周金勇　孫玲偉　張克勤　戴建軍　張德?！⊥跽駠≈餍浴遣束P

摘要：為鑒定上海地方豬種上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬中抗腹瀉基因抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體1（transporterassociatedwith antigen processing 1， TAP1）、α（1， 2）巖藻糖轉(zhuǎn)移酶1［α（ 1， 2）-fucosyltransferase 1， FUT1］、天然抗性相關(guān)的巨噬細(xì)胞蛋白1（natural resistance-associated macrophage protein 1， NRAMP1）、黏蛋白4（mucin 4，MUC4）和黏蛋白13（mucin 13， MUC13）基因的有效遺傳標(biāo)記，為上海地方豬種資源特性提供參考，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism， PCRRFLR）和序列測(cè)序分析上述基因的多態(tài)性，結(jié)合部分免疫相關(guān)因子，探討對(duì)3個(gè)上海地方豬種免疫力的影響。結(jié)果顯示，3個(gè)豬種中TAP1 和MUC4 基因均具有抗腹瀉基因型GG，而僅在楓涇豬和沙烏頭豬中檢測(cè)到MUC13基因抗腹瀉基因型GG，在3個(gè)豬種中均未檢測(cè)到FUT1 和NRAMP1 基因抗腹瀉基因型AA。上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬TAP1 基因處于中度多態(tài)，上海白豬的MUC4 基因處于低度多態(tài)，楓涇豬和沙烏頭豬的MUC4 基因處于中度多態(tài)，上海白豬MUC13 基因處于中度多態(tài)，其中上海白豬和沙烏頭豬的TAP1 基因不滿足Hardy-Weinberg平衡，楓涇豬的MUC4 基因不滿足Hardy-Weinberg平衡。上海白豬MUC13 基因AA型的白細(xì)胞介素12（interleukin-12， IL-12）水平顯著高于AG 型，楓涇豬TAP1 基因AA 型的腫瘤壞死因子α（tumor necrosisfactor， TNF-α）指標(biāo)顯著高于GG和AG型，沙烏頭豬TAP1 基因AG型的IL-12指標(biāo)顯著高于GG型。以上研究結(jié)果對(duì)上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬的抗腹瀉育種和分子選育具有一定指導(dǎo)意義，為今后上海各地方豬種抗腹瀉育種工作奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：上海白豬；楓涇豬；沙烏頭豬；抗腹瀉基因；免疫因子

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0229

中圖分類號(hào)：S828.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2024）04012816

根據(jù)2022年10月國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)，我國生豬存欄44 394萬頭，擁有相當(dāng)高的生豬存欄量，而豬腹瀉病常年頻發(fā)，致死率高，是嚴(yán)重制約我國乃至全世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一大難題[1]。當(dāng)前，對(duì)豬群的抗腹瀉相關(guān)基因通過分子育種技術(shù)進(jìn)行其等位基因頻率的檢測(cè)與分析，從而用于指導(dǎo)豬群育種，從育種角度提高豬群整體的抗腹瀉能力，進(jìn)而從根本上解決生豬腹瀉病帶來的經(jīng)濟(jì)損失。

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（enterotoxi-genic escherichiacoli， ETEC）F18的候選基因主要是α （1， 2）巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因1[α （1， 2）-fucosyltransferase1， FUT1]和抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體基因（transporter-associatedwith antigen processing 1， TAP1）[23]。Meijerink等[4]研究發(fā)現(xiàn)，瑞士長(zhǎng)白豬FUT1 基因的A 型可抗ETEC F18的感染。Kim等[5]進(jìn)一步證明，F(xiàn)UT1 基因的AA基因型個(gè)體的仔豬存活率幾乎是GG個(gè)體的2倍。因此，F(xiàn)UT1 基因多態(tài)性可用作選擇程序的有效標(biāo)記，以提高斷奶后仔豬的存活率。趙喬輝等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在淮豬、榮昌豬和長(zhǎng)白豬等豬種中TAP1 基因的GG型個(gè)體有更強(qiáng)的抗ETEC F18感染的能力，可將TAP1 基因作為豬抗腹瀉育種的有效遺傳標(biāo)記之一。天然抗性相關(guān)的巨噬蛋白1（natural resistance-associated macrophage protein 1，NRAMP1）基因能夠影響動(dòng)物機(jī)體的抗病性能，豬NRAMP1 基因AA基因型為抗腹瀉優(yōu)勢(shì)基因型[7]。劉艷冬等[8]通過觀測(cè)記錄哺乳仔豬的腹瀉情況發(fā)現(xiàn)，NRAMP1 在各品種豬中表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，進(jìn)一步證明NRAMP1 可作為豬抗病育種候選基因。粘蛋白4（mucin 4， MUC4）和粘蛋白13（mucin 13， MUC13）基因是ETEC F4ab/F4ac 受體的重要候選基因[9-11]。Peng 等[12]研究表明，豬對(duì)ETEC F4ab/ac 感染的易感性/抗性與MUC4 基因內(nèi)含子17中的G243位點(diǎn)A→G突變顯著相關(guān)，且GG 型是抗腹瀉基因型。任軍等[13] 也發(fā)現(xiàn)，MUC13 基因的rs319 699 771位點(diǎn)上存在G→A突變，GG型為抗腹瀉基因型，且通過鑒定該位點(diǎn)突變能夠鑒別抗腹瀉個(gè)體。因此，MUC4 和MUC13基因被視為F4ab/F4ac 受體最有希望的候選基因。

本研究對(duì)上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬部分抗腹瀉基因（TAP1、FUT1、NRAMP1、MUC4 和MUC13）的基因多態(tài)性進(jìn)行篩查，并結(jié)合部分血液免疫因子，如免疫球蛋白（immunoglobulin， IgG）、白細(xì)胞介素2（interleukin-2， IL-2）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6， IL-6）、白細(xì)胞介素10（interleukin-10， IL-10）、白細(xì)胞介素12（interleukin-12， IL-12）、腫瘤壞死因子ɑ（tumor necrosis factor， TNF-ɑ）、干擾素γ（interferon γ， IFN-γ）等，進(jìn)一步分析上述豬種的抗腹瀉能力，以期為提高上述豬種抗腹瀉育種工作提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 采樣

本研究中使用的動(dòng)物為90 頭后備種公豬（200～300日齡），包括3種中國上海本土豬：上海白豬（30頭）、楓涇豬（30頭）和沙烏頭豬（30頭），分別來自上海農(nóng)系白豬種原種場(chǎng)、上海金山楓涇豬保種場(chǎng)和上海崇明沙烏頭農(nóng)業(yè)科技有限公司。試驗(yàn)豬種圍欄中單獨(dú)飼養(yǎng)，每天按照標(biāo)準(zhǔn)飼喂，并隨意飲用水，按照《中國豬飼喂標(biāo)準(zhǔn)指南》[14]進(jìn)行病害控制。每個(gè)豬種分別采集血液樣本各30份抗凝血用于提取DNA，30份未抗凝血用于測(cè)定部分免疫因子。采集的未抗凝血經(jīng)4 000 r· min-1離心20 min后分離血清，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 DNA 提取

按照血液全基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]使用說明書，對(duì)豬血液樣品進(jìn)行DNA 提取。利用紫外分光光度計(jì)（eppendorf公司）對(duì)提取的DNA含量進(jìn)行測(cè)定，選擇含量在80～250 μg· μL-1的樣品進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA 的質(zhì)量，統(tǒng)一稀釋至50 ng·μL-1，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性酶切酶段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。

在NCBI 上查找相關(guān)序列，使用PrimerPremier 6.0 軟件設(shè)計(jì)FUT1、NRAMP1、TAP1、MUC13 和MUC4 基因的引物（表1），由中國上海生工生物工程有限公司合成。

PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包含template DNA2μL，2× M5 Taq hifi PCR mix 10 μL，primer 1（10 μmol·L-1）0.5 μL，primer 2（10 μmol·L-1）0.5 μL，nuclease-free ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 4 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸（TAP1 和FUT1 為60 s，循環(huán)30 次；NRAMP1 為45 s，循環(huán)29 次；MUC4 為15 s，循環(huán)34次；MUC13 為45 s，循環(huán)35次）；72 ℃延伸5 min，并置于4 ℃保存待用（PCR儀購自美國ABI公司）。

TAP1 基因選用MboI [寶如億（北京）生物技術(shù)有限公司]對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，酶切反應(yīng)總體系為10 μL，包括PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物0.4 μL，restrictionenzyme 0.4 μL（10 U·μL-1），10× NE buffer 1 μL，ddH2O 8.2 μL，置37 ℃恒溫反應(yīng)2 h，65 ℃溫育20 min后經(jīng)1.5％的瓊脂糖凝膠電泳后分析。

FUT1 與MUC4 基因選用HhaⅠ [寶如億（北京）生物技術(shù)有限公司]，NRAMP1 基因選用NdeⅠ[寶如億（北京）生物技術(shù)有限公司]對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化。酶切反應(yīng)總體系為10 μL，包括PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL（500 ng· μL-1），RE10× buffer 1 μL，acetylated BSA 0.1 μL（10 μg·μL-1），restrictionenzyme 0.25 μL（10 U·μL-1），ddH2O 7.65 μL，置37 ℃恒溫反應(yīng)2 h，后添加4 μL 6×加載緩沖液經(jīng)1.5％的瓊脂糖凝膠電泳后分析。由于MUC13 無特異性內(nèi)切酶位點(diǎn)，故不進(jìn)行酶切。

將上述PCR產(chǎn)物切膠回收純化后，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司單向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAstar軟件分析。

1.4 血液免疫因子測(cè)定

采用ELISA免疫因子檢測(cè)試劑盒（elabsciencebiotechnology Co.， Ltd.）測(cè)定樣品吸光度，吸光度值用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于測(cè)量以下免疫因子：IgG（DG50 132P-96T）、IL-2（DG50 032P-96T）、IL-6（DG50 031P-96T）、IL-10（DG50 034P-96T）、IL-12（DG50 055P-96T）、TNF- ɑ（DG50 014P-96T）和INF-γ（DG50 141P-96T）[15-17]。所測(cè)指標(biāo)作為上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬免疫應(yīng)答和一般抗病力的評(píng)價(jià)。按照使用說明具體操作方法如下：首先，從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4 ℃；設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同含量的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；樣本孔先加待測(cè)樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL；空白孔不加；除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase， HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，用封板膜密封反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min；棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）；每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品含量作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本含量（pg·mL-1）。所有免疫因子指標(biāo)檢測(cè)方法相同。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)序結(jié)果利用NCBI 系統(tǒng)中BLAST 進(jìn)行比對(duì)，鑒定SNP 位點(diǎn)，根據(jù)Hardy-Weinberg 平衡定律，計(jì)算基因的基因型頻率。采用適合性檢驗(yàn)法，進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)、卡方（χ2）獨(dú)立性檢驗(yàn)分析，計(jì)算各基因的等位基因和基因型頻率。群體內(nèi)遺傳變異和分化的相關(guān)參數(shù)通過popgene3.1 軟件計(jì)算獲得。采用cervus 3.0 軟件計(jì)算基因的多態(tài)信息含量（polymorphism informationcontent， PIC）、觀測(cè)雜合度（observed heterozygosity，Ho）和期望雜合度（expected heterozygosity， He）；其中PIC≥0.50時(shí)為高度多態(tài)，0.25≤PlC<0.50時(shí)為中度多態(tài)，PIC<0.25時(shí)為低度多態(tài)。各性狀值與基因型的關(guān)系采用SPSS 14.0軟件進(jìn)行最小二乘分析，其中P<0.05為顯著相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)TAP1、FUT1、NRAMP1、MUC4 和MUC13基因的引物對(duì)上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬提取的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物用1.5% 的瓊脂糖電泳檢測(cè)。由圖1 可見，TAP1、FUT1、NRAMP1、MUC4 和MUC13 基因在不同豬種中均擴(kuò)增出清晰的特異性條帶，片段大小分別為767、421、483、220和230 bp，與預(yù)測(cè)的擴(kuò)增片段大小一致。

2.2 PCR 產(chǎn)物的酶切結(jié)果

由圖2可知，上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬的TAP1 基因PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶MboⅠ酶切，經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后得到上海白豬有2種不同基因型（AG和GG），楓涇豬和沙烏頭豬有3種不同的基因型條帶，分別為AA、GG和AG。根據(jù)酶切結(jié)果，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在測(cè)序峰圖中部分豬種個(gè)體的TAP1 基因有1個(gè)G→A的單堿基突變，將該位點(diǎn)未突變呈現(xiàn)單峰的基因型定義為AA型，將該位點(diǎn)突變呈現(xiàn)單峰的基因型定義為GG型，呈現(xiàn)雙峰的基因型定義為AG型（圖2D）。GG 型個(gè)體的序列與NCBI 中AK396698.1的序列一致，定義為野生型，相比之下發(fā)現(xiàn)GG 型在第729位置有1個(gè)G→A 的單堿基突變，這與酶切結(jié)果一致（圖2E）。

上述豬種FUT1 基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶MboⅠ酶切，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后得到3個(gè)豬種的FUT1 基因都只有1種基因型條帶，為GG表型（241/93/87 bp）（圖3）。根據(jù)酶切結(jié)果對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序峰圖分析發(fā)現(xiàn)，在測(cè)序峰圖中所有豬種個(gè)體的FUT1 基因都不存在單堿基突變，將該位點(diǎn)未突變呈現(xiàn)單峰的基因型定義為GG型（圖3D）。所有豬種GG型個(gè)體的序列與NCBI中U70 883.2的序列一致，這與酶切結(jié)果一致，沒有發(fā)現(xiàn)突變的基因位點(diǎn)。

3個(gè)豬種NRAMP1 基因第6內(nèi)含子的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeⅠ酶切，經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后得到3個(gè)豬種的NRAMP1 基因都只有1種基因型條帶，為BB表型（373/110 bp）（圖4）。根據(jù)酶切結(jié)果對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在測(cè)序峰圖中所有豬種個(gè)體的NRAMP1基因都不存在單堿基突變，將該位點(diǎn)未突變呈現(xiàn)單峰的基因型定義為BB型（圖4D）。所有豬種個(gè)體的序列與NCBI中上AY368 473.1的序列一致，這與酶切結(jié)果一致，沒有發(fā)現(xiàn)突變的基因位點(diǎn)（圖4E）。

對(duì)上海白豬、楓涇豬的MUC4 基因擴(kuò)增得到的所有PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，對(duì)所得測(cè)序峰圖（圖5）分析發(fā)現(xiàn)，部分豬種的MUC4 基因有1個(gè)G→A的單堿基突變，將該位點(diǎn)未突變呈現(xiàn)單峰的基因型定義為GG型，將該位點(diǎn)突變呈現(xiàn)單峰的基因型定義為AA型，呈現(xiàn)雙峰的基因型定義為AG型（圖5B）。對(duì)沙烏頭豬的MUC4 基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶HhaⅠ酶切后，經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后都得到了3種不同的基因型條帶，分別命名為AA、GG和AG，抗性等位基因（A）不能被HhaI 消化，為AA型（367 bp），而敏感等位基因被消化成2個(gè)片段，為GG型（151/216 bp）。2個(gè)基因型同時(shí)存在時(shí)為AG型（151/216/367 bp），如圖5所示。根據(jù)酶切結(jié)果，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在測(cè)序峰圖中沙烏頭豬部分豬種的MUC4 基因有1 個(gè)G→A 的單堿基突變。將上述豬種的MUC4 基因所測(cè)序列與NCBI中KT966 749的序列對(duì)比，AA型個(gè)體的序列與其一致，定義為野生型，相比之下發(fā)現(xiàn)GG型有1個(gè)G→A的單堿基突變，這與酶切結(jié)果一致。

對(duì)上述豬種的MUC13 基因擴(kuò)增得到的所有PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，得到測(cè)序峰圖與基因序列，對(duì)所得的測(cè)序峰圖進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，上海白豬中有部分豬種存在G→A的單堿基突變，楓涇豬和沙烏頭豬的所有個(gè)體都存在G→A 的單堿基突變，將該位點(diǎn)未突變呈現(xiàn)單峰的基因型定義為AA型，將該位點(diǎn)突變呈現(xiàn)單峰的基因型定義為GG型，呈現(xiàn)雙峰的基因型定義為AG型（圖6A）。得到的序列與NCBI上JN613 418.1對(duì)比，所有個(gè)體的對(duì)比結(jié)果與測(cè)序峰圖一致（圖6B）。

2.3 TAP1、FUT1、NRAMP1、MUC4 和MUC13基因型和等位基因頻率分析

利用PCR-RFLP方法對(duì)3個(gè)豬群個(gè)體進(jìn)行檢驗(yàn)，分型后計(jì)算各豬群的基因型和等位基因頻率，結(jié)果如表2所示。上海白豬中TAP1 基因有1個(gè)等位基因，2種基因型（AG和GG），其中AG、GG基因型數(shù)量和基因型頻率分別為17、13和0.57、0.43；抗病等位基因G的頻率為0.72，敏感等位基因A的頻率為0.28。楓涇豬TAP1 基因的AA、AG、GG基因型數(shù)量及基因型頻率分別為3、11、16 和0.10、0.37、0.53，抗病等位基因G和敏感等位基因A的頻率分別為0.72和0.28。在檢測(cè)的30個(gè)沙烏頭豬樣本中，TAP1 基因的AA、AG、GG 基因型數(shù)量分別為1、19、10，基因型頻率分別為0.03、0.63、0.33，抗病等位基因G的頻率為0.65，敏感等位基因A的頻率為0.35。在3個(gè)豬群中，AA型的頻率不高，總體上等位基因G為優(yōu)勢(shì)等位基因。

在檢測(cè)的所有豬種的樣本中，F(xiàn)UT1 基因只檢測(cè)出敏感基因型GG型，等位基因G為優(yōu)勢(shì)等位基因。

對(duì)NRAMP1 基因的檢測(cè)表明，3 個(gè)地方豬種中沒有出現(xiàn)抗病基因型AA型，只檢測(cè)出敏感基因型BB型，等位基因B為優(yōu)勢(shì)等位基因。

如表2所示，共檢測(cè)出MUC4 基因的1對(duì)等位基因，3個(gè)豬種均檢測(cè)出3種基因型，但在各個(gè)豬種中所含有的基因型和基因頻率有差異；在上海白豬中，MUC4 基因的AA、GG、AG基因型數(shù)量及頻率分別為1、25、4 和0.03、0.83、0.13，其中G 為優(yōu)勢(shì)等位基因。在楓涇豬中MUC4 基因的AA、GG、AG 基因型數(shù)量及頻率分別為10、1、19 和0.33、0.03、0.63，其中A為優(yōu)勢(shì)等位基因。在沙烏頭豬中MUC4 基因的AA、GG、AG 基因型數(shù)量及頻率分別為6、10、14和0.20、0.33、0.47，其中G為優(yōu)勢(shì)等位基因。

3個(gè)地方豬種中MUC13 基因共檢測(cè)出1對(duì)等位基因，檢測(cè)出AA、GG和AG共3種基因型，上海白豬中檢測(cè)出2種基因型（AA和AG），楓涇豬和沙烏頭豬只檢測(cè)出了1種基因型（GG），在上海白豬中AA和AG基因型頻率分別為0.87和0.13，其中A為優(yōu)勢(shì)等位基因。

2.4 TAP1、FUT1、NRAMP1、MUC4 和MUC13基因的遺傳多態(tài)性分析

由表3 可知，上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬TAP1 基因的多態(tài)信息含量（PIC）處于0.25～0.50，都屬于中度多態(tài)。沙烏頭豬的Ho、He和PIC值均比上海白豬和楓涇豬高，表明其遺傳多樣性高于其他2個(gè)品種。上海白豬和沙烏頭豬的χ20.05（1）<χ2<χ20.01（1）（χ20.05（1）=3.84，χ20.01（1）=6.63），0.010.05，差異不顯著，滿足Hardy-Weinberg平衡。

對(duì)上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬FUT1 和NRAMP1 基因的酶切與測(cè)序結(jié)果顯示，只有GG和BB 基因型，無法進(jìn)行遺傳多態(tài)性和Hardy-Weinberg平衡分析。

上海白豬的MUC4 基因的PIC<0.25，屬于低度多態(tài)，楓涇豬和沙烏頭豬的MUC4 基因PIC 處于0.25～0.50，屬于中度多態(tài)。沙烏頭豬的He 與PIC值均高于楓涇豬和沙烏頭豬，表明沙烏頭豬的遺傳多態(tài)性高于其他2個(gè)品種，經(jīng)過比對(duì)，3個(gè)品種中上海白豬遺傳多態(tài)性最低。分析發(fā)現(xiàn)，上海白豬和沙烏頭豬χ2<χ20.05（1），P>0.05，差異不顯著，滿足Hardy-Weinberg 平衡。楓涇豬χ20.05（1）<χ2<χ20.01（1），0.01

上海白豬MUC13 基因PIC<0.25，屬于低度多態(tài)。χ2<χ20.05（1），P>0.05，差異不顯著，滿足Hardy-Weinberg平衡。然而，楓涇豬和沙烏頭豬MUC13基因僅有GG基因型，無法繼續(xù)進(jìn)行遺傳多態(tài)性和Hardy-Weinberg平衡分析。

2.5 上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬免疫因子的測(cè)定分析

不同豬種免疫因子測(cè)定結(jié)果見表4，上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬之間血液免疫因子平均水平無顯著差異（P>0.05）。分析發(fā)現(xiàn)，沙烏頭豬的IL-12和TNF-α免疫因子均比上海白豬和楓涇豬高。其中，IL-6免疫因子水平與其正好相反，上海白豬血液中IL-6水平高于楓涇豬和沙烏頭豬。楓涇豬的IFN-γ、IL-10和IgG 的水平比上海白豬和楓涇豬高，其中IL-10和IgG的水平較低的是沙烏頭豬。上海白豬IL-2的水平較高，楓涇豬IL-2的水平低于其他2個(gè)豬種。

2.6 TAP1、FUT1、NRAMP1、MUC4 和MUC13基因多態(tài)性與免疫因子相關(guān)性分析

由于FUT1 和NRAMP1 基因只檢測(cè)出1種基因型，所以這2個(gè)基因不與免疫因子進(jìn)行相關(guān)性分析。如表5所示，上海白豬的TAP1 基因各基因型個(gè)體表達(dá)的免疫因子的量差異不顯著（P>0.05），但GG基因型的IFN-γ、IL-12、IgG、TNF-α免疫因子水平高于AG基因型，AG基因型的IL-2、IL-6和IL-10的免疫因子水平高于GG基因型。在上海白豬中，MUC4 基因由于AA 型只檢測(cè)出1個(gè)，AA型免疫因子與GG和AG不作比較，通過最小二乘法分析，GG和AG型各免疫因子不存在顯著差異（P>0.05）。MUC13 基因由于沒有檢測(cè)到GG 基因型，GG 型免疫因子與AA 和AG 不作比較，通過最小二乘法分析，AA型的IL-12水平顯著高于AG型（P<0.05）。其他免疫因子AA和AG型之間不存在顯著差異（P>0.05）。

對(duì)楓涇豬TAP1 基因的各基因型的免疫因子的分析可知，TNF-α在3個(gè)基因型豬中存在明顯差異，其中AA 型的TNF-α 水平顯著高于GG 和AG型（P<0.05）。其他免疫因子在各基因型間不存在差異，但從結(jié)果看，AA型中IL-2的水平高于GG和AG型，其中AG型IL-2水平較低。GG型中IFN-γ和IL-10水平高于AA和AG型，其中AA型的IFN- γ 和IL-10 水平較低。IL-6 水平AG 型較高，GG 型較低。AG 型的IL-12 水平高于AA 和GG，AA型的IL-12水平較低。還可以看出，GG的IgG 水平高于AA 和AG，其中AG 型水平相對(duì)較低。楓涇豬MUC4 基因由于GG型只檢測(cè)出1個(gè)，GG型免疫因子與AA和AG不作比較，通過最小二乘法分析，GG 和AG 型免疫因子不存在差異（P>0.05）。

在沙烏頭豬中，TAP1 基因由于AA型只檢測(cè)出1個(gè)，AA型免疫因子與GG和AG不作比較，通過最小二乘法分析，GG 型的IL-12水平與AG 型之間存在顯著差異（P<0.05），其他免疫因子的GG和AG型之間不存在顯著差異。從表4可知，GG型的IFN-γ、IL-2和IgG高于AG型。AG型的IL-6和IL-12 高于GG 型。GG 型與AG 型的TNF-α 水平趨于一致。沙烏頭豬中MUC4 各基因型的免疫因子沒有顯著差異（P>0.05）。

3 討論

3.1 抗腹瀉基因的多態(tài)性

本研究對(duì)上海地區(qū)上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬3個(gè)地方豬種的TAP1 基因外顯子3多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，上海白豬檢測(cè)到AG和GG型，楓涇豬和沙烏頭豬都檢測(cè)到AA、AG和GG 3種基因型，其中G為優(yōu)勢(shì)等位基因。趙喬輝等[6]研究發(fā)現(xiàn)，中國本地豬種與亞洲野豬及國外引進(jìn)豬品種的基因頻率存在明顯差異，外來引進(jìn)豬的等位基因G頻率相對(duì)較高，而中國地方豬種（淮豬和榮昌豬等）的A頻率相對(duì)較高，這與本研究結(jié)果一致，本研究中上海白豬沒有檢測(cè)出AA型基因，可能是因?yàn)樯虾０棕i是與外國豬種培育的結(jié)果。Zhao 等[18]報(bào)道，蘇太豬TAP1 基因G729A突變顯著影響mRNA表達(dá)，且GG基因型個(gè)體抗腹瀉能力顯著高于其他2種基因型的個(gè)體。因此，TAP1 基因的GG基因型可作為抗腹瀉感染的候選基因型。

本研究中，F(xiàn)UT1 基因M307位點(diǎn)結(jié)果顯示，3個(gè)地方豬種均僅存在1 種不抗病基因型（GG）。張雄等[19]發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)地方品種只含有GG型，而國外及國內(nèi)雜交培育品種豬FUT1 基因M307位點(diǎn)中含有AA、AG 和GG 基因型，其中GG 為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)基因型。推測(cè)FUT1 基因抗病性等位基因A在中國地方豬種中呈極端偏態(tài)分布，AA抗病基因型可能來源于外國豬種。這一結(jié)果也與Yan等[20]和吳華莉等[21]的研究結(jié)果一致，可能是上海的幾個(gè)地方豬種與國內(nèi)外豬種基因交流較少，具有上海本地獨(dú)特的遺傳資源性。也有學(xué)者在中國上海的浦東白豬中檢測(cè)出了抗病基因GG型[22]，可能是由于浦東白豬作為本土種豬和國外豬種雜交，使AA抗病基因型得到遺傳。

作為相對(duì)比較保守的基因，NRAMP1 基因會(huì)對(duì)動(dòng)物自身免疫產(chǎn)生影響，且對(duì)沙門氏菌及多種胞內(nèi)寄生病原菌具有抗病[23]。本研究利用PCRRFLP技術(shù)，在3個(gè)豬種中均未檢測(cè)到AA型，只檢測(cè)到BB 型。楊軍等[24] 在多個(gè)豬種中檢測(cè)到NRAMP1 基因的AB和BB型，均未檢測(cè)到抗病基因型AA型。但劉艷冬[25]研究發(fā)現(xiàn)，貴州地方豬種NRAMP1 基因內(nèi)含子6具有豐富多態(tài)性，其中香豬抗病基因型AA型比例為26%、糯米豬為20%、宗地花豬為7.5%、大約克豬為4.3%。其他學(xué)者在中國的其他地方豬種中也檢測(cè)到有AA型[22]。可能是上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬在長(zhǎng)期的進(jìn)化選擇中，該基因的個(gè)體逐漸被淘汰，群體該位點(diǎn)的遺傳平衡從而被打破。

研究表明，MUC4 基因可以作為F4ab/F4ac抗性的候選基因，且G為控制F4ac大腸菌抗性等位基因[2627]。本研究對(duì)上海地區(qū)3 個(gè)地方豬種的MUC4 基因第17 內(nèi)含子243 位點(diǎn)多態(tài)性鑒定發(fā)現(xiàn)，在該位點(diǎn)共檢測(cè)到了1 個(gè)等位基因及AA、AG、GG共3種基因型，其中上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬中都檢測(cè)到3種基因型。在上海白豬和沙烏頭豬中G為優(yōu)勢(shì)等位基因，楓涇豬中A為優(yōu)勢(shì)等位基因。李聰聰?shù)萚28]研究表明，淮南豬和太白豬的MUC4 基因檢測(cè)出3 種基因型AA、AG 和GG，這與本研究結(jié)果相似，在Liu 等[27]和李聰聰?shù)萚28]研究中，GG型個(gè)體對(duì)抗ETEC F4ab/F4ac感染能力高于其他基因型。本研究中，3個(gè)地方豬種都存在GG型抗病基因，可以通過選育來實(shí)現(xiàn)群體抗ETEC F4ab/F4ac感染。

MUC13 基因被定位于豬13號(hào)染色體長(zhǎng)臂41區(qū)的Sw207和S0075之間，研究表明，MUC13 基因是決定仔豬F4ac腹瀉易感/抗性的基因之一[29-31]。本研究對(duì)上海地區(qū)3個(gè)地方豬種的MUC13 基因第2內(nèi)含子多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，在該位點(diǎn)共檢測(cè)到了1個(gè)等位基因和AG、GG 2種基因型。其中上海白豬檢測(cè)到2種基因型，楓涇豬和沙烏頭豬只檢測(cè)出抗病基因型GG型，其中G為優(yōu)勢(shì)等位基因。與本研究的結(jié)果相似，楊明等[32]研究杜洛克豬和皮特豬中MUC13 基因的分子標(biāo)記輔助選擇發(fā)現(xiàn)，2個(gè)豬種中G為優(yōu)勢(shì)等位基因；任軍等[13]發(fā)現(xiàn)，該基因在rs319699771 位點(diǎn)的GG 型為優(yōu)勢(shì)抗腹瀉基因型，而AG型和AA型為易感腹瀉基因型。本研究發(fā)現(xiàn)，楓涇豬和沙烏頭豬只存在抗病基因型GG型，可能是這2個(gè)豬種在長(zhǎng)期的進(jìn)化選擇中，該基因的個(gè)體逐漸被保留，形成了抗病基因型的種群。

3.2 遺傳多態(tài)性分析

作為群體內(nèi)遺傳變異的檢測(cè)參數(shù)，PIC、Ho和He 數(shù)值反映了群體內(nèi)個(gè)體的均質(zhì)度，其數(shù)值越高，說明遺傳變異性就越大，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，具有較大的選擇潛力，應(yīng)用于遺傳育種效果越好，反之則說明該群體雜合度小、基因純合度高，可以看作純系加以利用[33-35]。上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬TAP1 基因的PIC處于0.25～0.50，都屬于中度多態(tài)。沙烏頭豬的TAP1 基因Ho和He值高于上海白豬和楓涇豬，說明沙烏頭豬遺傳多樣性豐富，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)，遺傳潛力大。經(jīng)過分析，TAP1 基因在上海白豬和沙烏頭豬中不滿足Hardy-Weinberg平衡，這一結(jié)果與在浦東白豬、皖南黑豬、霍壽黑豬和梅山豬等地方豬種中的研究結(jié)果一致，TAP1 基因偏離了Hardy-Weinberg 平衡[6， 22]。楓涇豬中滿足Hardy-Weinberg平衡，說明TAP1 基因在楓涇豬中基本處于自由交配的狀態(tài)，也就是群體的選育對(duì)TAP1 基因沒有造成影響，對(duì)現(xiàn)在的選育性狀沒有作用。這與前人在杜洛克、大白和長(zhǎng)白中的研究結(jié)果一致[6]。

上海白豬的MUC4基因?qū)儆诘投榷鄳B(tài)（<0.25），而楓涇豬和沙烏頭豬的MUC4 基因?qū)儆谥卸榷鄳B(tài)。沙烏頭豬He值比其他2個(gè)豬種高，與PIC值的變化趨勢(shì)一致，說明沙烏頭豬的遺傳多態(tài)性較高，可作為抗病育種的標(biāo)記輔助性選擇。上海白豬MUC4 基因的PIC較低，說明遺傳變異性較低，但分析發(fā)現(xiàn)上海白豬和沙烏頭豬滿足Hardy-Weinberg平衡，楓涇豬不滿足Hardy-Weinberg平衡。說明人工選擇影響了MUC4 基因抗腹瀉基因型在楓涇豬中的分布。上海白豬MUC13 基因?qū)儆诘投榷鄳B(tài)，滿足Hardy-Weinberg平衡。此外，本試驗(yàn)中有部分豬種基因位點(diǎn)偏離了Hardy-Weinberg平衡。可能是由于群體研究的樣本量不夠或者群體內(nèi)近交積累過高[36]。本研究的上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬品系樣本量都達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但分析3個(gè)品種的基因多態(tài)性以及雜合度，結(jié)果表明，群體中出現(xiàn)近交積累過高和部分等位基因缺失的問題。進(jìn)一步分析群體出現(xiàn)連鎖不平衡，主要是由于目前上海白豬、楓涇豬和沙烏頭豬群體在保種過程中出現(xiàn)了高度近交或遺傳漂變，而這與上述豬種后期的品種改良有關(guān)。

3.3 抗腹瀉基因多態(tài)性與免疫因子相關(guān)性分析

IgG是在針對(duì)外來抗原的免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生的主要免疫球蛋白類別，通過其雙功能特性有效地提供保護(hù)，血清中IgG含量可以代表機(jī)體體液的免疫狀態(tài)[37]。IL-2、IL-6、IL-10 和IL-12 在機(jī)體免疫系統(tǒng)中具有重要作用，其中IL-2主要是激活免疫，IL-6 和IL-10 主要參與炎癥反應(yīng)[38-40]。IL-12主要是促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖，也被證明可以促進(jìn)Thl細(xì)胞的分化和增殖，阻止瘧疾的傳播[4142]。作為一種強(qiáng)烈抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，IFN-γ在機(jī)體免疫系統(tǒng)中具有重要作用[43]。TNF-α屬于腫瘤壞死因子超家族的一員，在機(jī)體內(nèi)可抑制病毒復(fù)制、病原體的擴(kuò)散，并預(yù)防腫瘤發(fā)生，是重要的抗病因子[44]。上述血清學(xué)免疫因子，都是機(jī)體免疫不可缺少，它們之間互相影響、互相調(diào)節(jié)，存在密切聯(lián)系。本研究對(duì)3個(gè)豬種的上述免疫因子分析顯示，各豬種間的免疫因子水平均差異不顯著，但在沙烏頭豬中IL-6指標(biāo)低于其他2個(gè)豬種。研究表明，低水平IL-6更具有抗病優(yōu)勢(shì)[45]，說明沙烏頭豬的抗病性可能更高。此外，對(duì)上海地區(qū)3個(gè)地方豬種的部分抗腹瀉基因的基因型與部分免疫因子進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，在上海白豬中僅有MUC13 基因AA型的IL-12免疫因子顯著高于AG型；楓涇豬中TAP1 基因的AA基因型個(gè)體TNF-a表達(dá)水平顯著高于GG和AG型，這與薛偉偉[15]對(duì)圩豬的研究結(jié)果一致。由于TNF-a不僅能夠調(diào)控促炎細(xì)胞因子，也能控制趨化因子和黏附因子的活化和表達(dá)[46]。因此，推測(cè)在正常值范圍內(nèi)，AA型豬的抗病能力與AG利GG型存在差異。在沙烏頭豬中，TAP1 基因GG型的IL-12水平顯著低于AG型，研究表明，IL-12水平過高會(huì)抑制Th2細(xì)胞的產(chǎn)生從而抑制IL-10的產(chǎn)生，且IL-10的表達(dá)與IL-12的表達(dá)早現(xiàn)負(fù)相關(guān)[47]。雖然沙烏頭豬的TAP1 基因GG型與AG型的IL-10 沒有顯著差異，但AG 型的IL-10 水平低于GG型。本研究總結(jié)了上海白豬，楓涇豬和沙烏頭豬部分抗腹瀉基因與部分免疫因子間的的關(guān)系，通過分析，對(duì)各豬種的抗腹瀉有了初步的認(rèn)識(shí)，可為后期試驗(yàn)提供一定的理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：胡立霞）

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2021YFD120303）；上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院助跑計(jì)劃人才項(xiàng)目（ZP22171）；重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展專項(xiàng)（CSTC2021JSCX-DXWTBX0004）；寧波科技創(chuàng)新2025重大專項(xiàng)（2019B10023）。