摘 要：金黃色葡萄球菌可以在人體內(nèi)外寄生或污染食物，導(dǎo)致皮膚潰爛、免疫力下降和食物中毒等一系列癥狀，對(duì)人體健康構(gòu)成危害。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)具有反應(yīng)溫度低、反應(yīng)速率快和特異性高的特點(diǎn)，在不需要精密儀器的情況下能夠更準(zhǔn)確、高效、快速地檢測(cè)出金黃色葡萄球菌。本文主要通過綜述重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)在金葡菌檢測(cè)中的國內(nèi)外現(xiàn)狀以及其反應(yīng)機(jī)理、引物設(shè)計(jì)方法等內(nèi)容，探討了其中的意義和存在的問題，并展望了該領(lǐng)域未來的發(fā)展前景，旨在為公共衛(wèi)生和食品安全領(lǐng)域提供可行的解決方案。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)；等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；引物

Research Progress of RPA Amplification Technique in Detection of Staphylococcus aureus

ZHOU Yuxuan， WU Xuemei， SONG Shaozheng*

（School of Health and Nursing， Wuxi Taihu University， Wuxi 214000， China）

Abstract： Staphylococcus aureus can parasite or contaminate food inside and outside the human body， resulting in a series of symptoms such as skin ulceration， decreased immunity and food poisoning， posing a hazard to human health. Recombinase polymerase amplification technology has the characteristics of low reaction temperature， fast reaction rate and high specificity， and can detect Staphylococcus aureus more accurately， efficiently and quickly without the need of precision instruments. Therefore， this paper mainly reviewed the current situation of RPA amplification technology in Staphylococcus aureus detection at home and abroad， the reaction mechanism of recombinase polymerase amplification， primer design methods and other contents， discussed the significance and existing problems， and looked forward to the future development prospects of this field， aiming to provide feasible solutions for public health and food safety.

Keywords： Staphylococcus aureus; recombinase polymerase amplification; isothermal amplification technique; primer

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）也稱“金葡菌”，是一種常見的食源性致病微生物，在自然界中廣泛存在。它主要寄生于人體的皮膚、鼻腔、咽喉、胃腸、癰和化膿瘡口中，可引起一系列血液感染和化膿性疾病，對(duì)食品和醫(yī)療領(lǐng)域造成嚴(yán)重影響[1]。但抗生素的濫用，導(dǎo)致多重耐藥性SA大量出現(xiàn)[2]，因此快速有效地檢測(cè)和監(jiān)測(cè)SA的存在變得至關(guān)重要。PIEPENBURG等[3]于2006年首次提出重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技術(shù)。RPA是一種新型的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在25～43 ℃下反應(yīng)，且反應(yīng)速度較快，僅需5～15 min[4]。該技術(shù)不需要精密儀器，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[5]，因此在相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者中備受關(guān)注。本文通過總結(jié)RPA技術(shù)在金葡菌檢測(cè)中的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀、引物設(shè)計(jì)、探針設(shè)計(jì)等內(nèi)容，并展望了RPA技術(shù)在未來的發(fā)展前景，旨在為公共衛(wèi)生和食品安全領(lǐng)域提供參考。

1 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

1.1 發(fā)文量統(tǒng)計(jì)

2006年，Piepenburg首次提出RPA技術(shù)，至今一直是學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。但目前利用RPA技術(shù)進(jìn)行SA檢測(cè)的研究仍相對(duì)較少。通過PubMed和知網(wǎng)兩個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行關(guān)鍵詞檢索，時(shí)間范圍限定為2006—2023年，分別輸入“Recombinase Polymerase Amplification; Staphylococcus aureus”“重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)；金黃色葡萄球菌”，發(fā)現(xiàn)RPA技術(shù)應(yīng)用于SA快速檢測(cè)的發(fā)文量目前較少，兩個(gè)數(shù)據(jù)庫合計(jì)發(fā)文量?jī)H11篇，且主要集中在RPA技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、微生物檢驗(yàn)等領(lǐng)域的籠統(tǒng)概括，缺少具體的綜述。

1.2 國內(nèi)研究現(xiàn)狀

近年來，國內(nèi)研究人員開始探索利用RPA技術(shù)進(jìn)行SA的快速檢測(cè)。以往的研究表明，RPA技術(shù)在SA檢測(cè)中具有很高的特異性和靈敏度。例如，徐健皓等[6]基于exo-RPA技術(shù)原理，針對(duì)SA設(shè)計(jì)了多套R(shí)PA引物和含有修飾熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的RPA熒光探針，并構(gòu)建了SA-exo-RPA檢測(cè)體系，增強(qiáng)了SA的檢測(cè)率，證明了RPA技術(shù)在SA檢測(cè)中的潛力。此外，研究人員還聯(lián)合使用RPA技術(shù)與其他檢測(cè)方法，如王雨[7]通過將RPA與橫向流動(dòng)試紙條相結(jié)合來檢測(cè)SA，在研究中發(fā)現(xiàn)可以使敏感度達(dá)

20 CFU·mL-1，顯著提高了準(zhǔn)確性。高建欣等[8]則是通過將RPA與乳膠微球試紙條相結(jié)合，檢測(cè)限為

1.2 CFU·mL-1。這些研究結(jié)果顯示出該方法對(duì)SA極為敏感，通過與其他檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合，RPA技術(shù)可以對(duì)SA進(jìn)行更加高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)。

綜上，國內(nèi)利用RPA技術(shù)進(jìn)行SA的檢測(cè)已取得一定的進(jìn)展，先前的研究也為該技術(shù)的優(yōu)化改進(jìn)提供了技術(shù)支持。但目前仍然面臨著一些挑戰(zhàn)和限制，如細(xì)菌樣品中的抑制物和假陽性的干擾、靈敏度和穩(wěn)定度可進(jìn)一步提高等。因此，未來還需不斷優(yōu)化RPA技術(shù)的條件和方法。

1.3 國外研究現(xiàn)狀

外科醫(yī)生亞歷山大·奧格斯頓于1880年給一名位于蘇格蘭阿伯丁的潰瘍患者進(jìn)行治療時(shí)首次發(fā)現(xiàn)金葡菌[9]。自此，國外對(duì)SA的研究正式開始。近年來，RPA技術(shù)作為一種新興的核酸擴(kuò)增方法，不少外國學(xué)者進(jìn)行研究，MUNAWAR[10]的研究表明，RPA技術(shù)具有靈敏性高、恒溫?cái)U(kuò)增、適用性廣泛等優(yōu)點(diǎn)，能夠在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到寡菌量級(jí)的菌液，也證明了RPA技術(shù)在SA檢測(cè)中的巨大潛力。但由于RPA技術(shù)引物和探針目前還存在一定的技術(shù)壁壘，因此外國學(xué)者主要對(duì)RPA技術(shù)與其他檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行了探索。如將RPA技術(shù)與PCR、聚合物絮凝沉降等技術(shù)相結(jié)合以進(jìn)一步提高SA檢測(cè)準(zhǔn)確性和可靠性。TRAN等[11]將RPA技術(shù)與PCR技術(shù)聯(lián)合使用，創(chuàng)新出了一種基于重組酶聚合酶擴(kuò)增方法的等溫PCR檢測(cè)方法，提高了SA檢測(cè)靈敏度，縮短了檢測(cè)所需的時(shí)間。

綜上所述，RPA技術(shù)在與其他技術(shù)聯(lián)用后可以進(jìn)一步提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，對(duì)于檢測(cè)SA有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。未來的研究可以進(jìn)一步優(yōu)化RPA反應(yīng)條件，并探索其在實(shí)驗(yàn)室以及野外環(huán)境中的應(yīng)用潛力，推動(dòng)SA檢測(cè)技術(shù)發(fā)展不斷向前邁進(jìn)。

2 方法與技術(shù)

2.1 RPA的引物、探針設(shè)計(jì)

為了獲得高效、特異性和穩(wěn)定的RPA反應(yīng)，研究者們進(jìn)行了多方面的優(yōu)化。①引物的設(shè)計(jì)對(duì)于擴(kuò)增效果至關(guān)重要。RPA技術(shù)的引物設(shè)計(jì)要求通常比較嚴(yán)格，引物的長(zhǎng)短對(duì)擴(kuò)增結(jié)果起著決定性作用。過短會(huì)影響重組率，減慢擴(kuò)增速度，降低靈敏度；過長(zhǎng)會(huì)增加產(chǎn)生其他二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性，都在一定程度上影響了核酸擴(kuò)增產(chǎn)量。因此RPA反應(yīng)引物的推薦長(zhǎng)度為30～35個(gè)核苷酸[12]。此外，對(duì)引物GC堿基的含量應(yīng)控制在40%～60%，且連續(xù)的GC堿基不能超過4個(gè)[13]，在引物設(shè)計(jì)中需注意二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。②探針的優(yōu)化也是關(guān)鍵因素。與一般Taq Man探針相比，RPA探針具有更高的設(shè)計(jì)要求。RPA反應(yīng)目標(biāo)片段長(zhǎng)度應(yīng)少于

500 bp，最佳擴(kuò)增長(zhǎng)度以100～200 bp為宜。如四氫呋喃（Tetrahydrofuran，THF）位點(diǎn)的5’端正?？刂圃?/p>

30 bp，3’端正?？刂圃?5 bp。間隔越大導(dǎo)致基底值越高，信噪比越低，因此熒光團(tuán)與猝滅團(tuán)通常標(biāo)記在胸腺嘧啶上，且兩者的間距控制在1～5 bp，一般用THF取代1個(gè)核苷酸。C3-間隔通常被探針的3’端用來阻斷基團(tuán)進(jìn)行修飾封閉。

2.2 RPA檢測(cè)SA的原理

①RPA技術(shù)主要基于重組酶和DNA聚合酶的協(xié)同作用，使其在無須進(jìn)行溫度變化的環(huán)境下高效擴(kuò)增DNA。因此，在檢測(cè)SA時(shí)，首先識(shí)別并結(jié)合到雙鏈DNA的特定序列上，其中的DNA聚合酶在單鏈結(jié)合蛋白的保護(hù)下，沿著單鏈模板進(jìn)行快速且高效的DNA合成。整個(gè)過程無須復(fù)雜的溫度變化，可在23～45 ℃中穩(wěn)定擴(kuò)增，且只需15～20 min即可完成目標(biāo)擴(kuò)增[14]，節(jié)省了時(shí)間和成本。②進(jìn)行RPA檢測(cè)之前需要進(jìn)行SA的DNA提取。目前常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、鹽法和DNA提取試劑盒，其中最主要的是DNA提取試劑盒，其具有簡(jiǎn)便高效的特點(diǎn)，并且利用其特殊的試劑盒體系和離心柱技術(shù)可以快速地提取高質(zhì)量的DNA。

3 結(jié)語

RPA技術(shù)具有高靈敏性、特異性和廣泛的適用性等優(yōu)點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單易行，為基層醫(yī)療組織和資源匱乏地區(qū)快速有效的檢測(cè)病原菌，提供了可能[15]。但在目前的研究中RPA技術(shù)仍存在樣本前置處理煩瑣、菌液的假陽性干擾大等問題。①在檢測(cè)SA的研究進(jìn)展中需要繼續(xù)優(yōu)化和改進(jìn)RPA反應(yīng)體系，以提高其擴(kuò)增效率和特異性，并減少阻抗物質(zhì)對(duì)反應(yīng)的干擾?？赏ㄟ^優(yōu)化擴(kuò)增反應(yīng)體系的組分濃度和反應(yīng)條件；還可以通過引入新的輔助酶或輔助因子來提高反應(yīng)效率和特異性。②加強(qiáng)RPA與其他新興技術(shù)的結(jié)合。如CRISPR，可以減少非特異性擴(kuò)增和背景干擾，提高對(duì)SA檢測(cè)的準(zhǔn)確性與可靠性。綜上所述，利用RPA技術(shù)進(jìn)行SA檢測(cè)已經(jīng)取得了顯著的研究進(jìn)展，利用RPA技術(shù)進(jìn)行SA檢測(cè)具有重要的臨床應(yīng)用前景，在診斷和治療SA感染方面具有重要意義。

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基金項(xiàng)目：江蘇省高校自然科學(xué)基金（20KJB360007）；江蘇省高?！扒嗨{(lán)工程”優(yōu)秀青年骨干教師項(xiàng)目（蘇教師函〔2021〕11號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：周宇萱（2002—），女，安徽馬鞍山人，本科。研究方向：生物醫(yī)學(xué)。

通信作者：宋紹征（1984—），男，江蘇宿遷人，博士，副教授。研究方向：生物醫(yī)藥。E-mail：ssz0610@163.com。