劉東玲　司皓　鄭寶江　張玉紅

摘要：為從菥蓂種子中高效提取高得率的目的活性成分黑芥子苷，采用酶解輔助-超聲提取法，并利用高效液相色譜測定其含量。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酶添加量、酶解溫度和酶解時間為關(guān)鍵因素，以黑芥子苷得率為響應值，應用DesignExpertV11軟件，BoxBehnkenDesign響應面法優(yōu)化菥蓂種子中黑芥子苷酶解輔助-超聲提取工藝；并與單獨超聲、索氏提取2種提取法的黑芥子苷得率進行比較。結(jié)果表明，采用Agilent HCC18柱（25 mm×4.6 mm×5 μm），流動相A和B分別為甲醇和0.5%磷酸水溶液，檢測波長215 nm，柱溫25 ℃，流速1 mL·min-1，進樣量10 μL，在等度洗脫10 min下，獲得的分離效果和峰型較好。以篩選出的堿性蛋白酶為酶制劑，最佳提取工藝條件為：酶解溫度49 ℃，酶用量2.90%，酶解時間18 min；在此條件下，菥蓂種子中黑芥子苷得率為2.679 mg·g-1，經(jīng)方差分析與理論值（2.687 mg·g-1）差異不顯著，但顯著高于單獨超聲提取（2.036mg·g-1）和索氏提?。?.702 mg·g-1）（P<0.05）。優(yōu)化得到的菥蓂中黑芥子苷酶解輔助-超聲提取工藝，方法簡單、節(jié)能、環(huán)保、高效，目的活性成分得率高，可應用于菥蓂中黑芥子苷的生產(chǎn)實踐，為菥蓂的深度開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：菥蓂；黑芥子苷；酶解輔助-超聲提?。豁憫娣?/p>

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0964

中圖分類號：S377；R284 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2024）04022509

菥蓂（Thlaspi arvense L.）是1 年生十字花科（Cruciferae）菥蓂屬（Thlaspi）草本植物，別名敗醬草、遏藍菜、犁頭草等[1]，廣泛分布于全國各地，集中生長在溝邊、山地路邊和村落周邊。除我國外，在歐洲、美洲、非洲北部也有分布[2]。研究表明，菥蓂全草富含黃酮類化合物、芥子油苷類、芥子酶、揮發(fā)油、有機酸、糖類、吲哚、微量元素等化學成分[3]；味辛，微寒，具有清肝明目、和中利濕、解毒消腫等功效，被歷版中國藥典所收錄[4]。菥蓂種子中含有較高的脂肪油，且含有黑芥子苷[5]。至今，發(fā)現(xiàn)的芥子油苷有120多種，而黑芥子苷是此類物質(zhì)中具有代表性的芥子油苷類化合物[6]。黑芥子苷是一種硫代葡萄糖苷，具有抗脂肪生成作用，能通利內(nèi)臟、發(fā)汗散寒、溫和開胃、增進食欲、化痰利氣、促進消化、抗炎、有效抗氧化活性[78]、抑制腫瘤細胞的增殖[910]等作用，對高甘油三酯血癥也有抑制作用，且影響脂肪細胞的分化[11]。黑芥子苷通過抑制蛋白酶表現(xiàn)出直接抗SARSCOV2活性，被認為是可能抗冠狀病毒（COVID19）的潛在候選物質(zhì)[12]。

目前，黑芥子苷的常用提取方法為傳統(tǒng)的超聲波輔助提取法（ultrasound-assisted extraction，UAE）[1314]。超聲波輔助提取法是在超聲波作用下使有效成分等進入溶劑中，得到含有多種成分的提取液后，再對提取液分離、精制、純化，進而得到目標化合物[15]。該方法具有提取效率高、提取時間短等優(yōu)點，但在實驗室仍為小規(guī)模使用，由于設備問題無法應用于大規(guī)模生產(chǎn)。酶解法（enzymatichydrolysis，EH）是新興的一種植物成分提取方法，通過破壞植物細胞壁和脂多糖、脂蛋白等，從而更完全徹底地獲得植物中的有效成分[16]。該方法操作便捷、提取率高、工藝條件溫和、符合綠色可持續(xù)發(fā)展要求，且避免了對目的化合物的破壞，近年來得到了更多研究者的關(guān)注。盡管酶解法能促使細胞壁降解，增大細胞膜透性，促使目標成分有效滲出，但只利用酶解法目標化合物的得率依然低于常規(guī)提取技術(shù)[17]。將超聲波提取法和酶解法結(jié)合起來，首先利用酶破壞植物細胞壁結(jié)構(gòu)，再利用超聲波在物料中迅速聚集和分散，使液體產(chǎn)生空化效果，提高滲透性，從而提高目目標化合物的得率[18]。目前，尚未有利用酶解法提取黑芥子苷的研究報道。因此，本研究以菥蓂種子為原料，將超聲輔助提取法和酶解法結(jié)合用于提取菥蓂子中的黑芥子苷，探究酶解作用結(jié)合超聲對黑芥子苷提取得率的影響，并運用響應面設計優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，同時采用高效液相色譜法（highperformance liquid chromatography，HPLC）測定菥蓂種子中的黑芥子苷含量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用采后自然干燥的菥蓂種子，使用前在60 ℃烘箱中烘干24 h，粉碎，過40目篩后置于封口袋中保存?zhèn)溆?。黑芥子苷標準品購于上海源葉生物科技有限公司，色譜甲醇購于Sigma公司，色譜磷酸、果膠酶（分解細胞壁和細胞間層中的果膠物質(zhì)）、纖維素酶（分解細胞中纖維素、半纖維素成分）、堿性蛋白酶（水解細胞中的絲氨酸型、肽鍵等堿性環(huán)境下的蛋白）、酸性蛋白酶（水解細胞酸性環(huán)境下的蛋白）和中性蛋白酶（催化中性或弱酸、弱堿性環(huán)境中蛋白質(zhì)肽鍵水解）購于上海麥克林生化科技有限公司。

試驗設備主要包括數(shù)顯恒溫水浴鍋（SYG-2，常州朗越）、電子天平（BSA224S-CW，賽多利斯）、高功率數(shù)控超聲波清洗機（KQ-400KDE，昆山超聲）、高效液相色譜儀（1260型，美國安捷倫）、恒溫箱（HN36-BS，力辰科技）等。

1.2 黑芥子苷的HPLC 的測定

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Agilent HC-C18柱（25 mm×4.6 mm×5 μm）。黑芥子苷的色譜檢測條件：流動相A和B分別為甲醇和0.5%磷酸水溶液，檢測波長215 nm，柱溫25 ℃，流速1 mL·min-1，進樣量10 μL，等度梯度洗脫10 min。

1.2.2 標準曲線的繪制

精密稱取對照品適量，用超純水配制黑芥子苷標準品貯備溶液2 mg·mL-1，將黑芥子苷標準品貯備溶液分別稀釋為1.00、0.50、0.25、0.12、0.05 mg·mL-1，然后分別進行HPLC檢測，每次進樣10 μL。以峰面積為縱坐標（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標（x）進行線性回歸，得到黑芥子苷的線性回歸方程（式1）（R2=0.999 6），線性范圍為0.05～1.00 mg·mL-1。標準品和樣品色譜圖如圖1所示。

y = 8 751.1x + 275.62 （1）

1.3 不同酶制劑的篩選

稱取同一批菥蓂種子粉6份，各1.00 g，采用料液比1∶15（g·mL-1），酶添加量30 mg·g-1（對照加蒸餾水），酶反應時間20 min。不同酶控制條件如下，果膠酶：pH=3，反應溫度為50 ℃；纖維素酶：pH=5，反應溫度為50 ℃；中性蛋白酶：pH=7，反應溫度為45 ℃；堿性蛋白酶： pH=10，反應溫度為50 ℃；酸性蛋白酶：pH=3，反應溫度為45 ℃。反應結(jié)束后立即用80 ℃水浴滅活3～5 min；然后超聲提取（超聲功率320 W、超聲時間25 min、超聲溫度30 ℃）；將超聲后的提取液過濾后吸取5 mL到容量瓶中用超純水定容至10 mL，用HPLC進行黑芥子苷得率檢測。所有試驗均3次重復。

1.4 優(yōu)化試驗

1.4.1 單因素試驗

采用單一控制變量的方法，黑芥子苷得率為評價指標，以酶解溫度50 ℃、酶添加量30 mg·g-1、酶解pH 10、酶解時間20 min為基本試驗條件，改變其中某一變量時，其他保持不變，考察酶添加量（10、20、30、40和50 mg·g-1）、酶解pH（7、8、9、10和11）、酶解時間（10、15、20、25和30 min）、酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）對黑芥子苷得率的影響。

1.4.2 響應面法優(yōu)化試驗

參考單因素試驗結(jié)果，利用DesignExpertV11軟件，運用BoxBehnken（BBD）的中心組合設計試驗，選取對黑芥子苷得率影響較高的3 個因素：酶添加量（A）、酶解時間（B）、酶解溫度（C）作為自變量，以黑芥子苷得率為評價指標，優(yōu)化黑芥子苷的提取條件。響應面法試驗的因素與水平詳見表1。

1.5 提取方法比較

超聲輔助提取法：取1.00 g菥蓂種子粉，超聲25 min，360 W，30 ℃，料液比1∶15（g·mL-1）。過濾后取5 mL 提取液加入超純水定容至10 mL。取1 mL過濾液過0.22 μm水系濾膜，進行HPLC檢測。索氏提取法（soxhlet extraction，SE）：取10 g菥蓂種子粉放入濾紙包中，料液比1∶15（g·mL-1），溫度105 ℃，提取時間6 h。后續(xù)樣品的處理步驟同超聲提取法。所有試驗均3次重復。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

使用Microsoft Excel 2007軟件對試驗數(shù)據(jù)進行整理，利用SPSS 18.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行差異顯著性檢驗，利用Origin 2021繪制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶制劑的篩選

由圖2可知，加入不同酶制劑后，除中性蛋白酶外，其他4種酶的加入都提高了黑芥子苷的得率，其中堿性蛋白酶（2.615 mg·g-1）最高，與對照（1.784 mg·g-1）差異極顯著（P<0.01）；其次是纖維素酶，與對照差異顯著（P<0.05）；果膠酶和酸性蛋白酶處理雖高于對照，但與對照差異不顯著。由于菥蓂種子含油量高（20%～36%），黑芥子苷屬于脂肪族硫代葡萄糖苷，在提取過程中會隨著油脂類成分一起溶出。單一的纖維素酶只能破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，不影響脂質(zhì)復合體的穩(wěn)定性，導致油脂相對較難釋放[19]。而堿性蛋白酶處理能使細胞團成“鏤空”形態(tài)[20]，更有利于油脂和黑芥子苷的析出。雖然使用纖維素酶與堿性蛋白酶的黑芥子苷得率差異不顯著，但堿性蛋白酶處理的黑芥子苷得率較纖維素酶高0.146 mg·g-1。因此，選擇堿性蛋白酶進行后續(xù)研究。

2.2 酶解單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶添加量對黑芥子苷含量的影響

由圖3可知，黑芥子苷得率隨酶添加量的增多而升高，當酶的添加量為30 mg·g-1 時黑芥子苷的得率達到峰值；而后繼續(xù)增加酶量，黑芥子苷得率呈下降趨勢。這可能是由于在一定范圍內(nèi)增加酶量，對細胞壁結(jié)構(gòu)的破壞力越強，對脂蛋白、脂多糖等復合體酶解更充分，進而促進了目的成分的釋放；然而當酶使用量超過了一定劑量時，會因酶過量而限制酶解反應[17]。故30 mg·g-1為最優(yōu)酶添加量。

2.2.2 酶解溫度對黑芥子苷含量的影響

隨著酶解溫度的增加，黑芥子苷的得率逐漸提高；當溫度高于50 ℃時，得率明顯下降。這可能是由于在酶的最適反應溫度范圍內(nèi)，升高溫度會使酶活性增強；但溫度過高，超過酶的最適反應溫度后會導致酶失活。因此，酶解最適溫度為50 ℃。

2.2.3 酶解pH對黑芥子苷含量的影響

由于堿性蛋白酶能夠獲得更高的黑芥子苷得率。當酶提取液pH為7～10時，黑芥子苷得率隨pH的增大而增加；當pH 為10 時，得率達到最高；當pH 為11時，黑芥子苷得率急劇下降。這可能是堿性環(huán)境有利于黑芥子苷的穩(wěn)定，但強堿性環(huán)境又會導致黑芥子苷降解。因此，堿性蛋白酶提取黑芥子苷最適pH為10。

2.2.4 酶解時間對黑芥子苷含量的影響

當酶和樣品含量一定時，酶解速率不變，反應時間越長，樣品分解越充分，當達到一定時間時，樣品反應完全，酶解反應終止。由圖3可知，黑芥子苷得率隨酶解時間的增加而增大，當反應時間為20 min時，含量不再增加，因此確定最優(yōu)酶解反應時間為20 min。

2.3 響應面優(yōu)化黑芥子苷提取工藝

2.3.1 響應面優(yōu)化結(jié)果及擬合模型的建立

試驗設計方案與結(jié)果如表2所示。利用響應面軟件對數(shù)據(jù)進行多元回歸和擬合，得到黑芥子苷含量（Y）對酶添加量 （A）、酶解時間 （B）、酶解溫度 （C） 的二次多項回歸方程模型，如下所示。

Y=2.670 0－0.035 0A-0.070 0B-0.023 0C-0.002 5AB+0.007 5AC-0.042 0BC-0.170 0A2-0.093 0B2-0.110 0C2（2）

由表3可知，模型方程的F 值為34.84，P 值小于0.01，表明模型方程差異極顯著，具有統(tǒng)計學意義；失擬項P 值為0.434 6，大于0.05，說明差異不顯著，表明模型擬合度較好，試驗誤差小。在各影響因素中，一次項B（酶解時間）對黑芥子苷得率有極顯著影響，A（酶添加量） 對黑芥子苷得率有顯著影響，C（酶解溫度）對黑芥子苷得率影響不顯著；組合因素中，BC 對黑芥子苷的得率有顯著影響；二次項A2、B2、C2對黑芥子苷得率有極顯著影響。

由表4 可知，CV=1.18%，小于5%，說明模型的可信度較高。回歸決定系數(shù)R2=0.978 2，說明97.82% 的變異可以由這3 個因素解釋。R2Adj=0.950 1，說明95.01%黑芥子苷含量可由該模型解釋。Adeq Precision 值較高，為19.013。因此，該模型可用于預測酶解對黑芥子苷含量的影響。

由黑芥子苷模型的殘差正態(tài)分布圖（圖4）可以看出，各點集中于直線上，分布均勻，呈正態(tài)分布；實際值與預測值較集中，顯示出良好的一致性，表明本模型分析目標產(chǎn)物隨條件變化的可信度高。

2.3.2 提取因素的響應面分析

響應面的交互作用如圖5所示。根據(jù)三維傘狀圖的坡度和與之相對應的二維等高線的形狀，可以判斷出各因素之間的交互作用是否顯著[21]。黑芥子苷得率隨著B（酶解時間）和C（酶解溫度）的增加先逐漸升高而后逐漸下降，且B、C 間間交互作用顯著；A（酶添加量）及A 與B、C 間交互作用均不顯著。各因素的影響強度為B>A>C。

2.3.3 最佳提取工藝及驗證

由模型得到酶法輔助超聲提取黑芥子苷最佳工藝條件為：酶添加量2.90%，酶解時間17.90 min，酶解溫度49.05 ℃，在此基礎(chǔ)上，菥蓂種子中黑芥子苷含量預測值為2.687 mg·g-1?？紤]到實際操作可行性，將工藝條件校正為酶用量2.90 %，酶解時間18 min，酶解溫度49 ℃，在此條件下，3次重復得到菥蓂種子中黑芥子苷得率為（2.679±0.026） mg·g-1，與模型預測值差異不顯著，說明結(jié)果可信。

2.3.4 不同提取工藝比較

利用超聲輔助（UAE）、索氏（SE）提取及本試驗優(yōu)化后的酶解-超聲提?。‥H-UAE）工藝對同一批菥蓂種子中黑芥子苷進行提取和得率檢測，結(jié)果（圖6）表明，本試驗優(yōu)化后提取方法的黑芥子苷得率為2.679 mg·g-1，顯著高于超聲輔助提?。?.036 mg·g-1）和索氏提取（1.702 mg·g-1）。

3 討論

黑芥子苷是菥蓂種子中重要的有效活性成分。黑芥子苷作為一種主要的芥子油苷，是十字花科蔬菜（如卷心菜、花椰菜、西藍花等）中的常見成分[22]，通常被用作食品或與其他草藥結(jié)合用于治療各種疾病[7， 23]。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert軟件的Box-Behnken 方法進行了優(yōu)化，優(yōu)化后該工藝的最優(yōu)參數(shù)為：超聲預處理25 min，功率360 W，料液比1∶15（g·mL-1）；酶添加量2.9%，酶解時間18 min，酶解溫度49 ℃，酶解pH 10。在此條件下，黑芥子苷得率為2.679 mg·g-1，顯著高于超聲輔助提取和索氏提取，為菥蓂中黑芥子苷的提取和菥蓂產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了思路和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

柯秀梅等[24]利用熱回流法，以水為提取溶劑，對同一批菥蓂粉料分別采用120 ℃滅活40 min、未滅活的菥蓂粉料和以乙醇提取菥蓂3種方法提取黑芥子苷，黑芥子苷得率分別為0.365、0.526和0.830 mg·g-1；黃志慧等[25]以40%乙醇研磨勻漿后置于4 ℃冰箱靜置30 min，而后以功率250 W，超聲提取1.5 h，黑芥子苷得率為1.725 mg·g-1。上述研究所得的黑芥子苷得率均極顯著低于本研究利用酶解-超聲輔助提取方法所得到的菥蓂中黑芥子苷得率（2.679 mg·g-1）。由于活性酶破壞了植物細胞壁，擴大了細胞內(nèi)有效成分向提取介質(zhì)擴散的傳質(zhì)面積，減少了傳質(zhì)阻力；結(jié)合超聲波的空化作用、機械效應和熱效應等，加速了胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放、擴散，更利于目的物與溶劑的充分混合、溶解，從而利于提取，能夠顯著提高提取效率和產(chǎn)量。因此，酶解-超聲輔助提取是一種綠色環(huán)保、高效、高得率的提取工藝，利用酶解-超聲輔助提取法從菥蓂中提取黑芥子苷具有降低成本、節(jié)省時間的優(yōu)點，這為菥蓂的深度開發(fā)利用提供了科學依據(jù)，該方法具有廣闊的應用前景。

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（責任編輯：張冬玲）

基金項目：全國第四次中藥資源普查黑龍江專項（2018HLJZYZYPC-16）。