左仁芳　戴桂金　王妙　張玉涵　羅杰　熊浩　劉志邦　陳武瑛　張卓

摘要：采用改良的QuEChERS方法進行前處理，建立了甘薯和土壤中烯效唑殘留的QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品用含0.1%乙酸的乙腈振蕩提取，經(jīng)C18凈化劑進行基質(zhì)凈化，采用C18反相色譜柱分離，進行LC-MS/MS檢測。結(jié)果表明：烯效唑在0.000 5～1.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.995 1～0.995 9；在0.002、0.02、0.20 mg/kg 3個添加水平下，烯效唑在甘薯和土壤中的平均回收率為90.3%～106.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%～3.6%，方法定量限為0.002 mg/kg。該方法方便快捷、精準(zhǔn)定量、檢測靈敏，適用于甘薯和土壤樣品中烯效唑的檢測。

關(guān)鍵詞：烯效唑；甘薯；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；殘留；方法

中圖分類號：O657.63文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1006-060X（2024）05-0090-06

Determination of Uniconazole Residue in Sweet Potatoes and Soil by

QuEChERS-HPLC-MS/MS

ZUO Ren-fang1，DAI Gui-jin2，WANG Miao3，ZHANG Yu-han3，LUO Jie3，XIONG Hao3，

LIU Zhi-bang3，CHEN Wu-ying3，ZHANG Zhuo3

（1. Plant Protection and Inspection Station， Fenghuang County Bureau of Agriculture and Rural Affairs， Fenghuang 416200， PRC;?2. Agricultural Characteristic Industry Service Center， Fenghuang County Bureau of Agriculture and Rural Affairs， Fenghuang 416299， PRC; 3. Hunan Institute of Plant Protection， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC）

Abstract： A method for determining the uniconazole residue in sweet potatoes and soil was established by the combination of improved QuEChERS （quick， easy， cheap， effective， rugged， and safe） with high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. Each sample was extracted by shaking with acetonitrile containing 0.1% （volume fraction） acetic acid， purified by C18 purification agent， separated by reversed-phase C18 column chromatography， and detected by LC-MS/MS. The results showed good linearity between the peak area and the uniconazole concentration within the range of 0.000 5-1.0 mg/L?（R2 of 0.995 1-0.995 9）. The recovery of uniconazole in sweet potatoes and soil at the spike levels of 0.002， 0.02， and 0.20 mg/kg ranged from 90.3% to 106.7% with the relative standard deviations （RSDs） of 0.6%-3.6%. The established method showed the limit of quantification （LOQ） of 0.002 mg/kg. With easy operation， high sensitivity， and high accuracy， the established method is suitable for the detection of uniconazole in sweet potatoes and soil.

Key words： uniconazole; sweet potato; high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; residue; method

甘薯[Ipomoea batatas（L.）Lam]屬于旋花科植物，適應(yīng)性強，廣泛種植于熱帶、亞熱帶和暖溫帶地區(qū)，是一種重要的糧食作物。甘薯起源于拉丁美洲，目前中國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國和消費國，主要將甘薯用于食品、動物飼料和工業(yè)加工等方面。在甘薯生產(chǎn)過程中，常因物候條件、品種等原因出現(xiàn)甘薯莖葉徒長的現(xiàn)象，導(dǎo)致甘薯地下部分產(chǎn)量降低、淀粉含量下降，嚴(yán)重影響甘薯的經(jīng)濟產(chǎn)量[1]；而噴施外源化學(xué)調(diào)控劑可有效抑制莖葉徒長，從而增加塊根產(chǎn)量[2]。

烯效唑（Uniconazole）作為一種新型植物生長調(diào)節(jié)劑，可以調(diào)控多種植物的生理功能，如生長發(fā)育、光合和呼吸作用、礦質(zhì)營養(yǎng)和碳水化合物的代謝與分配和植物抗性等，是目前中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用面積最廣的植物生長延緩劑之一[3]。研究表明，對塊根、塊莖類作物施加烯效唑，可抑制莖葉的生長，增加其根冠比，促進光合同化產(chǎn)物向作物產(chǎn)品器官（果實、種子、塊根、塊莖等）的分配，從而增加作物產(chǎn)量和增強作物抗逆能力[4-6]，因此烯效唑現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于薯類、蘿卜等塊根塊莖類作物[7]。在實際生產(chǎn)中，過量使用植物生長調(diào)節(jié)劑會影響動物及人體健康，如低于日允許攝入量濃度的矮壯素仍會對動物的繁殖能力產(chǎn)生不良影響[8]。此外，烯效唑施用不當(dāng)會造成殘留超標(biāo)，而我國食品中農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2021[9]尚未對烯效唑在甘薯中的最大殘留限量進行規(guī)定。因此需要創(chuàng)建甘薯中烯效唑殘留的檢測方法，用以評估烯效唑應(yīng)用于甘薯生產(chǎn)的安全性。

目前檢測烯效唑殘留主要采用的方法有氣相色譜法（GC）[10]、液相色譜法（HPLC）[11]和液質(zhì)聯(lián)用法（HPLC-MS/MS）[4]等，但由于烯效唑具有相對分子質(zhì)量較大、氣化溫度高、極性較強等特點，采用氣相色譜法的檢測效果不理想，所以采用液相色譜法[10-12]和液質(zhì)聯(lián)用法[13-17]檢測烯效唑殘留更常見。另張良等[18]采用包被抗體直接競爭模式建立了蘋果中烯效唑的酶聯(lián)免疫吸附分析法，該方法中烯效唑的檢出限（LOD）為0.024 μg/kg。表1總結(jié)了3種檢測方法測定不同農(nóng)產(chǎn)品中烯效唑殘留的前處理方法和方法定量限（LOQ）。國內(nèi)外關(guān)于農(nóng)產(chǎn)品中烯效唑殘留的檢測主要涉及葉類蔬菜和水果等，但在甘薯中還尚未見相關(guān)報道。該研究通過改良的QuEChERS方法對甘薯和土壤中烯效唑進行提取和凈化，建立甘薯和土壤中烯效唑殘留的QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，為評估烯效唑在甘薯生產(chǎn)中應(yīng)用的安全性提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯和土壤空白樣品采自鳳凰縣林峰鄉(xiāng)土洞村紅薯種植基地，烯效唑標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr. Ehrenstorfer公司，色譜級甲酸、甲醇和乙腈購自默克化工技術(shù)（上海）有限公司，分析級乙酸、乙腈和氯化鈉購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，PSA、C18和石墨化炭黑（GCB）購自天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CPA225D電子天平（德國賽多利斯公司），多管渦旋振蕩儀（杭州瑞誠儀器有限公司），TDL-40B低速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），移液器（Eppendorf艾本德公司），Centrifuge 5424高速離心機（Eppendorf艾本德公司），LC1290-AB SCIEX 4500Q高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（美國Aglient公司和美國SCIEX公司）。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理 稱取5 g均質(zhì)后的甘薯樣品于50 mL離心管中，加入5 mL雙蒸水，輕微振蕩混勻后浸泡5 min，加入10 mL含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸的乙腈溶液，渦旋振蕩10 min，加入5 g NaCl，顛倒混勻后再渦旋振蕩2 min，4 500 r/min轉(zhuǎn)速下低速離心5 min。取1.5 mL上清液至裝有50 mg C18凈化劑的2 mL離心管中，渦旋30 s后在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下高速離心5 min，取上清液過0.2 μm有機濾膜，濾液待LC-MS/MS檢測。

稱取5 g土壤樣品于50 mL離心管中，加入10 mL雙蒸水，輕微振蕩混勻后浸泡5 min，加入10 mL乙腈提取液，渦旋振蕩10 min，加入5 g NaCl，顛倒混勻后渦旋振蕩2 min，4 500 r/min轉(zhuǎn)速下低速離心5 min。取1.5 mL上清液至裝有50 mg C18凈化劑的2 mL離心管中，渦旋30 s后在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下高速離心5 min，取上清液過0.2 μm有機濾膜，濾液待LC-MS/MS檢測。

1.3.2 儀器條件 液相模塊：色譜分離柱為ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（3 mm×100 mm，1.8 ?m）；柱溫箱設(shè)為25℃，進樣量設(shè)為1.0 μL；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液，流速為0.4 mL/min；流動相梯度洗脫程序如表2所示。

質(zhì)譜模塊：使用電噴霧離子源（ESI），離子源溫度500℃，離子噴霧電壓5 500 V，噴霧氣壓和輔助加熱氣壓310.3 kPa，氣簾氣壓275.8 kPa，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）進行檢測。烯效唑質(zhì)譜測定參數(shù)設(shè)置為：保留時間2.49 min，母離子291.9，子離子70.0*和125.1，錐孔電壓51 V，碰撞能59 eV和29 eV；其中“*”表示定量離子。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取烯效唑標(biāo)準(zhǔn)品0.010 1 g配制成1 000 mg/L的母液；準(zhǔn)確量取烯效唑母液，用乙腈逐級稀釋成1.0、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001和0.000 5 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。將甘薯和土壤空白樣品進行前處理得到空白基質(zhì)溶液，稀釋得到濃度梯度為1.0、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001和0.000 5 mg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。將可檢測出烯效唑溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的最小濃度定義為方法檢出限（LOD）。

1.3.4 添加回收試驗 將空白甘薯和土壤樣品前處理后進行添加回收試驗，添加水平分別設(shè)置為0.002、0.02和0.2 mg/kg，每個水平重復(fù)5次，通過計算添加回收率及其對應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差考察方法精確度，將最小添加濃度水平定義為方法定量限（LOQ）。

1.3.5 基質(zhì)效應(yīng) 由于質(zhì)譜離子豐度易受甘薯和土壤樣品復(fù)雜基質(zhì)的干擾，根據(jù)公式（1）計算甘薯和土壤樣品的基質(zhì)效應(yīng)（ME），根據(jù)ME值的范圍判定基質(zhì)效應(yīng)的強弱[19]。

式中，km為空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液所制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，ks為溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液所制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的確定

烯效唑分子含有羥基，在電噴霧下易離子化，所以選取ESI源作為質(zhì)譜離子源。首先在ESI+模式下通過質(zhì)譜調(diào)諧優(yōu)化找到母離子291.9，然后優(yōu)化碰撞能量選擇響應(yīng)值較高的碎片子離子作為定量離子70.0和定性離子125.1。烯效唑在C18色譜柱上的保留效果好，比較不同有機流動相（甲醇和乙腈）的烯效唑洗脫效果，結(jié)果表明乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時，色譜峰形對稱，信號穩(wěn)定，保留時間為2.49 min。

2.2 提取方法的改良

在常規(guī)QuEChERS方法中，提取溶劑通常選擇乙腈，但不同的農(nóng)藥結(jié)構(gòu)、樣品基質(zhì)、提取液pH值條件對農(nóng)藥的提取效果均有很大影響。前期研究表明在乙腈提取液中加入不同比例的乙酸，可以更好的將烯效唑從復(fù)雜基質(zhì)中提取出來[16-17]。該研究比較了乙腈和含0.1%乙酸的乙腈對甘薯中烯效唑提取效率的影響，由圖1 A可知，用乙腈提取的平均回收率為75.43%，而用含0.1%乙酸的乙腈提取的平均回收率為89.12%，因此選擇含0.1%乙酸的乙腈作為甘薯中烯效唑的提取溶劑。

在QuEChERS前處理方法中，分散固相萃取凈化過程中常見的吸附劑有C18、PSA和GCB。其中C18是一種廣譜性的非極性凈化劑，能有效吸附基質(zhì)中微量的非極性雜質(zhì)；PSA屬于氨基吸附劑，它能夠通過氫鍵除去基質(zhì)中的有機酸、糖等物質(zhì)；而GCB具有極強的吸附能力，能去除部分色素，但有時也會吸附某些農(nóng)藥[16]。該研究分別以50 mg C18、50 mg C18+50 mg GCB、50 mg PSA和50 mg PSA+50 mg GCB為凈化劑，比較其對甘薯中烯效唑回收率的影響。由圖1 B可知，50 mg C18、50 mg C18+50 mg GCB、50 mg PSA和50 mg PSA+50 mg GCB為凈化劑時，甘薯中烯效唑的平均回收率分別為92.18%、79.51%、86.84%和78.63%，因此選擇C18作為固相萃取凈化的凈化劑。

2.3 分析方法的線性關(guān)系、準(zhǔn)確度

由表3可知，在0.000 5～1.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，烯效唑在基質(zhì)中均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.995 1～0.995 9，表明該研究建立的甘薯和土壤中烯效唑殘留的分析方法能滿足農(nóng)藥殘留分析所要求的準(zhǔn)確度。此外，烯效唑在甘薯和土壤中的基質(zhì)效應(yīng)分別為5.5%和6.2%，表明甘薯和土壤提取液經(jīng)過凈化后，均可以消除大部分基質(zhì)雜質(zhì)的干擾，因此該方法中數(shù)據(jù)的校準(zhǔn)采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進行，以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。

由表4可知，烯效唑在甘薯中的平均回收率為90.4%～106.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.6%～2.3%；烯效唑在土壤中的平均回收率為90.3%～94.6%，RSD為1.2%～3.6%。烯效唑在甘薯和土壤中的定量限以最小添加濃度表示，均為0.002 mg/kg。烯效唑在溶劑、甘薯空白基質(zhì)和土壤空白基質(zhì)中的色譜圖見圖2、圖3和圖4。由圖2、圖3和圖4可知，在該研究方法中，甘薯和土壤中各濃度烯效唑的色譜峰均能較好地與基線分離，可以滿足甘薯和土壤中烯效唑殘留分析檢測的要求。

3 討論與結(jié)論

該研究通過改良的QuEChERS方法提取甘薯和土壤中的烯效唑，在提取溶劑乙腈中加入乙酸，提高了提取效率。質(zhì)譜技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測，但農(nóng)產(chǎn)品的復(fù)雜基質(zhì)會對化合物在質(zhì)譜中的響應(yīng)產(chǎn)生干擾，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確度，因此在農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留檢測中應(yīng)考慮基質(zhì)效應(yīng)[17]。經(jīng)分散固相凈化劑C18凈化處理后，烯效唑在甘薯和土壤中的基質(zhì)效應(yīng)分別為5.5%和6.2%，屬于弱基質(zhì)效應(yīng)，表明甘薯和土壤提取液經(jīng)過凈化后，均可以消除大部分基質(zhì)雜質(zhì)的干擾。此外，烯效唑在0.000 5～1.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.995 1～0.995 9，這表明該研究建立的甘薯和土壤中烯效唑殘留的分析方法能滿足農(nóng)藥殘留分析所要求的準(zhǔn)確度。在0.002、0.02、0.2 mg/kg這3個添加水平下，烯效唑在甘薯和土壤中的平均回收率為90.3%～106.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%～3.6%，方法定量限均為0.002 mg/kg?？傮w而言，該研究建立了檢測甘薯和土壤中的烯效唑殘留的QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，該方法前處理操作簡單，方法靈敏度高，各種性能指標(biāo)符合農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則的相關(guān)要求，具備了較高的檢測精度和檢測通量，可為評估烯效唑在甘薯中應(yīng)用的安全性提供技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王欣，李強，曹清河，等. 中國甘薯產(chǎn)業(yè)和種業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與未來展望[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，54（3）：483-492.

[2] RADEMACHER W. GROWTH RETARDANTS：effects on gibberellin biosynthesis and other metabolic pathways[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，2000，51：501-531.

[3] 汪寶卿，解備濤，王慶美，等. 甘薯內(nèi)源激素和化學(xué)調(diào)控研究進展[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，42（1）：51-56，62.

[4] 胡啟國，劉亞軍，王文靜，等. 烯效唑?qū)Ω适懋a(chǎn)量和生長發(fā)育的影響[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（8）：1299-1301，1395.

[5] 解備濤，王慶美，張海燕，等. 植物生長調(diào)節(jié)劑對甘薯產(chǎn)量和激素含量的影響[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，2016，31（1）：155-161.