫酸糖胺聚糖（glycosaminoglycan sulfate,sGAG）的密度顯著高于對(duì)照組（無補(bǔ)充劑）混合聚集培養(yǎng)基中sGAG 的密度，這些結(jié)果表明，PRP 可以促進(jìn)半月板細(xì)胞的增殖和半月板細(xì)胞sGAG 的合成，在體外起到了半月板再生修復(fù)的作用。Howard 等［31］從骨關(guān)節(jié)炎患者中分離出人類半月板細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，通過qT-PCR 檢測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)含有PRP 的培養(yǎng)基中I型α1 膠原蛋白、聚集蛋白聚糖和結(jié)構(gòu)重要蛋白彈性蛋白基因的表達(dá)水平高于PBS 對(duì)照組，從而證明PRP 通過增加半月板關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分基因的表達(dá)來促進(jìn)半月板修復(fù)再生。在驗(yàn)證PRP 對(duì)半月板的修復(fù)再生后，Rosadi 等［32］使用一種以絲素蛋白作為支架，聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose tissue-derived stromal cells, ADSC）及PRP 培養(yǎng)的模型，驗(yàn)證了PRP分泌的TGF-β 通過增加GAG 和II 型膠原蛋白在mRNA 和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)誘導(dǎo)ADSC 分化為軟骨細(xì)胞，幫助軟骨再生。通過聯(lián)合PRP 及生物支架可以有效支持ADSC 的體外軟骨形成，并有望作為體內(nèi)軟骨組織工程的替代方案進(jìn)行進(jìn)一步發(fā)展。

以上體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，PRP 可以通過調(diào)節(jié)半月板細(xì)胞DNA 的合成、刺激半月板細(xì)胞的增殖和增強(qiáng)半月板的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分的表達(dá)，幫助半月板的再生修復(fù)。但是，PRP 促進(jìn)半月板修復(fù)的具體機(jī)制及各種細(xì)胞因子在半月板再生修復(fù)中的作用等，仍需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

5.2 PRP 體內(nèi)研究

為了進(jìn)一步探討PRP 在體內(nèi)對(duì)于半月板損傷的修復(fù)效果，肖文峰等［33］在比格犬中構(gòu)建了膝外側(cè)半月板白-白區(qū)損傷模型，隨后分別用鹽水（對(duì)照組）、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）、PRP 和PRP-BMSCs 注射至模型中，在手術(shù)后3 個(gè)月，通過MRI 和免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)PRP 組和PRP-BMSCs 組半月板愈合情況及膠原蛋白表達(dá)情況較對(duì)照組和BMSC 組有明顯改善，且PRP 組與PRP-BMSCs 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），從而表明PRP 可以促進(jìn)比格犬半月板白-白區(qū)損傷的愈合和膠原蛋白的表達(dá)，起到了修復(fù)損傷半月板的作用。單獨(dú)使用PRP 的效果與聯(lián)合使用PRP和BMSCs 的效果沒有明顯區(qū)別。彭翠等［34］在新西蘭兔中構(gòu)建內(nèi)側(cè)半月板（medial meniscus,MM）前角撕裂模型，隨后實(shí)驗(yàn)分為3 組：MM 前角撕裂組（對(duì)照組）、MM 前角撕裂+經(jīng)脛骨拔出修復(fù)術(shù)（the transtibial pull-out repair,TP）手術(shù)組（TP 組）和MM 前角撕裂+TP 手術(shù)+富血小板血漿凝膠（platelet-rich plasma gel,PRG）組（TP-PRG 組），隨后通過蘇木精、伊紅和Masson 染色發(fā)現(xiàn)，TP 組和TP+PRG 組的結(jié)果均明顯優(yōu)于對(duì)照組，而TP+PRG 組在同一時(shí)期比TP 組表現(xiàn)出更好的結(jié)果，從而證明MM 前角損傷可以使用TP 修復(fù)，在術(shù)中添加自體PRG 可促進(jìn)術(shù)后半月板和骨骼的早期愈合。

以上結(jié)果顯示PRP 在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中能夠促進(jìn)半月板的修復(fù)，為開展相關(guān)臨床研究提供了理論支撐，但是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有一定的局限性：動(dòng)物和人類在解剖、組織和免疫等方面存在著一些差異，動(dòng)物模型不能夠完全模擬人類模型；術(shù)后不能評(píng)估長(zhǎng)期療效；不能夠真正反映臨床患者術(shù)后的療效和相關(guān)并發(fā)癥。

5.3 PRP 臨床研究

隨著離心技術(shù)的不斷發(fā)展以及先前基礎(chǔ)科學(xué)研究的支持，目前多學(xué)科已經(jīng)驗(yàn)證了PRP 對(duì)于多種臨床疾患的療效，包括頑固性創(chuàng)面、脫發(fā)、肌肉骨骼疾病等［35～37］。2018 年，Kaminski 等［38］對(duì)37 例半月板完全垂直撕裂的患者進(jìn)行隨機(jī)化分組，18 例患者接受半月板修復(fù)術(shù)并在修復(fù)部位注射0.9%鹽水（對(duì)照組），19 例患者接受半月板修復(fù)術(shù)并在修復(fù)部位注射PRP（PRP 治療組），術(shù)后進(jìn)行為期42 個(gè)月的隨訪，在18 周時(shí)使用關(guān)節(jié)鏡或MRI 檢查發(fā)現(xiàn)，PRP 治療組的半月板愈合率顯著高于對(duì)照組，治療42 個(gè)月后，兩組的功能結(jié)局均明顯優(yōu)于基線，PRP 治療組的國(guó)際膝關(guān)節(jié)文獻(xiàn)委員會(huì)（International Knee Documentation Committee, IKDC）評(píng)分、西安大略大學(xué)和麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)和膝關(guān)節(jié)損傷及骨關(guān)節(jié)炎結(jié)局評(píng)分（knee injury and osteoarthritis outcome score,KOOS）明顯優(yōu)于對(duì)照組，以上結(jié)果表明，PRP增強(qiáng)治療可顯著提高半月板修復(fù)手術(shù)的愈合率。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PRP 治療半月板損傷修復(fù)的有效性和安全性，該學(xué)者于2019 年發(fā)表了另一項(xiàng)臨床試驗(yàn)報(bào)道［39］，納入72 例半月板撕裂的患者，進(jìn)行隨機(jī)分組，其中30 例接受經(jīng)皮環(huán)鉆半月板修復(fù)術(shù)（對(duì)照組），42 例接受PRP+經(jīng)皮環(huán)鉆修復(fù)術(shù)（PRP 增強(qiáng)組），平均隨訪92 周。在第33 周進(jìn)行MRI 關(guān)節(jié)造影術(shù)和關(guān)節(jié)鏡檢查，發(fā)現(xiàn)PRP 增強(qiáng)組半月板愈合率顯著提高，同時(shí)PRP 增強(qiáng)組的成功率明顯優(yōu)于對(duì)照組，PRP 組KOOS 功能結(jié)局評(píng)分和疼痛視覺模擬評(píng)分（visual analogue scale,VAS）顯著優(yōu)于對(duì)照組；此外，隨訪期間和末次隨訪，均未發(fā)現(xiàn)圍手術(shù)期或術(shù)后并發(fā)癥。史玉輝等［40］對(duì)68 例半月板損傷患者進(jìn)行隨機(jī)化分組，分別使用關(guān)節(jié)鏡治療（對(duì)照組，n=34）和關(guān)節(jié)鏡手術(shù)聯(lián)合PRP 治療（觀察組，n=34），術(shù)后進(jìn)行為期6 個(gè)月的隨訪，結(jié)果顯示，觀察組有效率（88.2%）顯著高于對(duì)照組（67.7%）；兩組的Lysholm膝關(guān)節(jié)評(píng)分、IKDC 評(píng)分均呈升高趨勢(shì)，且觀察組顯著高于對(duì)照組；治療后兩組的血清IL-1、TNF-α 水平均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且觀察組均低于對(duì)照組。這些結(jié)果初步驗(yàn)證了PRP 治療半月板損傷的有效性、安全性和可行性。

然而，近年來有研究以及薈萃分析分析認(rèn)為PRP 聯(lián)合關(guān)節(jié)鏡半月板修復(fù)術(shù)對(duì)改善術(shù)后膝關(guān)節(jié)疼痛和功能結(jié)局作用有限［41，42］。戴文麗等［41］報(bào)道29例盤狀外側(cè)半月板撕裂病例中，PRP 聯(lián)合關(guān)節(jié)鏡手術(shù)組和單獨(dú)關(guān)節(jié)鏡手術(shù)組在Lysholm 膝關(guān)節(jié)評(píng)分、VAS 評(píng)分和失敗率方面無顯著差異。Migliorini 等［42］通過薈萃分析認(rèn)為，與單獨(dú)使用關(guān)節(jié)鏡半月板修復(fù)術(shù)相比，PRP 增強(qiáng)組顯示出相似的VAS、Lysholm 和IKDC 評(píng)分，此外，在失敗率方面沒有發(fā)現(xiàn)差異。上述的結(jié)果表明，關(guān)節(jié)鏡修復(fù)術(shù)聯(lián)合PRP 治療半月板損傷在療效上仍存在爭(zhēng)議，未來仍需具有長(zhǎng)期隨訪和高質(zhì)量RCT 來確認(rèn)PRP 在半月板損傷中的使用和療效。

6 存在問題與展望

目前，PRP 廣泛應(yīng)用于半月板損傷的治療，但也存在一些問題：（1）缺乏統(tǒng)一的PRP 制備和注射方法；（2）PRP 治療半月板損傷的確切機(jī)制并未闡明，尤其是與半月板再生之間的關(guān)系；（3）關(guān)于PRP 治療半月板損傷的研究相對(duì)較少，臨床應(yīng)用效果仍不明確；（4）PRP 的制備過程復(fù)雜，成本較高，生產(chǎn)效率不高。PRP 治療半月板損傷的機(jī)制可能與其促進(jìn)組織修復(fù)、促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)等有關(guān)［43］，仍需進(jìn)一步研究。此外，PRP 治療半月板損傷的安全性還需要進(jìn)一步論證。目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道 PRP 治療半月板損傷的安全性［38，39，44，45］，但由于其取材、提取、保存等過程中可能存在的一些問題，仍有學(xué)者對(duì)PRP 治療半月板損傷的安全性持懷疑態(tài)度［41］。因此，今后仍需要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步探索PRP 治療半月板損傷的具體機(jī)制。此外，還需要繼續(xù)開展臨床試驗(yàn)來進(jìn)一步研究PRP 促進(jìn)半月板修復(fù)的有效性及安全性，隨著研究的不斷深入，PRP 促進(jìn)半月板修復(fù)的安全性和有效性將會(huì)進(jìn)一步被證實(shí)，并在臨床上得到更廣泛的應(yīng)用。