摘 要 2017—2021年，收集5家飼養(yǎng)單位12種圈養(yǎng)珍稀鶴類的284份樣品進(jìn)行血孢子蟲病的流行調(diào)查。采用血孢子蟲細(xì)胞色素b（Cyt b）基因套式PCR檢測和Blast序列比對(duì)，結(jié)果顯示：血孢子蟲基因序列與已知長瘧原蟲（Plasmodium elongatum）DENVID02進(jìn)化支匹配度達(dá)到100％；結(jié)合蟲體形態(tài)學(xué)，確定該寄生蟲所屬類群為長瘧原蟲。長瘧原蟲在黑頸鶴（Grus nigricollis）、白鶴（Leucogeranus leucogeranus）、丹頂鶴（Grus japo?nensis）、白頭鶴（G. monacha）、灰鶴（G. grus）和白枕鶴（Antigone vipio）6種鶴類中被檢出，檢出率為8. 45%（24/284）。此外，感染長瘧原蟲DENVID02進(jìn)化支的鶴類個(gè)體未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，所有感染個(gè)體均未采取防治措施。在跟蹤監(jiān)測中，發(fā)現(xiàn)病原體在鶴類體內(nèi)消失或呈跨年度攜帶現(xiàn)象，推測鶴類可能對(duì)長瘧原蟲DENVID02具有先天抵抗力。

關(guān)鍵詞：珍稀鶴類；長瘧原蟲；流行；疾病防控

中圖分類號(hào)：S858. 9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2310 - 1490（2024）- 02 - 0347 - 07

DOI：10.12375/ysdwxb.20240214

血液寄生蟲嚴(yán)重影響鳥類健康狀況，癥狀表現(xiàn)在生理、行為等多個(gè)方面，可能使寄主的適合度降低，是導(dǎo)致物種滅絕的原因之一［1?2］。在各類血液寄生蟲的研究中，以血孢子蟲最為深入［3］。能感染鳥類的血孢子蟲目（Haemosporidia）有3 屬，分別為瘧原蟲屬（Plasmodium）、血變?cè)x屬（Haemoproteus）和住白細(xì)胞原蟲屬（Leucocytozoon）［4］，通常通過吸血蚊蟲傳播［5］。瘧原蟲是一種呈全球性分布的血液寄生蟲，已報(bào)道的瘧原蟲種類多達(dá)200余種［6］，通過形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行明確鑒定的鳥類瘧原蟲已有55種［7］。長瘧原蟲（Plasmodium elongatum）已在多種鳥類中被檢出，包括企鵝目（Sphenisciformes）、雀形目（Passeri?formes）和無翼鳥目（Apterygiformes）等［8?10］。

鶴被稱為評(píng)估濕地生態(tài)系統(tǒng)健康的“旗艦物種”［11］。我國是世界上擁有鶴種類最多的國家之一［12］，其中，白鶴（Leucogeranus leucogeranus）、白枕鶴（Antigone vipio）、赤頸鶴（A. antigone）、黑頸鶴（Grus nigricollis）、白頭鶴（G. monacha）和丹頂鶴（G.japonensis）為國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物［13］。我國鶴類寄生蟲性疾病發(fā)病數(shù)量占鶴類疾病發(fā)病數(shù)量的26. 15％ ，尤其是幼鶴感染血孢子蟲后致死率較高［14?16］。已有報(bào)道指出，長瘧原蟲會(huì)對(duì)非適應(yīng)性鳥類的健康造成威脅［8?10，17?19］，典型易感動(dòng)物為麥哲倫企鵝（Spheniscus magellanicus），其在圈養(yǎng)種群中傳播會(huì)導(dǎo)致高發(fā)病率和快速死亡［20?21］。然而長瘧原蟲在圈養(yǎng)鶴類中的感染情況尚未被報(bào)道。2017—2021年，以5家飼養(yǎng)單位12種珍稀鶴類的血液或組織樣品為研究對(duì)象，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等方法分析樣品中長瘧原蟲的感染情況，以期指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐，促進(jìn)珍稀鶴類種群健康發(fā)展。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集與處理

采集北京動(dòng)物園十三陵繁育研究基地（以下簡稱“北京動(dòng)物園”）、南京紅山森林動(dòng)物園、保定動(dòng)物園、杭州動(dòng)物園和太原動(dòng)物園12種珍稀鶴類的血液或組織，共284份樣品（表1）。將新鮮血液樣品分為2份，1份用于制備血涂片，另1份置于EDTA抗凝管內(nèi)，-80 ℃保存?zhèn)溆?；將新鮮組織樣品制備成組織觸片后，-80 ℃保存?zhèn)溆?。血涂片及臟器觸片經(jīng)甲醇固定后，室溫存放備用。

1. 2 DNA 提取、擴(kuò)增、測序和序列分析

按照Ezup 柱式血液基因組DNA 抽提試劑盒（B518253-0050，生工生物工程（上海）股份有限公司）和Ezup 柱式動(dòng)物基因組DNA 抽提試劑盒（B518251-0050，生工生物工程（上海）股份有限公司）的使用說明進(jìn)行血液及組織樣品的DNA提取。

采用巢式PCR法，擴(kuò)增鳥類血液和組織寄生蟲細(xì)胞色素b（Cyt b）基因片段［22］。第1輪擴(kuò)增引物為F（5'-CATATATTAAGAGAAITATGGAG-3'；I為通用堿基，次黃（嘌呤核）苷）和R（5'-ATAGAAAGATAAGAAATACCATTC-3'）。反應(yīng)體系20 μL，包括2×Taq酶混合溶液（B639295，Life Biotech，India Delhi）10 μL，F(xiàn)、R各1 μL，ddH2O 6 μL，模板DNA 2 μL。第1輪擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃模板變性3 min；94 ℃產(chǎn)物變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃引物延伸45 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。第2 輪擴(kuò)增引物為F（5'-ATGGTGCTTTCGATATATGCATG-3'）和R（5'-GCATTATCTGGATGTGATAATGGT-3'）。反應(yīng)體系25. 0 μL，包含2×Taq 酶混合溶液12. 5 μL，F(xiàn)、R 各1. 0 μL，ddH2O 8. 5 μL，模板DNA 2. 0 μL，模板為第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物。第2輪擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃模板變性3 min；94 ℃產(chǎn)物變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃引物延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1. 5%瓊脂糖凝膠對(duì)5 μL第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，凝膠用4S Green Plus無毒核酸凝膠染液（生工生物工程（上海）股份有限公司）染色，在凝膠成像儀（GenoSens1800，Clinx Science Instruments）中觀察結(jié)果。電泳檢測為陽性的樣品，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序。所有樣品均重復(fù)檢測3次。

計(jì)算珍稀鶴類某種瘧原蟲的感染率，感染率=某種瘧原蟲陽性樣品數(shù)/檢測總樣品數(shù)×100%。將雙向測序的序列拼接后，與MalAvi 數(shù)據(jù)庫（Version2. 5. 6，http：//130. 235. 244. 92/Malavi/about. html）和NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast模塊進(jìn)行比對(duì)，鑒定血液寄生蟲所屬類群［23］，DNA序列相似度達(dá)到100%的歸為相同進(jìn)化支。多序列比對(duì)使用ClustalX 1. 83軟件。

1. 3 血涂片檢測

使用瑞氏-吉姆薩染液（417101，珠海貝索生物技術(shù)有限公司）將固定的血涂片和組織觸片染色15 min，雙蒸水漂浮后流水沖洗，風(fēng)干后在光學(xué)顯微鏡下觀察。先在40×物鏡下找到目標(biāo)位置，再用60×油鏡檢測，判斷個(gè)體是否感染血孢子蟲以及寄生蟲的形態(tài)特征，判斷血孢子蟲所屬類群，每個(gè)血涂片觀察100個(gè)視野［8］。

2 結(jié)果

2. 1 長瘧原蟲序列分析

經(jīng)巢式PCR法檢測、序列拼接和比對(duì)分析后，發(fā)現(xiàn)寄生蟲所屬類群為長瘧原蟲。Cyt b 擴(kuò)增部分序列長度為479 bp，與DENVID02進(jìn)化支（GenBank登錄號(hào)：KU057965）匹配度達(dá)100％，與pGRW6進(jìn)化支（GenBank登錄號(hào)：DQ368381）僅有1個(gè)堿基差異，即C轉(zhuǎn)換為T（圖1）。

2. 2 長瘧原蟲形態(tài)學(xué)特征

經(jīng)外周血涂片瑞氏-吉姆薩染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞內(nèi)裂殖體和配子體的形態(tài)符合長瘧原蟲的特征［24］。寄生于紅細(xì)胞中的長瘧原蟲早期滋養(yǎng)體形態(tài)不規(guī)則，邊緣偶有輕微變形（圖2A）。裂殖體（圖2B～D）常見于成熟紅細(xì)胞中，瘧色素呈棕黑色，常聚集成一個(gè)團(tuán)塊；在成熟裂殖體中，裂殖子的數(shù)量從2 個(gè)到11 個(gè)不等，呈圓形或橢圓形，有時(shí)形狀不規(guī)則；當(dāng)裂殖子數(shù)量多達(dá)十幾個(gè)時(shí)，裂殖體體積較大，可占據(jù)宿主細(xì)胞漿一半的空間，使宿主細(xì)胞核移位（圖2D）。大配子體（圖2E）、小配子體（圖2F）形狀細(xì)長，邊緣粗糙，細(xì)胞質(zhì)中有多個(gè)瘧色素顆粒；大配子體細(xì)胞質(zhì)藍(lán)染，較小配子體染色深。

2. 3 長瘧原蟲感染情況

分析發(fā)現(xiàn)5家動(dòng)物園284份珍稀鶴類樣本中，有24個(gè)樣本感染了長瘧原蟲，檢出率為8. 45%。陽性樣品均來自北京動(dòng)物園，包括黑頸鶴（n=11）、白鶴（n=3）、白頭鶴（n=3）、丹頂鶴（n=2）、灰鶴（Grus grus，n=2）和白枕鶴（n=2）共計(jì)6個(gè)物種23只個(gè)體，且感染個(gè)體均未出現(xiàn)臨床癥狀及發(fā)病死亡現(xiàn)象。其他4家動(dòng)物園的鶴類樣本未檢測出長瘧原蟲。對(duì)采樣年份、個(gè)體來源、年齡及性別等信息進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)：（1）2017—2021年，北京動(dòng)物園均有鶴類呈長瘧原蟲陽性，2017、2018、2019、2020、2021年陽性樣本數(shù)分別為3、4、2、1、14；在感染的23只個(gè)體中，22只個(gè)體呈單一年份感染，而2018年出殼的黑頸鶴（7Q045）在當(dāng)年和次年均呈陽性，2020年轉(zhuǎn)為陰性；（2）野生個(gè)體和圈養(yǎng)出生個(gè)體均可被感染；（3）幼體（lt;1歲）、亞成體（1～4 歲）和成體（≥4 歲）均可被感染；（4）在感染的23 只個(gè)體中，16 只為雌性，7 只為雄性（表2）。

3 討論

北京動(dòng)物園圈養(yǎng)的黑頸鶴、白鶴、白頭鶴、丹頂鶴、灰鶴和白枕鶴感染的長瘧原蟲（DENVID02）進(jìn)化支僅在巴西圣保羅動(dòng)物園的白臉樹鴨（Dendrocygnaviduata）和北京地區(qū)的戈氏巖鹀（Emberiza godlews?kii）樣本中被檢出［25?26］。通過比對(duì)DENVID02 與pGRW6 的Cyt b 序列，僅有1 個(gè)堿基差異（圖1）。pGRW6進(jìn)化支在除澳大利亞和南極洲外的其他地區(qū)均有分布，鳥類宿主范圍有60 余種［24］。此外，DENVID02的分布和宿主范圍顯著少于pGRW6，且該進(jìn)化支的發(fā)現(xiàn)和研究也晚于pGRW6，因此，學(xué)者推測DENVID02是由pGRW6進(jìn)化所得［26］。本研究檢出的DENVID02進(jìn)化支基因序列與北京地區(qū)的雀形目戈氏巖鹀中報(bào)道［26］的進(jìn)化支序列一致（圖1），推測該進(jìn)化支可能已經(jīng)在北京地區(qū)，甚至向周邊其他地區(qū)傳播，但這一推測需要進(jìn)一步擴(kuò)大宿主和地域監(jiān)測范圍來驗(yàn)證。本研究中長瘧原蟲DENVID02的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)顯示，紅細(xì)胞內(nèi)裂殖體和配子體的形態(tài)特征符合長瘧原蟲的特征，同時(shí)發(fā)現(xiàn)存在大量含2個(gè)裂殖子的成熟裂殖體，這區(qū)別于金絲雀（Serinuscanaria）長瘧原蟲的形態(tài)［24］，引起圈養(yǎng)鶴類長瘧原蟲（DENVID02）進(jìn)化支形態(tài)學(xué)特征發(fā)生變化的因素有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

長瘧原蟲不同進(jìn)化支對(duì)鳥類的致病性存在顯著差異，侵染非適應(yīng)性鳥類種群時(shí)，如麥哲倫企鵝和幾維鳥（Apteryx mantelli）感染pGRW6進(jìn)化支可能出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，甚至死亡［20?21，27］，然而，當(dāng)紫翅椋鳥（Sturnus vulgaris）和紅交嘴雀（Loxia curvirostra）感染pGRW6進(jìn)化支時(shí)，卻無明顯致病性，推測這兩種鳥可能具有先天抗性［28］。長瘧原蟲（GenBank登錄號(hào)：DQ659588）在新西蘭鞍背鴉（Philesturnus carun?culatus）中被檢出，單獨(dú)感染無明顯致病性［29］。新西蘭馬爾伯勒海峽2個(gè)近海島嶼在2002年和2007年曾爆發(fā)鞍背鴉大量死亡事件，原因是禽痘病毒和長瘧原蟲混合感染導(dǎo)致［30］。本研究中，圈養(yǎng)黑頸鶴、白鶴和丹頂鶴等感染長瘧原蟲（DENVID02）后，并未發(fā)病和死亡，且感染個(gè)體未經(jīng)治療即自愈，因此推測這幾種鶴對(duì)此長瘧原蟲有一定的抵抗力。當(dāng)發(fā)現(xiàn)鶴類感染長瘧原蟲（DENVID02）后，如無臨床癥狀，無需采取干預(yù)措施，但建議對(duì)感染個(gè)體實(shí)施跟蹤監(jiān)測，及時(shí)了解動(dòng)物健康狀況，避免出現(xiàn)因抵抗力下降所致的繼發(fā)或混合感染現(xiàn)象。

本研究于2017—2021 年共檢測12 種鶴類，其中，在黑頸鶴、白鶴、白頭鶴、丹頂鶴、灰鶴和白枕鶴6種鶴類中檢出感染個(gè)體，而其他鶴類并未檢出，推測不同鶴類是否感染長瘧原蟲可能與動(dòng)物自身的易感性有關(guān)，未來需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)，不同年齡和不同性別的鶴類個(gè)體均可感染長瘧原蟲（DENVID02），今后可持續(xù)關(guān)注感染長瘧原蟲的個(gè)體狀態(tài)，為進(jìn)一步研究長瘧原蟲在珍稀鶴類中的流行特點(diǎn)積累數(shù)據(jù)。綜上，未來應(yīng)擴(kuò)大監(jiān)測范圍，特別是要加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物園、保護(hù)區(qū)的圈養(yǎng)鳥類及野生鳥類血孢子蟲的主動(dòng)監(jiān)測力度，了解血孢子蟲病的流行特點(diǎn)，探討病原、宿主與傳播媒介間的相互依存關(guān)系，提出有針對(duì)性的防治措施，以期為疾病防控和預(yù)警提供科學(xué)依據(jù)。

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基金項(xiàng)目：北京動(dòng)物園管理處野生鳥類血孢子蟲檢測平臺(tái)