朱高明，郭艷波，2，張加豪，李剛，2*

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東濟(jì)南 250011）

隨著我國(guó)人口結(jié)構(gòu)的改變，人口老齡化進(jìn)程不斷加快，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為我國(guó)50 歲以上人群的重要健康問(wèn)題，中老年女性骨質(zhì)疏松問(wèn)題尤為嚴(yán)重。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)表明，截至2018 年，我國(guó)50 歲以上人群骨質(zhì)疏松癥患病率為19.2%，其中，女性患病率高達(dá)32.1%，顯著高于同齡男性［1］。一直以來(lái)，p53 基因被譽(yù)為“人類基因的守護(hù)者”［2］，目前關(guān)于p53 的研究主要集中于腫瘤及血液系統(tǒng)疾病中。近年來(lái)，隨著研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)p53 在骨代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展中同樣也扮演著十分重要的角色。大量的研究已表明，在骨質(zhì)疏松患者血清中，p53 基因的表達(dá)相較于正常組明顯升高［3］。課題組長(zhǎng)期致力于骨與關(guān)節(jié)相關(guān)疾病研究，本文總結(jié)了近年來(lái)關(guān)于p53 蛋白在細(xì)胞中的代謝機(jī)制及其對(duì)骨質(zhì)疏松癥疾病的影響，旨在為骨質(zhì)疏松癥的臨床用藥提供新的靶向治療方案。

1 p53 信號(hào)

p53 是一種常分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄因子，半衰期通常為15～30 min，因其是人類癌癥疾病中最常改變的基因，一直是腫瘤學(xué)研究的主要焦點(diǎn)，它可激活多個(gè)靶基因的表達(dá)，在調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡、基因組穩(wěn)定性等方面發(fā)揮重要作用。人類p53 蛋白是由Tp53 基因編碼的分子量為53 kDa 的蛋白質(zhì)。目前，關(guān)于p53 在細(xì)胞中全面調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其參與各種生命過(guò)程的具體機(jī)制，起到什么樣的作用等問(wèn)題依舊沒(méi)有明確的答案，其研究熱點(diǎn)仍主要集中在調(diào)控細(xì)胞死亡和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面。

正常情況下，人體內(nèi)p53 的含量及活性受到Fbox 蛋白9（F-box only protein 9,FBXO9）、鼠雙微粒體2（murine double minute2, MDM2）和MDM2-p53結(jié)合樣蛋白（Mdm2-Like p53-binding protein, MDMX）等的嚴(yán)格控制，其通過(guò)促進(jìn)p53 的泛素化而發(fā)生降解，使p53 維持在一個(gè)較低的水平。當(dāng)細(xì)胞受到低氧、饑餓、癌變等刺激時(shí)，位于p53 N 端的結(jié)合位點(diǎn)被磷酸化，MDM2、MDMX 不能與之結(jié)合而泛素化過(guò)程受到抑制，細(xì)胞內(nèi)p53 蛋白水平迅速升高而在細(xì)胞內(nèi)積累。另一方面，積累的p53 被磷酸化后迅速激活，或甲基化、乙?；笮纬伤木垠w［4］，調(diào)控下游細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1（cyclin dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A,p21）、凋亡相關(guān)蛋白PUMA（p53up-regulated modulator of apoptosis）、自噬相關(guān)蛋白Atg10 等的表達(dá)［5］，參與調(diào)節(jié)包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬、鐵死亡等多個(gè)生理過(guò)程，從而誘發(fā)或加重OP 等代謝性疾病。

1.1 p53 對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用

有絲分裂細(xì)胞周期大致可分為4 個(gè)階段，DNA合成前期（G1 期）、DNA 合成期（S 期）、DNA 合成后期（G2 期）以及分裂期（M 期）。機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞周期是一個(gè)及其復(fù)雜的過(guò)程，目前關(guān)于p53 調(diào)控細(xì)胞周期的研究主要集中于經(jīng)典的p53-p21-RB 信號(hào)通路。p21 作為p53 下游的第1 個(gè)轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin- dependent kinases,CDKs）的結(jié)合抑制劑。它能抑制細(xì)胞周期蛋白Cyclin B 等的表達(dá)，進(jìn)一步抑制細(xì)胞周期蛋白D1-CDK4、D2-CDK4 和E-CDK2 的復(fù)合物對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（retinoblastoma protein,RB）的磷酸化。RB是細(xì)胞周期中阻止蛋白轉(zhuǎn)錄的中樞性調(diào)節(jié)因子。p53蛋白被激活后，活化的p53 通過(guò)抑制下游的p21 與其靶蛋白CDKs 結(jié)合，促進(jìn)p21 蛋白的轉(zhuǎn)錄及與Cyclin B-CDK 復(fù)合物的結(jié)合，能促進(jìn)RB 蛋白亞磷酸化并抑制其過(guò)度磷酸化。亞磷酸化的RB 蛋白與轉(zhuǎn)錄因子E2F 蛋白家族E2F1、E2F2、E2F3 等結(jié)合，E2F 的轉(zhuǎn)錄活性受到抑制，最終導(dǎo)致細(xì)胞G1 期阻滯［6,7］。除經(jīng)典途徑之外，Cyclin B 是有絲分裂的關(guān)鍵因子，其表達(dá)被抑制時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂G2/M 期完全阻滯［8］。

1.2 p53 對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用

哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡主要分為內(nèi)在途徑（線粒體途徑）和外在途徑凋亡，p53 也可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞DNA 損傷等方式引起細(xì)胞凋亡［4，9］。B 細(xì)胞淋巴瘤因子2（B cell lymphoma-2,Bcl-2）家族是內(nèi)在途徑主要調(diào)控因子，是一組位于線粒體中的凋亡調(diào)控蛋白，包括促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Bax（Bcl-2-like protein 4）、Bak（Bcl-2-like protein 7）、Bid（BH3-interacting domain death agonist）、Bim（Bcl-2-like protein 11）和抗凋亡Bcl-2、Bcl-xL （Bcl-2-like protein 1） 及Bcl-W（Bcl-2-like protein 2）［10］。Bcl-2 等抗凋亡蛋白通過(guò)與Bax 的結(jié)合而抑制促凋亡蛋白Bax 等的活性，進(jìn)而減少促凋亡蛋白所引起的細(xì)胞凋亡反應(yīng)。

p53 蛋白可通過(guò)多層次影響細(xì)胞凋亡。一方面，p53 蛋白可直接激活促凋亡蛋白Bak，并抑制或降解Bcl-2 相關(guān)蛋白（Bcl-2-like protein 3, Mcl1）和Bak復(fù)合體的形成，使Bak 水平增高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另一方面，p53 蛋白也可與抗凋亡蛋白Bcl2、Bcl-xl結(jié)合并抑制其活性，減弱其抗凋亡作用。PUMA 是Bcl-2 的重要結(jié)合組分，也是脂肪酸合成酶/腫瘤壞死因子配體超族成員6（Fatty acid synthase/Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6, Fas/ FasL）信號(hào)傳導(dǎo)的靶蛋白和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)［11］，p53 可以通過(guò)促進(jìn)PUMA 的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，p53還可以直接誘導(dǎo)位于細(xì)胞表面的促凋亡受體Fas 及其配體FasL 的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。也有文獻(xiàn)提示，在某些特定的情況下，p53 的表達(dá)也可下調(diào)Fas 基因的表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡［12］，但目前相關(guān)報(bào)道較少，且具體機(jī)制有待更深層次的研究。

1.3 p53 對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控作用

細(xì)胞自噬是當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激之后，細(xì)胞內(nèi)溶酶體高度活躍，將衰老或受損的細(xì)胞器或蛋白降解成小分子化合物并進(jìn)行重吸收以維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的過(guò)程［13］，但同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡。該過(guò)程受到包括自噬相關(guān)蛋白Atg 家族、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）、自噬效應(yīng)蛋白（beclin1）等多種蛋白調(diào)控、組織蛋白酶D（probable aspartic-type endopeptidase CTSD,CTSD）等多種蛋白調(diào)控［14，15］。p53 對(duì)體內(nèi)細(xì)胞的自噬具有雙向作用。一方面p53 可通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）等信號(hào)途徑增強(qiáng)自噬［16］，另一方面，p53 能夠與Atg 家族的Atg2、Atg4 等多種自噬基因結(jié)合，增強(qiáng)其活性，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬［17］。除此之外，p53還可與CTSD 啟動(dòng)子區(qū)域的兩個(gè)DNA 位點(diǎn)結(jié)合，并促進(jìn)CTSD、TGM2 基因的表達(dá)，增強(qiáng)自噬蛋白的降解和自噬小體清除而加快自噬的過(guò)程［18，19］。近年來(lái)有研究報(bào)道，p53 可與線粒體途徑自噬的關(guān)鍵酶Parkin 結(jié)合而抑制Parkin 的線粒體易位和E3 泛素連接酶的激活，從而破壞Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬［20］。

1.4 p53 對(duì)鐵死亡的調(diào)控作用

與前者相比，鐵死亡細(xì)胞本來(lái)形態(tài)及細(xì)胞器形態(tài)、胞膜結(jié)構(gòu)等方面具有明顯差異，是一種鐵依賴性的以胱氨酸吸收減弱、谷胱甘肽合成減少導(dǎo)致的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）的活性被抑制，細(xì)胞膜上不飽和脂肪過(guò)量表達(dá)及脂質(zhì)過(guò)氧化為特征的新型細(xì)胞程序性死亡方式［21］。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，p53 可通過(guò)各種途徑調(diào)控鐵死亡。p53 可以通過(guò)抑制溶質(zhì)載體家族7 成員11（cystine/glutamate transporter,SLC7A11）的表達(dá)和機(jī)體對(duì)胱氨酸的攝?。?2］，p53 還可激活多氨乙酰化催化酶（spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1,SAT1）和谷氨酰胺酶2（recombinant glutaminase 2, GLS2）的表達(dá)而促進(jìn)多胺乙?；蚪到?，細(xì)胞膜的穩(wěn)定性減弱，最終誘導(dǎo)鐵死亡。另一方面，p53 對(duì)鐵死亡也表現(xiàn)出抑制作用。Xie 等［23］發(fā)現(xiàn)，p53 可以調(diào)控二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4, DPP4）在細(xì)胞內(nèi)的定位，促進(jìn)DPP4 向核內(nèi)轉(zhuǎn)移并抑制其活性，進(jìn)而阻止胞膜的DPP4 依賴相關(guān)的脂質(zhì)過(guò)氧化而抑制鐵死亡。

除此之外，p53 還可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞衰老、焦亡等方式調(diào)控機(jī)體各項(xiàng)生命活動(dòng)及體內(nèi)的骨量變化。

2 p53 對(duì)骨質(zhì)疏松癥的影響

2.1 p53 對(duì)成骨細(xì)胞的影響

成骨細(xì)胞是由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrowstromal cells,BMSCs）增殖分化而來(lái)，可通過(guò)合成骨基質(zhì)蛋白等方式促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收而維持骨穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞在持續(xù)的氧化應(yīng)激、激素、營(yíng)養(yǎng)不良等刺激下，可引起p53 的異常表達(dá)及活化，成骨關(guān)鍵因子的表達(dá)降低，成骨細(xì)胞生成減少，死亡明顯增加。一方面，p53 可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)與成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（Osterix,OSX）的鋅指區(qū)緊密結(jié)合［24］，阻止其與轉(zhuǎn)錄因子DLX5（distal-less homeobox 5）的相互作用，抑制OSX-DLX5 復(fù)合物的形成，進(jìn)而抑制OSX 的轉(zhuǎn)錄。

p53 還能抑制OSX 與其下游的靶基因和骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein 2, IBSP）、Ⅰ型膠原蛋白（collagentypeIalpha1, COL1A1）的結(jié)合，影響骨基質(zhì)形成的關(guān)鍵基因的表達(dá)而抑制成骨細(xì)胞的生理作用［25］。Zheng 等［26］在對(duì)人成牙本質(zhì)細(xì)胞的p53 基因進(jìn)行敲減及過(guò)表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，p53 敲減細(xì)胞中成牙本質(zhì)細(xì)胞關(guān)鍵基因Dspp （dentin sialophosphoprotein）、Dmp1（dentin matrix acidic phosphoprotein 1）、collagen 1 的表達(dá)明顯升高，當(dāng)敲減p53 上游基因MDM2時(shí)，細(xì)胞中Dspp、Dmp1、collagen 1 的量表現(xiàn)出明顯降低。

另一方面，p53 能直接促進(jìn)促凋亡基因NADPH氧化酶激活劑1（NADPH oxidase activator 1, NOXA）和PUMA 的表達(dá)，并使細(xì)胞G1 期阻滯。當(dāng)p53 的表達(dá)被干擾時(shí)，地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯作用明顯減弱［27］。p53 也可介導(dǎo)細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶2（checkpoint kinase 2,Chk2）引起的DNA 損傷反應(yīng)而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡［28］。Chk2 是細(xì)胞程序性死亡的重要蛋白激酶，當(dāng)Chk2 被激活時(shí)，p53 蛋白被迅速磷酸化，導(dǎo)致DNA 損傷而激活焦亡、凋亡、自噬等一系列反應(yīng)。Chen 等［29］通過(guò)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C明了p53 蛋白可以被上游的mTORC1 激活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+、Na+內(nèi)流增多，膜電位去極化，從而促進(jìn)細(xì)胞衰老。且由于細(xì)胞內(nèi)Na+的增多，阻礙多種主動(dòng)運(yùn)輸依賴性的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，加劇了細(xì)胞的衰老。綜上所述，p53 可通過(guò)干涉成骨細(xì)胞增殖分化過(guò)程中的關(guān)鍵信號(hào)分子，并影響細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞衰老及凋亡等方式，抑制體內(nèi)的成骨分化。

2.2 p53 對(duì)破骨細(xì)胞的影響

破骨細(xì)胞是巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞分化融合形成的多核細(xì)胞，該過(guò)程受到巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor 1,M-CSF）、核因子kb（NF-kb）受體RANK 及其激活劑RANKL 等因子的共同調(diào)節(jié)［30］。目前，關(guān)于p53 對(duì)機(jī)體破骨細(xì)胞的研究主要表現(xiàn)在p53 能夠影響破骨細(xì)胞的生命過(guò)程。p53 的過(guò)度激活，促使破骨細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯，增加破骨細(xì)胞的凋亡、鐵死亡等的風(fēng)險(xiǎn)［31］。研究已表明，高劑量的糖皮質(zhì)激素可以通過(guò)激活p53 信號(hào)下調(diào)OPG，上調(diào)RANKL，而抑制成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成以及增加破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收。Zauli 等［32］發(fā)現(xiàn)，MDM2 拮抗劑激活p53 蛋白的磷酸化后，與對(duì)照組相比，S 期停滯細(xì)胞的百分比明顯增多。此外，p53 也能通過(guò)增強(qiáng)破骨細(xì)胞內(nèi)TSC2（tuberous sclerosis 2 protein）的表達(dá)，降低自噬反應(yīng)，增強(qiáng)骨保護(hù)素（osteoclastogenesis inhibitory factor, OPG）的活性，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的增殖［33］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，p53 基因敲除的動(dòng)物模型中，其成骨能力顯著高于對(duì)照組小鼠，成骨相關(guān)基因表達(dá)量明顯上升，同時(shí)，M-CSF、RANK 等破骨誘導(dǎo)因子的表達(dá)也相對(duì)增強(qiáng)，破骨細(xì)胞的生成增多，骨吸收增強(qiáng)［34］，筆者推測(cè)，這可能與p53 敲除之后，破骨細(xì)胞的程序性死亡減少有關(guān)，但沒(méi)有明顯的證據(jù)證明p53 直接促進(jìn)了破骨細(xì)胞的增殖和分化?？傮w上，目前關(guān)于p53 在破骨細(xì)胞的作用研究相對(duì)較少，p53 蛋白能否直接增強(qiáng)破骨細(xì)胞的生成及分化相關(guān)基因的表達(dá)，而促進(jìn)骨吸收及其具體機(jī)制等一系列問(wèn)題，仍是未解之謎，還有待更進(jìn)一步研究。

2.3 p53 對(duì)BMSCs 的影響

BMSCs 成熟到成骨表型是一個(gè)多步驟的過(guò)程，p53 在該過(guò)程的各個(gè)階段起著重要的調(diào)節(jié)作用，參與調(diào)節(jié)BMSCs 的凋亡、衰老、增殖、分化等過(guò)程。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，p53 基因敲除后的干細(xì)胞增殖率明顯高于普通型細(xì)胞，p53 基因的敲除可以抑制PUMA 的激活，改善線粒體功能，有效阻止壞死性凋亡和炎癥途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子腫瘤壞死因子受體蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase,RIPK1） 缺乏引起的BMSCs 細(xì)胞凋亡和壞死［35］。p53 還能抑制BMSCs 中Parkin 的線粒體易位和Parkin 的E3 泛素連接酶的激活，從而降低線粒體自噬水平，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法有效去除受損的線粒體［20］，加快BMSCs 的衰老和凋亡。此外，p53 也參與BMSCs 的成骨、成血管等分化過(guò)程。一方面，p53 可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Twist 相關(guān)蛋白2（twist related protein2,TWIST2）的表達(dá)而降低BMSCs 的成骨分化能力［36］，TWIST2 是成骨發(fā)育過(guò)程中的負(fù)向調(diào)節(jié)因子［37］。p53 還可以直接抑制體內(nèi)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶-2（cyclin-dependent kinase-2,CDK2）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）及成骨標(biāo)志基因RUNX2 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Maf 等的表達(dá)，抑制BMSCs 的成骨分化［38，39］。p53 的高表達(dá)還能抑制BMSCs的成血管分化。Zhang 等［40］在研究中表明，當(dāng)p53基因敲除時(shí)，人牙髓干細(xì)胞的成血管標(biāo)志物血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2）、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1 , CD31）等的表達(dá)顯著增加，干細(xì)胞的血管生成分化明顯，用MI-773 誘導(dǎo)人牙髓干細(xì)胞內(nèi)p53 表達(dá)時(shí)，成血管標(biāo)志物VEGFR2、CD31 明顯降低。

3 總結(jié)與展望

骨質(zhì)疏松癥目前仍是骨關(guān)節(jié)疾病中的一大難題，盡管目前的研究顯示p53 對(duì)BMSCs 以及成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的調(diào)控作用在某些方面具有同向性，即p53不僅可以調(diào)控BMSCs 及成骨細(xì)胞周期和凋亡等過(guò)程，同時(shí)也能調(diào)控破骨細(xì)胞的周期、促進(jìn)其凋亡，但對(duì)于骨重塑的宏觀表型而言，在p53 基因敲除或抑制的OP 模型中，其骨的形成量仍遠(yuǎn)高于骨的吸收量，骨質(zhì)疏松的相關(guān)表現(xiàn)也得到了明顯的緩解。目前關(guān)于骨質(zhì)疏松的藥物使用方面，多集中于促進(jìn)骨形成的甲狀旁腺激素類似物及抑制骨吸收的雙磷酸鹽類、雌激素等制劑［41］，療效明顯，但多為針對(duì)性的改善臨床癥狀，并且常伴隨著較大的副作用，為患者緩解癥狀的同時(shí)也帶來(lái)諸多不便，因此，骨質(zhì)疏松癥新藥物的開(kāi)發(fā)具有重要的意義。但由于p53 蛋白分子結(jié)構(gòu)的特殊性，其表面光滑，沒(méi)有理想的藥物結(jié)合袋，使p53的靶向治療進(jìn)展十分緩慢。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿、骨碎補(bǔ)等中藥能顯著調(diào)控細(xì)胞內(nèi)p53 基因的表達(dá)，并能明顯增強(qiáng)骨形成相關(guān)基因RUNX2、OSX 等的表達(dá)［42］，骨量回升，由此看來(lái)，中西醫(yī)結(jié)合療法或?qū)⒊蔀橹委焢53 相關(guān)疾病及OP 的主流方式。