白雯靜　王海峰

【摘 要】 目的：對黃芪原藥材以及加工后的微生物污染情況進行分析和研究，探討藥材（飲片）微生物污染的主要來源。 方法： 參照2015年版《中國藥典》四部通則1105、1106的方法，并結(jié)合傳統(tǒng)生化和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）對純化的菌落進行鑒定。最后，運用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行進一步地統(tǒng)計和分析。 結(jié)果： 黃芪原藥材（飲片）在經(jīng)過100℃、30min熱處理后，需氧菌總數(shù)呈現(xiàn)均勻性地下降，簡單芽孢桿菌、成團泛菌、屎腸球菌、陰溝腸桿菌為黃芪原藥材及飲片污染概率較高的菌。 結(jié)論： 黃芪藥材（飲片）污染菌中腸桿菌科占44%，芽孢菌科占41%。耐熱菌鑒定結(jié)果顯示均為芽孢桿菌。在確保安全和療效的前提下，對芽孢桿菌的殺滅十分有必要。

【關(guān)鍵詞】 黃芪; 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）; 微生物污染

【中圖分類號】R28 【文獻標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2024）10-0067-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.10.zgmzmjyyzz202410014

Research on the Microbial Contamination of Astragali Radix （Herbal Medicine and Processecl Herbs）

BAI Wenjing1* WANG Yanwei2

Lanzhou Institute for Food and Drug Control， Lanzhou 730050， China

Abstract：Objective To explore the main sources of microbial contamination of medicinal materials on the basis of analysis and study of the microbial contamination of medicinal materials before and after processing.? Methods According to the method of Chinese Pharmacopoeia （2015 edition）， the purified colony was identified by combining traditional biochemistry method and matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF-MS）. Finally， SPSS 18.0 software was used for further statistics and analysis of the data. Results After the heat treatment （100℃， 30min）， the value of lgTAMC was uniformly reduced， and Pantoea agglomerans， Klebsiella oxytoca， Pseudomonas monteilii， Enterobacter faecium， Bacillus subtilis and Enterococcus casseliflavus were the bacteria， which with high contamination probability of the medicinal materials.Conclusion The ratio of gram staining results of contaminated bacteria was close to 1∶[KG-*3/5]1. The contamination of Enterobacter xiangfangensis and? Cellulosimicrobium cellulans maybe happened during the processing. Most of the contaminating bacteria are Enterobacteria and Bacillus.Therefore， processing enterprises can establish corresponding measures according to the types of contaminated bacteria.

Key words：Glycyrrhizae Radix et Rhizoma; MALDI-TOF-MS; Microbiological Contamination

1 引言

黃芪屬于根類飲片中較為常見的一種［1］，為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fish.） Bge.var.mongholius（Bge.） Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fish.） Bge.的干燥根，具有補氣升陽，固表止汗，利水消腫，生津養(yǎng)血等功效。黃連上清丸、黃芪健脾膏、通竅鼻炎顆粒、培坤丸等中成藥均以黃芪入藥。另外，由于黃芪具有補氣升陽的功效，常作為藥膳食材中不可或缺的一部分。因而，鑒于黃芪藥材廣泛的應(yīng)用范圍，其質(zhì)量安全會嚴(yán)重影響到關(guān)聯(lián)中成藥品種的安全，而微生物污染又是其質(zhì)量安全中十分重要的一部分。

通過文獻檢索的結(jié)果來看，我國中藥飲片整體微生物污染情況較為嚴(yán)重，不容樂觀［2～10］。根類飲片在《中國藥典》［1］（2020年版）一部所收集的所有中藥材中占有較高的比例，然而由于此類飲片主要來源為植物根莖，因而更容易受到土壤中微生物以及化學(xué)物質(zhì)殘留的影響［2］，微生物污染情況與其他中藥材相比更為嚴(yán)重。對于中藥材微生物污染菌的研究目前主要分為兩個部分：一部分為中藥材內(nèi)生菌的研究［11～12］；另一部分，主要以市場流通的中藥材飲片為研究對象，研究不同地區(qū)市售中藥材微生物污染情況［5～10］。但是，對于基于中藥材飲片加工前后微生物污染情況對比的研究或文獻比較少見。另外，根據(jù)江珍玉等［2］的研究發(fā)現(xiàn)：5種根類飲片中，黃芪的污染水平最高，并有2批次黃芪飲片檢出大腸埃希氏菌。因此，考慮到黃芪微生物污染這一安全隱患，只有通過從土壤到飲片這一全過程進行跟蹤性的研究，才能真正意義上發(fā)掘中藥材飲片微生物污染的緣由，并由此制定出切實有效的微生物污染的防治措施，從而確保飲片應(yīng)有的療效和質(zhì)量安全。

2 材料

2.1 樣品 所有樣品均由項目組于產(chǎn)地農(nóng)貿(mào)市場或當(dāng)?shù)胤N植者處收購，并經(jīng)過蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院朱仁愿高級工程師進行鑒別，3批次樣品均為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fish.） Bge.var.mongholius（Bge.） Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fish.） Bge.的干燥根。樣品編號詳見表1。

所有收到的黃芪樣品平均分為5份，1份實驗室備用作為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)研究，其余4份在保證無菌包裝的前提下，分別委托4家中藥飲片加工企業(yè)進行加工，企業(yè)及加工工藝詳見表2。

2.2 試驗材料 ①儀器信息：生物安全柜（廠家：新加坡藝思高科技有限公司；型號：AC2-6S1）；高壓滅菌器［廠家：致微（廈門）儀器有限公司；型號：GR-85］；恒溫培養(yǎng)箱；基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀（廠家：布魯克公司）。②培養(yǎng)基：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基、pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家均為北京陸橋股份有限公司。

2.3 試驗方法

2.3.1 供試品溶液的制備 以無菌操作的方式將樣品打粉，取樣品粉末25 g，按照1∶[KG-*3/5]10的比例進行稀釋（稀釋液：pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液），樣液均質(zhì)完全后吸取上清液，作為供試液（1∶[KG-*3/5]10）。

2.3.2 需氧菌總數(shù)（TAMC）、霉菌和酵母菌總數(shù)（TYMC）的檢查 取“2.3.1”項下制備的供試液，分別稀釋至1∶[KG-*3/5]100、1∶[KG-*3/5]1000、1∶[KG-*3/5]10000、1∶[KG-*3/5]100000（V/V；稀釋液：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液）。按照2020年版《中國藥典》［13］四部通則1105進行需氧菌總數(shù)（TAMC）、霉菌和酵母菌總數(shù)（TYMC）的測定，為了便于統(tǒng)計，所得TAMC及TYMC數(shù)值取lg值后進行比較和分析。

2.3.3 耐熱菌數(shù)（NAIRE）的檢查 江珍玉等［2］在對5種常見根類中藥飲片微生物污染相關(guān)因素分析研究時，對耐熱菌項目檢查采用“100℃、30min熱處理”的方式。參照該方法將樣品打粉后，取樣品粉末25 g，按照1∶[KG-*3/5]10的比例進行稀釋（稀釋液：pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液），樣液制備后，于沸水浴（100℃）中進行熱處理（時間：30min），均質(zhì)完全后吸取上清液，作為供試液（1∶[KG-*3/5]10），按照2.3.2中需氧菌總數(shù)的檢查方法進行耐熱菌數(shù)的測定。

2.3.4 控制菌的檢查

2.3.4.1 耐膽鹽革蘭陰性菌（定性試驗） 取2.3.1項下制備的供試液，參照2020年版《中國藥典》［13］四部通則1106項下“耐膽鹽革蘭陰性菌”定性試驗方法進行相關(guān)檢驗。

2.3.4.2 大腸埃希菌 取2.3.1項下制備的供試液，參照2020年版《中國藥典》［13］四部通則1106項下“大腸埃希菌”相關(guān)方法進行檢驗。

2.3.4.3 沙門菌 參照2020年版《中國藥典》［13］四部通則1106項下“沙門菌”試驗方法進行相關(guān)檢驗。

2.3.4.4 銅綠假單胞菌 取2.3.1項下制備的供試液，參照2020年版《中國藥典》［13］四部通則1106項下“銅綠假單胞菌”試驗方法進行相關(guān)檢驗。

2.3.4.5 金黃色葡萄球菌 取2.3.1項下制備的供試液，參照2020年版《中國藥典》［13］四部通則1106項下“金黃色葡萄球菌”的試驗方法進行相關(guān)檢驗。

2.3.5 分離和鑒定 對2.3.2項、2.3.3項、2.3.4項下所有培養(yǎng)基平皿上培養(yǎng)出來的菌落按照形態(tài)和大小分別挑取并純化培養(yǎng)至TSA平板上，按照儀器自帶提取方法進行操作，再使用 MALDI-TOF-MS進行初步鑒定。如果鑒定結(jié)果未檢出或低于2.000的打分值，將菌落使用血平板經(jīng)多次純化后再上機鑒定。

2.3.6 統(tǒng)計和分析 采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，并采用Krona軟件對鑒定結(jié)果進行描述和分析。涉及到的計數(shù)資料均采用描述性分析方法。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃芪樣品的lgTAMC、TYMC、lgTYMC、lgNAIRE檢查結(jié)果 3批黃芪樣品的lgTAMC、lgNAIRE結(jié)果如表3所示，TYMC、lgTYMC的結(jié)果如表4所示：由表3可知，3批黃芪樣品lgTAMC、lgNAIRE值均高，提示微生物污染數(shù)值較高。由表4可知，與HQ-1（Y）、HQ-2（Y）、HQ-3（Y）相比較，加工企業(yè)A和C在加工后，TYMC數(shù)值均有不同程度的增加，提示可能與加工工藝中缺少干燥或者干燥環(huán)節(jié)時長不夠而引起霉菌污染有關(guān)。

3.2 黃芪樣品經(jīng)100℃、30min熱處理［2.3.3耐熱菌數(shù)（NAIRE）的檢查］后lgNAIRE數(shù)值與熱處理前l(fā)gTAMC數(shù)值相比下降百分比結(jié)果 由表5、表6可知：黃芪原藥材以及加工后的飲片經(jīng)100℃、30min熱處理后，數(shù)值呈現(xiàn)均勻性下降（數(shù)值集中在50%±10%），提示黃芪藥材及飲片中耐熱菌（NAIRE）的總體數(shù)量可能在污染菌總數(shù)的50%左右。

3.3 黃芪樣品MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果 由表7、表8和圖1可知：Bacillus simplex簡單芽孢桿菌、Pantoea agglomerans成團泛菌、Enterobacter faecium屎腸球菌、Enterobacter cloacea陰溝腸桿菌為黃芪原藥材及飲片污染概率較高的菌株；經(jīng)100℃、30min熱處理［2.3.3耐熱菌數(shù)（NAIRE）的檢查］后所得耐熱菌進一步分離鑒定顯示多為芽孢桿菌。另外，由表7可知（加工后的菌株種類與加工前的菌株種類相比）：Enterobacter faeciums屎腸球菌、Enterobacter xiangfangensis香坊區(qū)腸桿菌分別可能是由B加工企業(yè)與C加工企業(yè)在加工環(huán)節(jié)中引入。因此，加工工藝及環(huán)境條件是黃芪微生物污染整個鏈條中比較重要的一環(huán)，加工廠家可能由于環(huán)境措施控制不到位而引入其他菌群的污染。

3.4 黃芪樣品中控制菌檢查結(jié)果 根據(jù)2.3.4的方法，對控制菌進行檢查，15批樣品［HQ（Y）1～3、HQ（A）1～3、HQ（B）1～3、HQ（C）1～3、HQ（D）1～3］均未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌。

4 討論

通過對鑒定結(jié)果進行進一步地整理和分析：鑒定菌株共為44株：其中腸桿菌科占44%，芽孢菌科占41%。耐熱菌的鑒定結(jié)果顯示為芽孢桿菌。因此，在黃芪原藥材及加工后的藥材中主要的污染菌為腸桿菌與芽孢桿菌。眾所周知，芽孢桿菌較難清除，由于其會產(chǎn)生大量的內(nèi)生芽孢，這些內(nèi)生芽孢在一定的條件下會被激活從而會大量地增殖，對黃芪中藥材的質(zhì)量安全產(chǎn)生重大的隱患。另一方面，腸桿菌科中往往包括一些致病性較強的菌，此類菌會對人體健康產(chǎn)生不利地影響。

另外，經(jīng)過對加工前后污染菌菌株種類的對比可知，Enterobacter faeciums屎腸球菌、Enterobacter xiangfangensis香坊區(qū)腸桿菌懷疑分別由B加工企業(yè)和C加工企業(yè)在生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)中帶入。對于生產(chǎn)企業(yè)而言，內(nèi)部質(zhì)量控制十分重要，應(yīng)該加強其生產(chǎn)加工環(huán)境的質(zhì)量安全控制，在發(fā)現(xiàn)有微生物污染時，應(yīng)該及時排查并制定有效措施加以處理。

綜上所述，黃芪藥材微生物污染主要來源可能包括內(nèi)生菌、土壤以及生產(chǎn)加工帶入等多個方面。通過對其污染菌的鑒定分型可知污染菌主要為腸桿菌和芽孢桿菌這兩類。因此，后期在滅菌工藝研究中，應(yīng)主要關(guān)注這兩類污染菌。然而，芽孢桿菌由于可產(chǎn)生大量內(nèi)生芽孢，這類芽孢抗逆性強，耐高溫 、紫外線及電離輻射等，較難清除。因此，應(yīng)著重考慮該類菌的消殺，進而確保黃芪藥材污染菌的種類和數(shù)量控制在安全的范圍內(nèi)。

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（收稿日期：2023-08-11 編輯：杜玲玉珊）

基金項目：甘肅省隴原青年創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才項目—甘肅省大宗藥材微生物污染菌數(shù)據(jù)庫的建立與防治技術(shù)研究（甘組通字〔2022〕77號）；蘭州市科技發(fā)展指導(dǎo)性計劃項目（2022-5-9; 甘肅省藥品產(chǎn)業(yè)技術(shù)扶持項目（2019KF006）。

作者簡介：白雯靜（1987—），女，漢族，醫(yī)學(xué)碩士，主管藥師，研究方向為食品、藥品微生物研究。E-mail：yd08joy@163.com