摘 要：建立一種梯度洗脫液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法（Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，LC-ICP/MS）分析硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、亞硒酸根、硒代蛋氨酸、硒酸根5種硒形態(tài)。樣品通過(guò)Hamilton PRP-X100陰離子色譜柱，分別以流動(dòng)相A 40 mmol·L-1磷酸氫二銨+5 mmol·L-1檸檬酸（pH=4.6）和流動(dòng)相B 60 mmol·L-1磷酸氫二銨+5 mmol·L-1檸檬酸（pH=4.6）梯度洗脫5種硒形態(tài)，流速為1.0 mL·min-1，切換時(shí)間分別為3.0 min和6.4 min，ICP/MS檢測(cè)，外標(biāo)法定量。5種硒形態(tài)在8.5 min內(nèi)檢測(cè)完畢；0.5～200.0 μg·L-1相關(guān)系數(shù)r＞0.999，最低檢測(cè)質(zhì)量濃度為0.10～0.39 μg·L-1。相較于《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 第 6 部分：金屬和類金屬指標(biāo)》（GB/T 5750.6—2023）硒形態(tài)分析法，該方法將分析時(shí)間縮短了46.8%，5種形態(tài)峰分離度更好、靈敏度更高。

關(guān)鍵詞：硒形態(tài)；液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法；梯度洗脫

Determination of 5 Selenium Species by Gradient Elution LC-ICP/MS

CHEN Siyi， TANG Qiong， HUANG Li， SHI Xiangdong， FAN Yunyan*

（Nanning Center for Disease Control and Prevention， Nanning 530023， China）

Abstract： A gradient elution liquid chromatography coupled with inductively coupled plasma-mass spectrometry （ICP/MS） method was established for determination of SeCys2， MeSeCys， Se（Ⅳ）， SeMet and Se（Ⅵ）. 5 selenium species samples were separated using a Hamilton PRP-X100 anion exchange column， with mobile phase A 40 mmol·L-1 （NH4）2HPO4+5 mmol·L-1 C6H8O7·H2O （pH=4.6） and mobile phase B 60 mmol·L-1 （NH4）2HPO4+5 mmol·L-1 C6H8O7·H2O （pH=4.6） at flow rate of 1.0 mL·min-1， and the mobile phase switching times were"3.0 min and 6.4 min， respectively， they were determined by ICP/MS and quantified with external standard calibration method. 5 selenium species were detected within 8.5 min. In the concentration range of 0.5～200.0 μg·L-1， the correlation coefficients （r） of the 5 selenium species were greater than 0.999. The limits of detection of the method were 0.10～0.39 μg·L-1. Compared with the method in GB/T 5750.6—2023， the analysis time of this method was shortened by 46.8 %， and the resolutions and sensitivities of 5 selenium species were better.

Keywords： selenium species; liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry; gradient elution

硒是人體的必需微量元素，與健康密切相關(guān)，在抗氧化、抗炎、增強(qiáng)免疫力、預(yù)防癌癥等方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。硒的安全濃度范圍很小，缺硒會(huì)引發(fā)克山病、地方性心肌炎等疾病，但攝入過(guò)量又會(huì)增加Ⅱ型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)，甚至導(dǎo)致硒中毒[3-4]。硒分為無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒形態(tài)，在土壤與環(huán)境中主要以無(wú)機(jī)硒形式存在，而在經(jīng)生物體轉(zhuǎn)換后的富硒食品中多以有機(jī)硒形式存在[5]。飲用水是人體攝入硒的重要來(lái)源之一，2023年10月1日實(shí)施的《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 第6部分：金屬和類金屬指標(biāo)》（GB/T 5750.6—2023）中，增加了亞硒酸根Se（Ⅳ）、硒酸根Se（Ⅵ）、硒代胱氨酸（SeCys2）、硒代蛋氨酸（SeMet）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）5種硒形態(tài)的液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，LC-ICP/MS）檢測(cè)方法，是我國(guó)第一個(gè)同時(shí)定量分析5種硒形態(tài)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，為我國(guó)飲用水中硒形態(tài)的存在形式和存量檢測(cè)提供了依據(jù)。但國(guó)標(biāo)法分析時(shí)間較長(zhǎng)，硒代蛋氨酸靈敏度不足，本研究擬用不同流動(dòng)相梯度洗脫對(duì)該法進(jìn)行優(yōu)化，以縮短分析時(shí)間，降低檢出限。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

按GB/T 5750.2—2023要求采集末梢水、江河水源水和瓶裝純凈水，以及經(jīng)過(guò)鏈蛋白酶消化的食品處理液。

磷酸氫二銨（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；檸檬酸（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；亞硒酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10032、硒酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10033、硒代蛋氨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10034、硒代胱氨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10087、甲基硒代半胱氨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10088（中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

LC300-ICPMS NexION5000G液相聯(lián)用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)鉑金埃爾默股份有限公司）；Hamilton PRP-X100陰離子色譜柱（美國(guó)哈密爾頓公司）；ADVANCED-I-12艾柯實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（成都艾柯水處理設(shè)備有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取適量的SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用水配制成1.0 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用水逐級(jí)稀釋至濃度為0.5～200.0 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

1.2.2 液相色譜條件

色譜柱：Hamilton PRP-X100陰離子交換色譜柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）；分別以不同流動(dòng)相、流速、洗脫時(shí)間分離50.0 μg·L-1的5種硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并以保留時(shí)間、峰面積、分離度等參數(shù)為指標(biāo)優(yōu)化色譜條件；進(jìn)樣體積：100 μL。

1.2.3 電感耦合等離子體質(zhì)譜條件

用ICP/MS調(diào)諧液調(diào)諧優(yōu)化儀器參數(shù)。射頻功率：1 600 W；霧化器氣流量：0.91 L·min-1；稀釋氣流量：0.15 L·min-1；補(bǔ)償氣流量：1.15 L·min-1；氦氣碰撞氣流量：3.5 L·min-1；檢測(cè)質(zhì)量數(shù)：78 amu；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速：60 r·min-1。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Clarity軟件對(duì)圖譜進(jìn)行鑒定分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel和GraphPad 8.0分析及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度磷酸氫二銨對(duì)不同硒形態(tài)分離的影響

按標(biāo)準(zhǔn)法以1.2 mL·min-1的流動(dòng)相流速，比較40 mmol·L-1、50 mmol·L-1、60 mmol·L-1磷酸氫二銨對(duì)5種硒形態(tài)保留時(shí)間的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度的磷酸氫二銨僅對(duì)Se（Ⅳ）、Se（Ⅵ）2種無(wú)機(jī)硒形態(tài)的保留時(shí)間影響較大，隨著濃度增加，其保留時(shí)間變短。當(dāng)磷酸氫二銨濃度為40 mmol·L-1時(shí)，Se（Ⅵ）的保留時(shí)間為15.296 min；濃度為60 mmol·L-1時(shí)，Se（Ⅵ）的保留時(shí)間為8.877 min，分析時(shí)間整體縮短。當(dāng)磷酸氫二銨濃度為60 mmol·L-1時(shí)，MeSeCys和Se（Ⅳ）的分離度只有1.416，未完全分離，濃度為40 mmol·L-1時(shí)前3個(gè)峰的分離度更好。綜上，分離SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）選用40 mmol·L-1磷酸氫二銨作為流動(dòng)相，分離SeMet、Se（Ⅵ）選用60 mmol·L-1磷酸氫二銨作為流動(dòng)相。

2.2 不同濃度檸檬酸對(duì)不同硒形態(tài)分離的影響

在眾多以Hamilton PRP-X100陰離子色譜柱為分析柱研究硒形態(tài)分離的研究中，常以磷酸氫二銨、檸檬酸為流動(dòng)相，還未有研究使用兩種鹽作為流動(dòng)相。本研究在40 mmol·L-1磷酸氫二銨（pH=6.0）的基礎(chǔ)上加入不同濃度的檸檬酸（并檢測(cè)加入檸檬酸后的pH值），以縮短Se（Ⅵ）的保留時(shí)間。結(jié)果顯示，檸檬酸對(duì)Se（Ⅵ）保留時(shí)間影響較大，隨著加入的檸檬酸濃度增加，其保留時(shí)間減小，見(jiàn)圖1。以上試驗(yàn)中，5種硒形態(tài)的分離度均＞1.5，檸檬酸加入濃度為

5 mmol·L-1時(shí)，分析時(shí)間9 min與8 mmol·L-1檸檬酸時(shí)間相當(dāng)，但分離度稍好（分離度＞2.0）。比較不同檸檬酸濃度分離峰的峰面積，結(jié)果顯示，除Se（Ⅳ）外，4種硒形態(tài)峰面積隨著檸檬酸濃度的增大而增大；在加入檸檬酸濃度≥5 mmol·L-1時(shí)，MeSeCys和SeMet峰面積顯著增大（P＜0.05）；加入濃度為8 mmol·L-1時(shí)，峰面積與5 mmol·L-1無(wú)顯著性差異，見(jiàn)圖2。說(shuō)明檸檬酸有促進(jìn)色譜柱保留分離硒形態(tài)的作用，一定程度上增強(qiáng)了分離效果，進(jìn)而降低了檢出限，尤其是提高了MeSeCys和SeMet的靈敏度。為了減少進(jìn)入ICP/MS的鹽分，綜合考慮選取40 mmol·L-1磷酸氫二銨+5 mmol·L-1檸檬酸（pH=4.6）作為分離SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）的流動(dòng)相。

不同字母表示組間具有顯著性差異，P＜0.05。

2.3 不同流動(dòng)相流速對(duì)不同硒形態(tài)分離的影響

分別用1.2 mL·min-1、1.0 mL·min-1、0.8 mL·min-1的流動(dòng)相流速分析5種硒形態(tài)，結(jié)果顯示，隨著流速的降低，5種形態(tài)的峰面積都有不同程度的增加；峰面積組間比較均具有顯著性差異（P＜0.05）。說(shuō)明流速為0.8 mL·min-1時(shí)，色譜柱的柱效最好，對(duì)5種形態(tài)的保留與分離效果最佳。從分析時(shí)間看，流速為1.2 mL·min-1時(shí)，總分析時(shí)間為9.0 min；流速為1.0 mL·min-1時(shí)，總分析時(shí)間為10.7 min；流速為0.8 mL·min-1時(shí)，總分析時(shí)間為13.4 min。雖然使用0.8 mL·min-1流動(dòng)相分析效果最佳，但分析時(shí)間長(zhǎng)，綜合考慮選用1.0 mL·min-1流速進(jìn)行分析。

2.4 梯度流動(dòng)相切換時(shí)間

以40 mmol·L-1磷酸氫二銨+5 mmol·L-1檸檬酸（pH=4.6）為流動(dòng)相A，1.0 mL·min-1的流速分析5種硒形態(tài)，在4.0 min已經(jīng)分析完前3種形態(tài)，SeMet和Se（Ⅵ）的保留時(shí)間相隔較遠(yuǎn)，使用梯度分離減小Se（Ⅵ）的保留時(shí)間。為保證柱子平衡，基線平穩(wěn)，梯度流動(dòng)相只增加磷酸氫二銨的濃度，即使用

60 mmol·L-1磷酸氫二銨+5 mmol·L-1檸檬酸（pH=4.6）為流動(dòng)相B。用流動(dòng)相B分析5種硒形態(tài)，發(fā)現(xiàn)Se（Ⅵ）出現(xiàn)裂峰，因此Se（Ⅵ）由流動(dòng)相A分離。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，0～3 min使用流動(dòng)相A，3.0～6.4 min使用流動(dòng)相B，6.4 min以后再切換回流動(dòng)相A至分析完畢，分離效果最好，分析時(shí)間為8.5 min，色譜圖見(jiàn)圖3（a）。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)使用40 mmol·L-1磷酸氫二銨（pH=6.0）為流動(dòng)相，流速為1.2 mL·min-1，進(jìn)行5種硒形態(tài)的色譜分離，分析時(shí)間為16 min，色譜圖見(jiàn)圖3（b）。相較于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，本方法分析時(shí)間縮短了46.8%。

2.5 方法線性范圍及檢出限

對(duì)優(yōu)化色譜條件后的方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，在0.5～200.0 μg·L-1，5種硒形態(tài)相關(guān)系數(shù)均＞0.999。以3倍基線噪聲時(shí)的硒形態(tài)濃度為檢出限，10倍基線噪聲時(shí)的硒形態(tài)濃度為定量限，確定SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）的檢出限分別為0.06 μg·L-1、0.07 μg·L-1、0.06 μg·L-1、0.21 μg·L-1、0.10 μg·L-1，定量限分別為0.20 μg·L-1、0.24 μg·L-1、0.22 μg·L-1、0.69 μg·L-1、0.32 μg·L-1，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 回收率與精密度

對(duì)末梢水、江河水源水、瓶裝純凈水以及經(jīng)過(guò)鏈蛋白酶消化的食品處理液分別進(jìn)行低、中、高3個(gè)濃度水平（5 μg·L-1、25 μg·L-1、50 μg·L-1）的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平制備6個(gè)平行樣品，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。瓶裝純凈水中5種硒形態(tài)的平均加標(biāo)回收率為97.0%～103.0%，RSD為0.78%～3.97%；末梢水中5種硒形態(tài)的平均加標(biāo)回收率為96.0%～104.2%，RSD為0.77%～5.48%；水源水中5種硒形態(tài)的平均加標(biāo)回收率為92.0%～102.6%，RSD為0.47%～3.99%；經(jīng)鏈蛋白酶消化后的食品處理液中5種硒形態(tài)的平均加標(biāo)回收率為89.4%～104.3%，RSD為1.32%～6.85%；可見(jiàn)方法精密度和準(zhǔn)確度均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 結(jié)論

本文對(duì)GB/T 5750.6—2023中10.5液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法檢測(cè)5種硒形態(tài)的方法進(jìn)行優(yōu)化，樣品通過(guò)Hamilton PRP-X100陰離子色譜交換柱，分別以流動(dòng)相A 40 mmol·L-1磷酸氫二銨+5 mmol·L-1檸檬酸（pH=4.6）和流動(dòng)相B 60 mmol·L-1磷酸氫二銨+5 mmol·L-1檸檬酸（pH=4.6）進(jìn)行梯度洗脫5種硒形態(tài)，流速為1.0 mL·min-1，切換時(shí)間分別為3.0 min和6.4 min，ICP/MS檢測(cè)，外標(biāo)法定量。本方法分析時(shí)間僅為8.5 min，較國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法（16 min）縮短了近一半的時(shí)間，最低檢測(cè)質(zhì)量濃度（即定量限）降低了2/3，使用的流動(dòng)相鹽離子總量減少了41.3%，增強(qiáng)了儀器的穩(wěn)定性和耐用性。本實(shí)驗(yàn)室用該法檢測(cè)生活飲用水及食品消化液，精密度及準(zhǔn)確度均滿足要求。

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基金項(xiàng)目：廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì)自籌經(jīng)費(fèi)科研課題（Z20200530，Z20200394）；廣西衛(wèi)生應(yīng)急技能培訓(xùn)中心2022年度開(kāi)放課題項(xiàng)目（HESTCG20225）；南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（ZC20223240）。

作者簡(jiǎn)介：陳思伊（1987—），女，廣西南寧人，碩士，副主任技師。研究方向：食品及水質(zhì)理化檢測(cè)。

通信作者：范云燕（1981—），女，廣西桂林人，碩士，主任技師。研究方向：食品及水質(zhì)理化檢測(cè)。E-mail：jiandan162@163.com。