摘 要：目的：建立生活飲用中56種抗生素的固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。方法：將生活飲用水通過大容量采樣管連接到固相萃取柱上凈化，用C18柱梯度洗脫分離目標(biāo)物，以乙腈和0.1%甲酸水為流動(dòng)相，經(jīng)電噴霧離子源電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。結(jié)果：56種抗生素的最低檢測(cè)濃度為0.1～2.0 μg·L-1，在其線性范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)均大于0.995，3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收率為63.3%～113.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.1%～8.3%。結(jié)論：該方法前處理簡(jiǎn)單、快速，適用于生活飲用水中多種抗生素的快速篩查和定量檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；固相萃??；生活飲用水；大容量采樣管

Rapid Screening and Determination of 56 Antibiotics in Drinking Water by Solid-Phase Extraction Combined with UPLC-MS/MS

CHEN Kun， ZHONG Gemei， WEI Rirong， HUANG Jiangping， LEI Ningsheng， LIAO Yanhua*

（Guangxi Center for Disease Control and Prevention， Nanning 530028， China）

Abstract： Objective： To develop a method for determination of 56 antibiotics in drinking water by solid -phase

extraction and UPLC-MS/MS. Method： Drinking water is connected to the solid phase extraction column for purification through a large-capacity sampling tube， target object were separated on C18 with gradient elution using acetonitrile-0.10% formic acid as mobile phase and detected by MS/MS using positive electrospray ionization under the multiple reaction monitoring. Result： The minimum detection of 56 antibiotics was 0.1～2.0 μg·L-1. The correlation coefficients in its linear range are over 0.995. The recovery rates of the 3 concentration levels were 63.3%～113.0% with the relative standard deviations of 3.1%～8.3%. Conclusion： The method has simple and rapid pretreatment， and is suitable for rapid screening and quantitative detection of multiple antibiotics in drinking water.

Keywords： ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; solid-phase extraction; drinking water; large-capacity sampling tube

近年來，有關(guān)新型污染物的話題再次走入公眾視野，它被稱為“新型污染物”或“新興污染物”，它一般是指由人類活動(dòng)造成，在城市污水、地表水、飲用水中被頻繁檢測(cè)出，但因其生產(chǎn)使用歷史相對(duì)較短或發(fā)現(xiàn)危害較晚，尚無法律法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)予以規(guī)定或規(guī)定不完善的污染物。目前，國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注的新型污染物主要包括國(guó)際公約管控的持久性有機(jī)污染物、內(nèi)分泌干擾物、抗生素等。為加強(qiáng)新型污染物治理，切實(shí)保障生態(tài)環(huán)境安全和公眾健康，國(guó)家在2022年出臺(tái)了一系列行動(dòng)方案[1-3]?？股貫樾滦臀廴疚镏械囊活?，其被廣泛用于農(nóng)業(yè)、畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖和人類衛(wèi)生醫(yī)療領(lǐng)域的細(xì)菌感染治療[4-5]，主要通過藥企制藥廢水、醫(yī)院的醫(yī)療廢棄物不正當(dāng)排放以及人體或動(dòng)物和水產(chǎn)飼養(yǎng)用藥殘留排放進(jìn)入水體和環(huán)境，從而產(chǎn)生污染。

現(xiàn)行的相關(guān)抗生素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[6-7]分析方法主要是針對(duì)水產(chǎn)品和動(dòng)物源性食品抗生素的檢測(cè)，新發(fā)布的GB/T 5750.8—2023[8]主要是針對(duì)生活飲用水中29種抗生素和10種降壓藥等個(gè)人護(hù)理用藥的檢測(cè)，國(guó)內(nèi)暫無環(huán)境類標(biāo)準(zhǔn)；美國(guó)EPA 1694[9]標(biāo)準(zhǔn)方法中已有利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)，采用同位素標(biāo)識(shí)物為內(nèi)標(biāo)物定量測(cè)定環(huán)境樣品中的藥物及個(gè)人護(hù)理用品，檢測(cè)對(duì)象包括7種沙星類抗菌藥，6種大環(huán)內(nèi)酯類和1種林可酰胺類抗生素。這些標(biāo)準(zhǔn)方法大多是針對(duì)化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的某一類抗生素的檢測(cè)[10-15]，

科研文獻(xiàn)[16-18]中雖有采用LC-MS/MS檢測(cè)水中多種抗生素的報(bào)道，但同時(shí)測(cè)定的抗生素種類和目標(biāo)物數(shù)量涉及范圍和種類還不夠廣，且在多種抗生素的同時(shí)檢測(cè)過程中，鮮有文獻(xiàn)提及如何在復(fù)雜的譜圖中快速篩查出目標(biāo)物。

水中抗生素含量低、干擾大，因此檢測(cè)時(shí)采用固相萃取前處理凈化分離和富集技術(shù)，將大體積水樣通過過柱的方式進(jìn)行凈化富集，再結(jié)合具有高通量、高選擇性、高準(zhǔn)確性及痕量分析能力的LC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè)。基于國(guó)內(nèi)近年來食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)物質(zhì)、國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道及管控目標(biāo)物清單，本文建立了包括喹諾酮類、硝基咪唑類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類在內(nèi)的生活飲用水中56種抗生素的固相萃?。⊿olid-Phase Extraction，SPE）結(jié)合LC-MS/MS快速篩查和分析檢測(cè)方法，為生活飲用水中新型污染物的監(jiān)測(cè)提供方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑耗材

儀器：TM5500超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（AB SCIEX 5500，新加坡）；氮吹儀（N-EVAP34美國(guó)路易公司）。

試劑耗材：HLB固相萃取小柱（6 mL/500 mg）、大容量采樣管（匹配6 mL SPE小柱，1/8in OD，1 mL，1支/包）、EDTA-2Na（分析純）、甲醇（色譜純，4 L/瓶）、乙腈（色譜純，4 L/瓶）、甲酸（色譜純，4 L/瓶）、標(biāo)準(zhǔn)品：25種磺胺類混標(biāo)（LOT：2251860，100 mg·L-1，溶劑為甲醇），9種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素混標(biāo)（LOT：2253998，100 mg·L-1，溶劑為甲醇），12種硝基咪唑混標(biāo)（LOT：2101538，100 mg·L-1，溶劑為甲醇），15種喹諾酮類（LOT：2201585，100 mg·L-1，溶劑為甲醇）購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別吸取以上混標(biāo)1.00 mL用甲醇定容至

10 mL容量瓶中，制備成10.0 mg·L-1混合儲(chǔ)備液，保存于-20 ℃冰箱中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍依次用初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

1.3 分析步驟

采集1 L水樣于預(yù)先現(xiàn)場(chǎng)添加6 mg抗壞血酸的1 L的玻璃瓶中，使用0.45 μm濾膜抽濾。用（1+1）鹽酸溶液或氨水調(diào)節(jié)水樣的pH值，使水樣的pH值為3.5±0.5，再加入0.5 g EDTA，搖勻溶解；后將水樣通過大容量采樣管連接到預(yù)先用6 mL甲醇（色譜純）和6 mL水活化的HLB柱上，調(diào)節(jié)流速為5～8 mL·min-1，讓水樣連續(xù)自動(dòng)輸入；上樣結(jié)束后用10 mL水淋洗小柱，負(fù)壓抽干HLB小柱，用6 mL甲酸/甲醇（1∶1 000）混合溶液洗脫樣品，洗脫液靠重力收集到15 mL離心管中，上述洗脫液在≤40 ℃水浴溫度下氮吹至近干，用1.00 mL初始流動(dòng)相復(fù)溶，充分混勻后過0.22 μm濾膜至進(jìn)樣瓶上機(jī)測(cè)定。

1.4 測(cè)定條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH-C18（1.7 μm，100 ?，100 mm×2.1 mm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：3 μL；流動(dòng)相及洗脫條件見表1。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，正離子方式；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；離子源溫度：600 ℃；GS1：55 psi；GS2：50 psi；氣簾氣：35 psi；噴霧電壓：5 500 V；碰撞氣：6 psi；校準(zhǔn)方法：質(zhì)量軸自動(dòng)調(diào)諧校準(zhǔn)。其他條件見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 水樣pH值對(duì)回收率的影響

本文研究的化合物大多屬于酸堿兩性化合物，水樣pH值會(huì)影響其穩(wěn)定性和存在形態(tài)，如在酸性條件下以質(zhì)子狀態(tài)存在，在堿性條件下以游離分子狀態(tài)存在。在酸性條件下提取的文獻(xiàn)報(bào)道居多，因此本文比較了56種化合物在pH值為2、3、4、5、6條件下的回收率，硝基咪唑類結(jié)果回收率在75.3%～102.8%，表明硝基咪唑類化合物回收率良好，受水樣pH值影響較小。在接近中性條件下恩諾沙星、氧氟沙星、氟羅沙星回收率接近50%，水樣調(diào)節(jié)為酸性（pH值2～4）后，沙星類抗菌藥的回收率有了顯著提高，均達(dá)到75%以上。大環(huán)內(nèi)酯類化合物受pH值影響較大，pH值為3～4時(shí)回收率在65%～105%；pH值為2時(shí)，除紅霉素外，大多數(shù)組分回收率顯著下降，這可能與強(qiáng)酸性條件下糖苷鍵水解有關(guān)；部分組分在接近中性條件下回收率下降明顯，泰樂菌素、交沙霉素的回收率不到50%。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

由于56種抗生素大多都是含氮化合物，易于質(zhì)子化，在質(zhì)譜電噴霧電離模式下易形成[M+H]正離子，且有較強(qiáng)的響應(yīng)信號(hào)，通過針泵進(jìn)樣優(yōu)化母離子及各碎片離子參數(shù)，結(jié)合實(shí)際樣品各離子對(duì)基線、雜質(zhì)干擾峰與響應(yīng)信號(hào)的色譜圖，優(yōu)化后各化合物的離子對(duì)信息如表2所示。

正離子模式下，乙腈-0.1%甲酸水流動(dòng)相體系更有利提高各化合物組分離子化效率，使響應(yīng)信號(hào)更高，峰形更尖銳。通過優(yōu)化流動(dòng)相的梯度洗脫條件，大多數(shù)有機(jī)化合物實(shí)現(xiàn)了基線分離，實(shí)現(xiàn)了對(duì)磺胺甲氧噠嗪、磺胺對(duì)甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶，磺胺鄰二甲氧嘧啶和磺胺間二甲氧嘧啶，磺胺二甲基嘧啶和磺胺二甲異嘧啶，磺胺二甲異噁唑和磺胺二甲唑共4組磺胺類同分異構(gòu)體的基線分離；對(duì)于部分未達(dá)到基本分離的極性相近的化合物，質(zhì)譜檢測(cè)器的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式也能進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量分析，不影響分析結(jié)果。本文通過3輪抽提離子對(duì)完成了分析化合物的定性篩查，圖1為10 ng·mL-1分析化合物的色譜圖。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響

以水源水空白和末梢水空白為基質(zhì)，按上述方法測(cè)定，添加標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的56種抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶氮吹后殘?jiān)?，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以之與溶劑（0.10%甲酸水∶乙腈=9∶1）配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值比較，用標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)的高低。結(jié)果顯示，56種化合物的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值在0.81～1.15，說明基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果的影響可以忽略，可避免每次實(shí)際樣品檢測(cè)至少要帶5個(gè)空白基質(zhì)樣品同時(shí)測(cè)定用以配制基質(zhì)曲線的麻煩，減少了檢驗(yàn)工作量。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

以空白水源水為基質(zhì)，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下（pH值為3.5±0.5），以信噪比為10計(jì)算方法的最低檢測(cè)濃度（定量限）；根據(jù)化合物的最低檢測(cè)濃度，配制標(biāo)準(zhǔn)系列濃度上機(jī)測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)；根據(jù)各化合物的線性范圍，設(shè)置低（0.2～5.0 μg·L-1）、中（5.0～20 μg·L-1）、高（20～100 μg·L-1）3個(gè)加標(biāo)水平，按上述方法測(cè)定樣品，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)測(cè)定6份樣品，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，56種抗生素的最低檢測(cè)濃度為0.1～2.0 μg·L-1，r均大于0.995，線性良好，低、中、高3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收率為63.3%～113.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.1%～8.3%，滿足檢測(cè)要求。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用本研究建立的方法對(duì)南寧市的3份末梢水、3份水源水和3份出廠水進(jìn)行檢測(cè)，檢出抗生素7種，陽性樣品6份，檢出的抗生素主要是大環(huán)內(nèi)酯和磺胺類抗生素，含量為0.2～5.8 μg·L-1，提示應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。

3 結(jié)論

本研究建立的一種固相萃取結(jié)合UPLC-MS/MS快速測(cè)定方法能篩查生活飲用水中56種抗生素，涵蓋了喹諾酮類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類等人獸兩用藥物，可以應(yīng)用于飲用水源抗生素污染調(diào)查和生活飲用水水質(zhì)監(jiān)測(cè)工作。

實(shí)驗(yàn)室采用傳統(tǒng)的樣品過柱模式，工作不僅耗時(shí)費(fèi)力還可能因?yàn)橹貜?fù)性勞動(dòng)導(dǎo)致倦怠而發(fā)生操作失誤，影響結(jié)果準(zhǔn)確性。本研究創(chuàng)新性地將樣品通過大容量采樣管連接到固相萃取柱上，通過壓差導(dǎo)流實(shí)現(xiàn)凈化處理半自動(dòng)化操作，操作人員能夠輕松實(shí)現(xiàn)批次處理樣品，給未配置多通道全自動(dòng)固相萃取的實(shí)驗(yàn)室提供了一種連續(xù)上樣的操作模式，以低實(shí)驗(yàn)成本提高了工作效率。本研究不僅通過對(duì)流動(dòng)相條件的優(yōu)化，達(dá)到對(duì)大部分目標(biāo)化合物的基線分離，還創(chuàng)新性提出對(duì)56種抗生素的保留時(shí)間進(jìn)行分類，通過3輪篩查，可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的快速處理，大大提高實(shí)驗(yàn)室批量數(shù)據(jù)處理能力的同時(shí)減少了失誤。

綜上，本文建立的固相萃取結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用法篩查生活飲用水中56種抗生素的方法，整個(gè)過程操作簡(jiǎn)單，適應(yīng)了現(xiàn)階段環(huán)境監(jiān)測(cè)檢測(cè)高通量、操作時(shí)間短、定性定量準(zhǔn)確等要求，值得在更多抗生素殘留的快速篩確證與定量檢測(cè)工作中推廣應(yīng)用。

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基金項(xiàng)目：廣西醫(yī)藥衛(wèi)生計(jì)劃課題（Z2015448）

作者簡(jiǎn)介：陳琨（1982—），女，湖南邵陽人，碩士，副主任技師。研究方向：實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理與理化檢驗(yàn)。

通信作者：廖艷華（1978—），女，廣西宜州人，碩士，副主任技師。研究方向：理化檢驗(yàn)。E-mail：1907430702@qq.com。