豐揚(yáng)　郭鳳根　王仕玉　劉正杰　龍?chǎng)┖?/p>

摘要：為了闡明藜麥CqGAI 基因密碼子使用特性，克隆獲得藜麥CqGAI 基因序列，運(yùn)用CodonW、SPSS軟件及EMBOSS在線程序分析藜麥CqGAI 基因密碼子使用偏好性，并與25種植物的GAI 基因進(jìn)行中性繪圖、ENC分析和奇偶偏好偏差性分析。結(jié)果表明，藜麥CqGAI 基因編碼序列（coding sequence，CDS）全長(zhǎng)1 782 bp，編碼593個(gè)氨基酸，包含DELLA基因家族特有結(jié)構(gòu)域DELLA、TVHYNP、NLS、VHIID、LHR、RVER；CqGAI基因能夠迅速響應(yīng)赤霉素（gibberellins，GA），在GA信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用；密碼子偏好性分析顯示，CqGAI 基因的有效密碼子數(shù)（effective number of codon，ENC）、密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaptation index， CAI）及GC含量分別為54.14、0.21和46.18%，密碼子偏好性較弱，偏好以A/T結(jié)尾，有27個(gè)高頻密碼子。聚類分析表明，藜麥CqGAI 基因與石竹目植物的親緣關(guān)系較近。堿基組成與相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CqGAI 基因密碼子偏好性受堿基突變和選擇效應(yīng)影響。密碼子使用頻率表明，大腸桿菌與酵母菌均適用于藜麥CqGAI 基因異源表達(dá)，擬南芥、煙草、甜菜均可作為藜麥CqGAI 基因功能分析的遺傳轉(zhuǎn)化受體。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步研究藜麥CqGAI 基因功能和異源表達(dá)提供了重要參考。

關(guān)鍵詞：藜麥；CqGAI 基因；密碼子偏好性；進(jìn)化分析

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0125

中圖分類號(hào)：S516 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2024）04002710

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈，其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，各種氨基酸比例均衡，富含膳食纖維、礦質(zhì)元素及維生素等，適合各類人群食用，因此被稱為“全營(yíng)養(yǎng)作物”[12]，但藜麥在生產(chǎn)上也遇到穗發(fā)芽等諸多阻礙。穗發(fā)芽是指作物在收獲前遇到連綿陰雨或在潮濕環(huán)境下種子在穗上發(fā)芽的現(xiàn)象[3]，在水稻、小麥、藜麥等作物中均有發(fā)生，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[4-6]。種子從休眠到萌發(fā)階段，其生理變化由多種植物內(nèi)源激素共同調(diào)控[7]。DELLA蛋白是多種植物內(nèi)源激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用因子，而DELLA蛋白的作用通過(guò)赤霉素（gibberellins，GA）信號(hào)調(diào)控[89]。

GAI 屬于DELLA 蛋白家族，其N 端具有DELLA和TVHYNP 2個(gè)GA3 信號(hào)感知結(jié)構(gòu)域，中部含有核定位信號(hào)（nuclear localization signal，NLS），C端的VHIID、SH2、SAW是阻遏結(jié)構(gòu)域[10]。DELLA 蛋白缺少DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因此DELLA蛋白常與其他調(diào)控蛋白互作，進(jìn)而調(diào)控植物的生理過(guò)程[11]。不同物種中DELLA 蛋白的數(shù)量及作用方式不同，同一物種中DELLA蛋白家族成員間功能既有冗余，又有互補(bǔ)[1213]。在種子萌發(fā)與休眠中，DELLA蛋白通過(guò)介導(dǎo)激素和光信號(hào)來(lái)調(diào)控種子的萌發(fā)，DELLA蛋白可直接與ABI3和ABI5互作，使下游SOM 基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而調(diào)控種子萌發(fā)[14]。光敏色素接收到光信號(hào)后，PIL5蛋白被降解，GAI和RGA的轉(zhuǎn)錄受到抑制，內(nèi)源GA3含量升高，促進(jìn)種子萌發(fā)[15]。目前，關(guān)于DELLA蛋白家族在植物內(nèi)源激素、逆境響應(yīng)等方面已有一些研究，但DELLA 蛋白的調(diào)控機(jī)理復(fù)雜，不同植物DELLA蛋白的數(shù)量與功能不同，還需進(jìn)一步研究。

密碼子是遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞中樞，在生物進(jìn)化過(guò)程中由于環(huán)境等因素形成密碼子偏好。密碼子偏好性是由于生物同義密碼子使用不均衡造成的，其存在物種及基因差異[1617]；導(dǎo)致基因在堿基組成和表達(dá)水平存在差異，因此密碼子偏好性分析對(duì)基因的進(jìn)化、功能預(yù)測(cè)、蛋白質(zhì)表達(dá)等具有重要參考價(jià)值[1819]。很多物種的遺傳轉(zhuǎn)化體系不成熟，需要借助異源表達(dá)分析基因的功能。在異源表達(dá)過(guò)程中，由于物種間存在密碼子使用偏好性，容易造成甲基化、表達(dá)水平低等，因此需要根據(jù)目標(biāo)基因密碼子使用特性及受體密碼子使用特性選擇合適的受體系統(tǒng)或?qū)δ繕?biāo)基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化或改造[20]。近年關(guān)于密碼子的使用偏好性在多個(gè)植物中已有報(bào)道，但未見(jiàn)藜麥GAI 基因密碼子偏好性的相關(guān)研究。因此，本研究克隆藜麥GAI 基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，初探其在GA3處理下種子萌發(fā)中的功能，并對(duì)其密碼子偏好性進(jìn)行分析，旨在為深入研究藜麥GAI 基因在種子萌發(fā)中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試藜麥為本課題組前期經(jīng)穗發(fā)芽抗性評(píng)價(jià)獲得的不同穗發(fā)芽抗性的藜麥種質(zhì)資源SBQ1、WQ8、BBQ3，抗性表現(xiàn)為SBQ1>WQ8>BBQ3。以其萌發(fā)的種子及幼苗作為試驗(yàn)材料，干種子置于4 ℃保存[21]。

1.2 藜麥CqGAI 基因cDNA 的全長(zhǎng)克隆

取3 葉期SBQ1、WQ8、BBQ3 藜麥的幼嫩葉片，液氮研磨，使用TransZol（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）提取總RNA。按照TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）合成cDNA，產(chǎn)物于?20 ℃冰箱保存。根據(jù)GeneBank公布的藜麥CqGAI-like（LOC110694429）全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異引物CqGAI-F 和CqGAI-R（表1）。以幼苗葉片cDNA 為模板，用Phanta Flash MasterMix聚合酶（南京諾唯贊生物科技有限公司）擴(kuò)增CqGAI 基因全長(zhǎng)。PCR體系為： Phanta Flash MasterMix聚合酶25 μL、模板1 μL、上下游引物各2 μL，加ddH2O至總體積50 μL。PCR程序：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，58 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃1 min。1.0% 瓊脂糖凝膠電泳切膠回收連接pEASY克隆載體（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司），轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)，挑取陽(yáng)性單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3 藜麥CqGAI 基因的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy ProtParam分析CqGAI 基因編碼蛋白的理化性質(zhì)；使用TMHMM 和Protscale 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域和親疏水性；通過(guò)PSORT 和SignalP-5.0進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位及信號(hào)肽分析；使用SOPMA與SWISS-MODEL預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)；通過(guò)NCBI-Conserved Domains 預(yù)測(cè)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域[22]。

1.4 藜麥CqGAI 基因在種子萌發(fā)中的表達(dá)分析

分別將藜麥種子置于含蒸餾水（對(duì)照）和10、25、50 mg·L-1赤霉素（GA3）處理的濾紙上萌發(fā)6、12、24、36 h，分別提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)克隆獲得的藜麥CqGAI 基因序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物CqGAI-qF和CqGAI-qR（表1），以Actin 基因作為內(nèi)參基因，使用qRT-PCR技術(shù)分析不同處理的藜麥種子萌發(fā)24 h 時(shí)CqGAI 基因的相對(duì)表達(dá)量和25 mg·L-1 GA3處理下不同藜麥種子萌發(fā)過(guò)程中的CqGAI 基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 GAI 基因的密碼子偏好性分析

甜菜（Beta vulgaris）、菠菜（Spinacia oleracea）、莧菜（Amaranthus tricolor） 、番茄（Solanumlycopersicum）等24種植物的GAI 基因序列來(lái)源于GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ genebank/）。擬南芥（Arabidopsis thaliana）、煙草（Nicotianatabacum）、甜菜、水稻（Oryza sativa）、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）和大腸桿菌（Escherichiacoli）等模式生物的基因組密碼子偏好性數(shù)據(jù)來(lái)源于密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)Codon Usage Database （http：//www.kazusa.or.jp/codon/）。使用Codon W 軟件和CHIPS 網(wǎng)站（https：//www.bioinformatics.nl/embossexplorer/）分析25種植物GAI 基因的有效密碼子數(shù)（effective number of codon，ENC）、密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaptation index， CAI）、最優(yōu)密碼子使用頻率（frequency of optiomal codons， FOC）、同義密碼子相對(duì)使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）、密碼子第1、2和3位上的G/C含量（GC1、GC2和GC3）和密碼子第3位上各堿基含量（A3s、T3s、G3s 和C3s）等密碼子偏好性參數(shù)；采用EMBOSS分析密碼子使用頻率。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 27.0 和Excel 2019 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并對(duì)密碼子參數(shù)相關(guān)性、ENC繪圖和奇偶偏性分析（parity rule 2，PR2）進(jìn)行運(yùn)算分析。同時(shí)，基于不同物種中GAI 基因的同義密碼子相對(duì)使用度（RSCU）進(jìn)行密碼子使用偏性聚類分析，用歐氏平方距離表示基因間的進(jìn)化距離，采用鄰近法利用MEGA Ⅺ構(gòu)建25個(gè)物種GAI 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥CqGAI 基因cDNA 全長(zhǎng)克隆

在預(yù)測(cè)序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，獲得約1 782 bp大小的PCR產(chǎn)物（圖1）。連接pEASY克隆載體，轉(zhuǎn)化DH5ɑ，陽(yáng)性單菌落經(jīng)M13通用引物測(cè)序表明，與GeneBank中預(yù)測(cè)的藜麥GAI 基因CDS區(qū)域相似度達(dá)99%，但在C 端缺失75 bp。在SBQ1、WQ8 和BBQ3 中擴(kuò)增獲得的序列均與GAI 基因一致，因此命名為CqGAI，登錄號(hào)OQ067480。

2.2 藜麥CqGAI 基因生物信息學(xué)分析

CqGAI 基因編碼593 個(gè)氨基酸，蛋白分子量64.65 kD，分子式C2 828H4 438N776O905S27，等電點(diǎn)4.93；含有49個(gè)堿性氨基酸（Arg+Lys），72個(gè)酸性氨基酸（Asp+Glu），平均疏水系數(shù)?0.272，脂溶指數(shù)79.12，不穩(wěn)定指數(shù)48.95，屬于酸性親水的不穩(wěn)定蛋白。對(duì)CqGAI蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其二級(jí)結(jié)構(gòu)由43.68% 的α-螺旋、9.78% 的延伸鏈、3.71%的β-轉(zhuǎn)角、42.83%的無(wú)規(guī)則卷曲組成；其三級(jí)結(jié)構(gòu)與DELLA亞基因家族中的GAI蛋白相似度達(dá)67.33%，且含有GA3的識(shí)別位點(diǎn)。信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示，CqGAI蛋白無(wú)信號(hào)肽，不具有跨膜區(qū)，亞細(xì)胞定位主要存在于細(xì)胞核。對(duì)CqGAI蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域及與近緣種蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，CqGAI蛋白含有DELLA亞基因家族特有的結(jié)構(gòu)域，其中N 端有DELLA、TVHYNP酸性結(jié)構(gòu)域；中部有核定位信號(hào)；C端有VHIID、LHR、RVER等保守結(jié)構(gòu)域。

2.3 藜麥CqGAI 基因?qū)A3的表達(dá)響應(yīng)

利用qRT-PCR分析CqGAI 基因在GA3處理下不同穗發(fā)芽抗性藜麥種子萌發(fā)過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果（圖3）表明，在10、25、50 mg·L-1 GA3處理下種子發(fā)芽24 h時(shí)，CqGAI 基因在SBQ1、BBQ3中的表達(dá)量與對(duì)照均無(wú)顯著差異，而WQ8在10和25 mg·L-1 GA3處理下CqGAI 基因的表達(dá)量較對(duì)照分別顯著上調(diào)和下調(diào)。在25 mg·L-1 GA3處理下，隨著種子的萌發(fā)，CqGAI 基因表達(dá)量在SBQ1、WQ8和BBQ3中均下調(diào)，說(shuō)明CqGAI 基因能夠響應(yīng)GA3。在種子萌發(fā)24 h時(shí)，CqGAI 基因表達(dá)量在SBQ1、WQ8和BBQ3中均趨于平穩(wěn)，說(shuō)明在GA3處理下，CqGAI 基因能夠迅速響應(yīng)GA3，進(jìn)而行使其生物學(xué)功能，促進(jìn)種子萌發(fā)。

2.4 藜麥CqGAI 基因密碼子偏好性分析

2.4.1 藜麥CqGAI 基因密碼子相關(guān)分析

有效密碼子數(shù)（ENC）是指基因的密碼子使用頻率與同義密碼子平均使用頻率偏差的量化值，其數(shù)值一般在20～61之間，越接近61表示同義密碼子偏倚越小，基因表達(dá)量越低。高表達(dá)基因密碼子偏好程度越大，密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）值越大，ENC值越?。坏捅磉_(dá)基因包含的稀有密碼子類型較多，因此偏好度低，CAI 值較小，ENC 值較高。運(yùn)用CodonW 軟件和EMBOSS 在線網(wǎng)站獲得了藜麥CqGAI 基因密碼子使用偏性相關(guān)參數(shù)，如表2 所示。CqGAI 基因的ENC為54.14，CAI為0.21，表明藜麥CqGAI 基因的密碼子偏好性較弱，屬于低表達(dá)基因，其密碼子中GC、GC1、GC2、GC3含量分別為46.18%、52.02%、42.76%、43.77%，說(shuō)明CqGAI基因密碼子偏好以A/T結(jié)尾。

相對(duì)同義密碼子使用度（RSCU）能夠體現(xiàn)某一密碼子偏性的強(qiáng)弱，RSCU=1表示密碼子不存在偏好；RSCU>1表示該密碼子較其他同義密碼子出現(xiàn)的頻率更高；RSCU<1表明該基因使用此密碼子的頻率較低。藜麥CqGAI 基因的RSCU值如圖4所示，高頻密碼子有27個(gè)，其中以A/T結(jié)尾的有18個(gè)，以G/C結(jié)尾的有9個(gè)，說(shuō)明藜麥CqGAI基因密碼子偏好以A/T結(jié)尾，與GC含量分析結(jié)果一致。密碼子AGG、GUU、GCU 的RSCU>2，具有較強(qiáng)的使用偏好性；其余31個(gè)密碼子的RSCU<1，說(shuō)明其在使用時(shí)被選擇的頻率較低。

2.4.2 不同物種GAI 基因的聚類分析

通過(guò)鄰近法對(duì)25種植物的GAI基因的CDS序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖5A），將單子葉植物和雙子葉植物分為2大類。在雙子葉植物中，同為石竹目的藜麥、菠菜、莧菜、甜菜聚為一小類，這4種植物GAI 基因的GC含量和ENC值較相近，其中藜麥與菠菜的GC含量和ENC值差異更小，因此菠菜與藜麥親緣關(guān)系最近；在薔薇科植物中，沙梨、蘋果、李、雜交玫瑰聚為一小類，而櫻桃、水蜜桃、梅花聚為另一小類，這7種植物中沙梨、蘋果、李、雜交玫瑰GAI 基因的GC含量和ENC值差異較小，櫻桃、水蜜桃、梅花間差異較小。由此表明，密碼子使用偏好性越近，其物種在進(jìn)化上的親緣關(guān)系越近。

基于GAI 基因的RSCU值進(jìn)行聚類分析，結(jié)果（圖5B）表明，將25種植物也分為2大類，但與基于CDS序列的進(jìn)化樹(shù)存在差異。石竹目植物與橡膠樹(shù)、馬鈴薯聚為一小類；4個(gè)單子葉植物依然聚為一小類；7個(gè)薔薇科植物間的距離較近。因此，在基于RSCU值的聚類分析中，密碼子使用頻率相近的物種親緣關(guān)系可能較近，也可能較遠(yuǎn)。對(duì)比2種聚類結(jié)果，基于CDS序列的聚類分析更接近傳統(tǒng)的物種進(jìn)化關(guān)系；基于RSCU值的聚類結(jié)果僅能體現(xiàn)密碼子使用偏好的豐富性，而密碼子使用偏好性與物種親緣關(guān)系并沒(méi)有直接的相關(guān)性。

2.4.3 不同物種GAI 基因中性分析

對(duì)25個(gè)物種GAI 基因的GC含量和ENC相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果（表3）表明，GC、GC1、GC2、GC3間均呈極顯著正相關(guān)；而GC含量和ENC呈極顯著負(fù)相關(guān)。對(duì)不同物種GAI 基因進(jìn)行中性分析，結(jié)果（圖6）表明，GC3為0.281 8～0.905 4，GC12為0.466 5～0.606 3，GC12的變幅較小，大部分GAI 基因分布于回歸線的兩側(cè)，線性回歸系數(shù)為0.180 7；GC3與GC12呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（r）為0.886，與相關(guān)性分析結(jié)果一致。由此表明，GAI 基因的堿基組成差異較小，主要受突變壓力影響。

2.4.4 不同物種GAI 基因的ENC 和PR2 分析

ENC 分析可檢測(cè)堿基組成對(duì)密碼子偏好性的影響，若基因沿標(biāo)準(zhǔn)曲線分布或在標(biāo)準(zhǔn)曲線附近，表示該基因密碼子偏好性受突變壓力的影響；若基因在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方較遠(yuǎn)的位置則表示該基因密碼子偏好性受選擇壓力的影響。由圖7可知，25種植物GAI 基因的ENC分布趨勢(shì)與標(biāo)準(zhǔn)曲線一致，其中莧菜、牡丹、橡膠樹(shù)、毛白楊分布于標(biāo)準(zhǔn)曲線上方；擬南芥、番茄、水稻分布于標(biāo)準(zhǔn)曲線下方；其余物種分布于標(biāo)準(zhǔn)曲線附近。由此說(shuō)明，突變是影響GAI 基因偏好性的主要因素，但選擇壓力也產(chǎn)生了一定的影響。

奇偶偏性分析（PR2）中若基因均勻地分布在坐標(biāo)軸中心，說(shuō)明4種堿基的使用頻率一致，其密碼子偏好性主要受堿基突變影響；若偏離中心位置，說(shuō)明受其他因素影響。由圖8可知，GAI 基因的G3/（G3+C3）和A3/（A3+T3）值未在0.5 左右。其中，大多數(shù)GAI 基因的G3/（G3+C3）值小于0.5，表明GAI基因密碼子選用G與C時(shí)，偏向于堿基C結(jié)尾；大多數(shù)GAI 基因的A3/（A3+T3）值均勻分布于0.5區(qū)域的上、下側(cè)，表明GAI 基因密碼子選用A與T時(shí)沒(méi)有明顯的偏好性。由此推斷，突變不是影響GAI 基因密碼子使用偏好性的唯一原因，選擇壓力等其他因素也在其進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮了一定作用。

2.4.5 藜麥CqGAI 基因受體系統(tǒng)的選擇

藜麥遺傳轉(zhuǎn)化體系尚未完善，其基因的功能分析需要借助具有完善遺傳轉(zhuǎn)化體系的物種進(jìn)行異源表達(dá)。通常認(rèn)為，物種間密碼子使用頻率在0.5～2.0 之間，說(shuō)明種間在使用該密碼子時(shí)偏好性較??；使用頻率≤0.5或≥2.0，說(shuō)明種間在使用該密碼子時(shí)偏好性較大。將藜麥CqGAI 基因密碼子使用頻率與擬南芥、煙草、甜菜、水稻、酵母菌和大腸桿菌的基因組密碼子使用頻率進(jìn)行比較，結(jié)果（表4）表明，藜麥CqGAI 基因與擬南芥、煙草、甜菜、水稻在使用頻率上差異較大的密碼子個(gè)數(shù)分別為9、9、10、19，說(shuō)明擬南芥、煙草和甜菜可作為藜麥CqGAI 基因遺傳轉(zhuǎn)化的受體；藜麥CqGAI 基因與酵母菌、大腸桿菌在使用頻率上差異較大的密碼子個(gè)數(shù)均為13，說(shuō)明酵母菌、大腸桿菌都可用于藜麥CqGAI 基因的異源表達(dá)。

3 討論

DELLA蛋白參與多種植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，如種子萌發(fā)、莖伸長(zhǎng)、開(kāi)花時(shí)間等[2324]。它作為GA信號(hào)的抑制因子，經(jīng)泛素化降解后激活GA 信號(hào)通路[2526]。藜麥穗發(fā)芽現(xiàn)象嚴(yán)重影響其品質(zhì)與產(chǎn)量，GA3作為種子萌發(fā)與休眠的主要植物激素，其生物活性與DELLA蛋白有直接關(guān)系[3，25]。GA3是受體GID1與DELLA相互作用的關(guān)鍵，GA-GID1-DELLA復(fù)合物形成后，SCF E3 泛素連接酶SLEEPY1（SLY1）特異性識(shí)別DELLA蛋白，并通過(guò)26S蛋白酶體途徑泛素化降解DELLA，進(jìn)而發(fā)揮其生物活性[2728]。藜麥種子的休眠是初級(jí)休眠和生理休眠的組合，或沒(méi)有初級(jí)休眠[29]。因此，對(duì)DELLA家族基因的研究有利于深入了解藜麥種子的休眠與萌發(fā)機(jī)制。

本研究克隆了藜麥DELLA家族基因CqGAI，編碼區(qū)全長(zhǎng)1 782 bp，編碼593個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，其含有DELLA基因家族特有結(jié)構(gòu)域DELLA、TVHYNP、NLS、VHIID、LHR、RVER等，但C端無(wú)阻遏基序SAW。水稻SLR1的SAW基序突變導(dǎo)致GID1與DELLA蛋白的結(jié)合能力降低[30]，對(duì)于CqGAI 基因SAW基序缺失是否會(huì)影響藜麥中GID1-DELLA蛋白相互作用還有待進(jìn)一步研究。為探究CqGAI 基因在種子萌發(fā)中的作用，分析了CqGAI 基因在GA3處理下不同穗發(fā)芽抗性藜麥種子萌發(fā)過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)量，表明CqGAI基因能夠響應(yīng)GA3，表達(dá)量迅速降低，GA3促進(jìn)種子萌發(fā)；但在不同水平GA3處理下，CqGAI 基因在不同穗發(fā)芽抗性藜麥中并沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的表達(dá)差異，推測(cè)藜麥種子的穗發(fā)芽抗性可能與種子自身內(nèi)源激素含量、種皮厚度等因素有關(guān)。

密碼子使用偏好性是生物進(jìn)化過(guò)程中適應(yīng)性選擇的結(jié)果，廣泛存在于自然界中。分析CqGAI基因密碼子偏好性，探索其在進(jìn)化過(guò)程中的規(guī)律及合適的異源轉(zhuǎn)化受體，可為深入研究藜麥CqGAI 基因的功能奠定基礎(chǔ)。根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性，可將特定密碼子進(jìn)行同義突變，以提高目的基因的異源表達(dá)效率[31]。石竹目植物GAI 基因的ENC值均大于50，說(shuō)明石竹目植物的密碼子使用偏好性較弱，在密碼子的選擇上具有較高的隨機(jī)性。對(duì)藜麥CqGAI 基因密碼子進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其密碼子偏好使用A/T并使用A/T結(jié)尾，這符合雙子葉植物的密碼子使用特性[32]。在聚類分析中，親緣關(guān)系較近的物種其密碼子使用偏好性較一致，但二者之間并不存在相關(guān)性；基于CDS序列與基于RSCU 的聚類分析結(jié)果存在一定差異，基于CDS序列的聚類結(jié)果更接近系統(tǒng)分類中的物種親緣關(guān)系，而基于RSCU的聚類結(jié)果僅反映出GAI 基因的進(jìn)化規(guī)律，將2種聚類結(jié)果相結(jié)合可在一定程度上反映出物種的進(jìn)化規(guī)律[3334]。

密碼子使用偏好性主要受突變壓力和自然選擇的影響，對(duì)GAI 基因進(jìn)行中性繪圖、ENC分析和PR2分析發(fā)現(xiàn)，GAI 基因在密碼子偏好性選擇上，除受堿基突變影響外，選擇效應(yīng)等其他因素也有一定影響。在異源表達(dá)中，物種間密碼子使用頻率的比值差異越小越有利于目的基因的表達(dá)[35]。本研究結(jié)果表明，大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)與酵母真核表達(dá)系統(tǒng)均適用于藜麥CqGAI 基因的異源表達(dá)，同時(shí)擬南芥、煙草、甜菜也可作為藜麥CqGAI基因功能分析的異源受體，但試驗(yàn)中仍需對(duì)部分密碼子進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)也要考慮轉(zhuǎn)化效率、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及mRNA 結(jié)構(gòu)等諸多因素，對(duì)于藜麥CqGAI基因的異源高效轉(zhuǎn)化表達(dá)仍需深入研究。

參考文獻(xiàn)

［1］ TANG Y， LI X H， CHEN P X， et al .. Characterisation of fattyacid， carotenoid， tocopherol/tocotrienol compositions andantioxidant activities in seeds of three Chenopodium quinoaWilld. genotypes [J]. Food Chem.， 2015， 174（5）：502-508.

［2］ TANG Y， LI X H， ZHANG B， et al .. Characterisation ofphenolics， betanins and antioxidant activities in seeds of threeChenopodium quinoa Willd. genotypes [J]. Food Chem.， 2015，166（1）：380-388.

［3］ MCGINTY E M， MURPHY K M， HAUVERMALE A L. Seeddormancy and preharvest sprouting in quinoa [J/OL]. Plants，2021， 10（3）：458 [2023-01-10]. https：//doi.org/10.3390/plants10030458.

［4］ CECCATO D V， BERTERO H D， BATLLA D. Environmentalcontrol of dormancy in quinoa （Chenopodium quinoa） seeds：two potential genetic resources for pre-harvest sproutingtolerance [J]. Seed Sci. Res.， 2011， 21（2）：133-141.

［5］ VETCH J M， STOUGAARD R N， MARTIN J M， et al ..Revealing the genetic mechanisms of pre-harvest sprouting inhexaploid wheat （Triticum aestivum L.） [J]. Plant Sci.， 2019，281：180-185.

［6］ NONOGAKI H， BARRERO J M， LI C D. Seed dormancy，germination， and pre-harvest sprouting [J/OL]. Front Plant Sci.，2018， 9：1783 [2023-01-10]. https：//doi.org/10.3389/978-2-88945-762-5.

［7］ 徐恒恒，黎妮，劉樹(shù)君，等.種子萌發(fā)及其調(diào)控的研究進(jìn)展[J].作物學(xué)報(bào)，2014，40（7）：1141-1156.

XU H H， LI N， LIU S J， et al .. Research progress in seedgermination and its control [J]. Acta Agron. Sin.， 2014， 40（7）：1141-1156.

［8］ PHOKAS A， COATES J C. Evolution of DELLA function andsignaling in land plants [J]. Evol. Dev.， 2021， 23（3）：137-154.

［9］ VELDE K V， RUELENS P， GEUTEN K， et al .. ExploitingDELLA signaling in cereals [J]. Trends Plant Sci.， 2017，22（10）：880-893.

［10］ SERRANO M A， BENCIVENGA S， BUSH M， et al .. DELLAgenes restrict inflorescence meristem function independentlyof plant height [J]. Nat. Plants， 2017， 3（9）：749-754.

［11］ DAVIERE J， ACHARD P. A pivotal role of DELLAs inregulating multiple hormone signals [J]. Mol. Plant， 2016， 9（1）：10-20.

［12］ KELLER J， DELCROS P， LIBOUREL C， et al .. DELLA familyduplication events lead to different selective constraints inangiosperms [J]. Genetica， 2020， 148（5-6）：243-251.

［13］ BLANCO T N， SERRANO M A， ALABADI D. Regulation ofDELLA proteins by post-translational modifications [J]. PlantCell Physiol.， 2020， 61（11）：1891-1901.

［14］ PAN J J， HU Y R， WANG H P， et al .. Molecular mechanismunderlying the synergetic effect of jasmonate on abscisic acidsignaling during seed germination in Arabidopsis [J]. PlantCell， 2020， 32（12）：3846-3865.

［15］ LI K L， YU R B， FAN L M， et al .. DELLA-mediated PIFdegradation contributes to coordination of light and gibberellinsignalling in Arabidopsis [J/OL]. Nat. Commun.， 2016， 7：11868[2023-01-10]. https：//doi.org/10.1038/ncomms11868.

［16］ 張以忠，曾文藝，鄧琳瓊，等.甘藍(lán)S-位點(diǎn)基因SRK、SLG 和SP11/SCR 密碼子偏好性分析[J].作物學(xué)報(bào)，2022，48（5）：1152-1168.

ZHANG Y Z， ZENG W Y， DENG L Q， et al .. Codon usage biasanalysis of S-locus genes SRK， SLG， and SP11/SCR in Brassicaoleracea [J]. Acta Agron. Sin.， 2022， 48（5）：1152-1168.

［17］ 任桂萍，董瓔瑩，黨云琨.密碼子中的密碼：密碼子偏好性與基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控[J].中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)，2019，49（7）：839-847.

REN G P， DONG Y Y， DANG Y K. Codon in codon：preference and fine regulation of gene expression [J]. Sci. Sin.Vitae， 2019， 49（7）：839-847.

［18］ WEI L， HE J， JIA X， et al .. Analysis of codon usage bias ofmitochondrial genome in Bombyx mori and its relation toevolution [J]. BMC Evol. Biol.， 2014， 14（1）：1-12.

［19］ PEK H B， KLEMENT M， ANG K S， et al .. Exploring codoncontext bias for synthetic gene design of a thermostableinvertase in Escherichia coli [J]. Enzyme Microb. Technol.，2015， 75-76：57-63.

［20］ GUN L， YUMIAO R， HAIXIAN P， et al .. Comprehensiveanalysis and comparison on the codon usage pattern of wholemycobacterium tuberculosis coding genome from different area[J/OL]. Biomed. Res. Int.， 2018， 2018：3574976 [2023-01-10].https：//doi.org/10.1155/2018/3574976.

［21］ 毛琪，晏興珠，王仕玉，等.30 份藜麥資源的穗發(fā)芽抗性評(píng)價(jià)[J].種子，2021，40（10）：62-66.

MAO Q， YAN X Z， WANG S Y， et al .. Evaluation of paniclegermination resistance of 30 quinoa resources [J]. Seed， 2021，40（10）： 62-66.

［22］ 豐揚(yáng)，郭鳳根，王仕玉，等.藜麥Cq6GT 基因的克隆與表達(dá)分析[J].植物生理學(xué)報(bào)，2022，58（10）：2017-2024.

FENG Y， GUO F G， WANG S Y， et al .. Cloning and expressionanalysis of Cq6GT gene from Chenopodium quinoa [J]. PlantPhysiol. J.， 2022， （58）10：2017-2024.

［23］ XU H， LANTZOUNI O， BRUGGINK T， et al .. A molecularsignal integration network underpinning Arabidopsis seedgermination [J]. Curr. Biol.， 2020， 30（19）：3703-3712.

［24］ CHAHTANE H， NOGUEIRA F T， ALLARD P M， et al .. Theplant pathogen pseudomonas aeruginosa triggers a DELLAdependentseed germination arrest in Arabidopsis [J/OL]. Elife，2018， 7：e37082 [2023-01-10]. https：//doi.org/10.7554/eLife.37082.

［25］ WANG Y J， DENG D X. Molecular basis and evolutionarypattern of GA-GID1-DELLA regulatory module [J]. Mol. Genet.Genomics， 2014， 289（1）：1-9.

［26］ PONNU J. Repressing a repressor： E3 ligase COP1/SPApromotes seed germination by targeting the DELLA proteinRGL2 [J]. Plant Physiol.， 2022， 189（3）：1192-1193.

［27］ SUN T P. The molecular mechanism and evolution of the GAGID1-DELLA signaling module in plants [J]. Curr. Biol.， 2011，21（9）：338-345.

［28］ 宋松泉，劉軍，黃薈，等.赤霉素代謝與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)控種子萌發(fā)與休眠的分子機(jī)制[J]. 中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)，2020，50（6）：599-615.

SONG S Q， LIU J， HUANG H， et al .. Gibberellin metabolismand signaling and its molecular mechanism in regulating seedgermination and dormancy [J]. Sci. Sin. Vitae， 2020， 50（6）：599-615.

［29］ BASKIN J M， BASKIN C C. A classification system for seeddormancy [J]. Seed Sci. Res.， 2007， 14（1）：1-16.

［30］ HIRANO K， ASANO K， TSUJI H， et al .. Characterization of themolecular mechanism underlying gibberellin perception complexformation in rice [J]. Plant Cell， 2010， 22（8）：2680-2696.

［31］ WANG L Y， XING H X， YUAN Y C， et al .. Genome-wideanalysis of codon usage bias in four sequenced cotton species[J/OL]. PLoS One， 2018， 13（3）：e0194372 [2023-01-10]. https：//doi.org/10.1371/journal.pone.0194372.

［32］ MURRAY E E， LOTZER J， EBERLE M. Codon usage in plantgenes [J]. Nucl. Acids Res.， 1989， 17（2）：477-498.

［33］ 宋蕓，賈孟君，陳亮，等.忍冬ICE1 基因密碼子偏好性分析及受體系統(tǒng)選擇[J].植物生理學(xué)報(bào)，2020，56（11）：2459-2468.

SONG Y， JIA M J， CHEN L， et al .. Codon bias analysis andreceptor system selection of ICE1 gene in Lonicera japonicaThunb [J]. Plant Physiol. J.， 2020， 56（11）：2459-2468.

［34］ 趙春麗，彭麗云，王曉，等.莧菜AtGAI 基因密碼子偏好性與進(jìn)化分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，24（12）：10-22.

ZHAO C L， PENG L Y， WANG X， et al .. Codon bias andevolution analysis of AtGAI in Amaranthus tricolor [J]. J. Chin.Agric. Univ.， 2019， 24（12）：10-22.

［35］ 李翔，范作義，王井源，等.紅松查爾酮合成酶基因CHS 密碼子偏好性分析[J].植物研究，2020，40（3）：447-457.

LI X， FAN Z Y， WANG J Y， et al .. Codon usage bias ofchalcone synthase gene CHS in Pinus koraiensis [J]. Bull. Bot.Res.， 2020， 40（3）：447-457.

（責(zé)任編輯：張冬玲）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31960417）；云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2023Y1019）。