白魯源 孫光碧 楊麗 王貞麗

［摘要］ 目的

探討柴芍六君子湯（CLD）治療酒精性肝損傷（alconholic liver damage， ALD）的作用及機制。

方法 雄性C57BL/6小鼠50只，隨機分為對照組（A組）、模型組（B組）、CLD低劑量組（C組）、CLD中劑量組（D組）、CLD高劑量組（E組），B～E組小鼠每天灌胃體積分數(shù)0.56的乙醇溶液（6 g/kg），同時C～E組小鼠再分別每天灌胃2.5、5、10 g/kg CLD，A組小鼠每天灌胃相同體積生理鹽水，連續(xù)灌胃15 d，每5 d測量一次小鼠體質(zhì)量。實驗結(jié)束后，留取各組小鼠新鮮糞便，梯度稀釋后平板培養(yǎng)分析糞便中腸道菌群的組成；小鼠麻醉后眼球取血檢測各組小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、γ-轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（T-BIL）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）含量；處死小鼠后剝離肝臟并計算肝臟指數(shù)；對肝組織切片行蘇木素-伊紅（HE）染色進行病理學分析。

結(jié)果 第15天時，與B組相比，C、E組小鼠體質(zhì)量明顯升高（q=4.217～7.573，P<0.05），E組小鼠肝臟指數(shù)明顯降低（q=4.997，P<0.05）。與B組相比，C～E組小鼠血清中ALT、AST、γ-GT、ALP、T-BIL、TG的水平均呈劑量依賴性降低（q=4.705～19.790，P<0.05），血清TC水平比較無顯著差異（P＞0.05）。肝組織病理學分析結(jié)果顯示，與B組相比，C～E組小鼠肝臟病理損傷減輕。腸道菌群檢測結(jié)果顯示，與B組相比，D組和E組小鼠腸道腸桿菌、腸球菌豐度明顯降低（q=7.209～11.730，P<0.05），乳酸桿菌、雙歧桿菌的豐度明顯升高（q=4.811～23.470，P<0.05），E組小鼠腸道類桿菌豐度與B組相比顯著升高（q=4.651，P<0.05）。

結(jié)論 CLD能有效調(diào)節(jié)ALD小鼠腸道菌群，改善小鼠肝功能，對小鼠ALD具有治療作用。

［關鍵詞］ 柴芍六君子湯；肝疾病，酒精性；肝功能試驗；胃腸道微生物組；小鼠；近交C57BL

［中圖分類號］ R575;R286.5??? ［文獻標志碼］ A

酒精性肝損傷（alcoholic liver damage，ALD）是由于長期大量飲酒導致的肝臟疾病，后續(xù)可發(fā)展成為肝炎、肝纖維化、肝衰竭甚至肝癌等一系列肝病，已成為人類健康的嚴重威脅之一[1-2]。因此，迫切需要尋找一種有效的治療方法，以降低ALD患者的病情進展的速度。臨床實踐表明，腸道菌群失衡在ALD發(fā)生機制中具有重要作用[3-4]。

據(jù)《醫(yī)宗金鑒》記載，柴胡、半夏、甘草、白術(shù)、鉤藤、黨參、陳皮、白芍、茯苓等藥材為柴芍六君子湯（CLD）組方，該方劑用于健脾平肝、化痰祛風[5]，是中國傳統(tǒng)中藥治療肝病的經(jīng)典藥方之一[6]?，F(xiàn)代中醫(yī)藥把腸道菌群的失衡當作治療ALD的一個重要方向，但目前尚未有CLD調(diào)節(jié)腸道菌群治療ALD的報道。本研究通過觀察CLD對ALD小鼠肝臟功能的改善作用和腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，探討CLD在治療ALD方面的效果，以期能為ALD的治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SPF級C57BL/6小鼠共50只，體質(zhì)量（20±2）g，購自于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；生產(chǎn)許可證編號：SCXK（京）2022-0013，合格證編號：211002300047215；飼養(yǎng)于溫度（25±2）℃，濕度（50±10）%，12 h光暗循環(huán)環(huán)境中。

1.2 藥物與試劑

體積分數(shù)0.56的乙醇溶液購于北京紅星股份有限公司；蘇木素-伊紅（HE）（貨號G1120）染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；柴胡、半夏、甘草、白術(shù)、鉤藤、黨參、陳皮、白芍以及茯苓購于青島大學附屬醫(yī)院藥劑科（批號：SYKGQDYXGS，上藥控股青島有限公司）；乙醚購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 藥物配制

柴胡、半夏、甘草、白術(shù)、鉤藤、黨參、陳皮、白芍、茯苓，按照古方比例準確稱取共250 g。以上藥物冷水浸泡40 min后，武火加熱沸騰10 min后，再文火熬煮30 min，取藥液；如法再煎煮一次，合并兩次藥液后，濃縮至1 g/mL，4 ℃下保存，用前復溫至37 ℃。

1.4 動物分組與處理

C57BL/6小鼠隨機分為對照組（A組）、模型組（B組）、CLD低、中、高劑量組（C～E組），每組10只。每日10：00，B～E組小鼠灌胃體積分數(shù)0.56的乙醇溶液（6 g/kg）[7]，A組小鼠灌胃等量生理鹽水；每日16：00，C～E組小鼠分別灌胃2.5、5、10 g/kg CLD，A、B組小鼠灌胃等量生理鹽水。各組小鼠均連續(xù)灌胃15 d，期間觀察各組小鼠的毛色、攝食及活動情況等，每5 d測量一次體質(zhì)量。

灌胃第15天，測量體質(zhì)量后，抓取小鼠輕輕擠壓其下腹部迫使小鼠排便，收集3～6顆糞便顆粒于無菌EP管中，4 ℃下保存?zhèn)溆谩８鹘M小鼠乙醚麻醉后，摘除眼球取血，室溫靜置1 h以后，4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，取血清，－20 ℃保存?zhèn)溆?。隨后斷頸處死小鼠，剝離小鼠肝臟組織并測量肝臟質(zhì)量，計算肝臟指數(shù)，保存肝臟備用。

1.5 血清生化指標檢測

依照試劑盒說明書操作，使用B200V全自動生化分析儀（南京英諾華科技有限公司）檢測各組小鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、γ-轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（T-BIL）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）含量。

1.6 小鼠肝臟組織HE染色及觀察

取各組小鼠肝臟組織于4%多聚甲醛中固定72 h，依次行乙醇梯度脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片，按照試劑盒說明書對切片進行HE染色，光學顯微鏡下觀察并拍照[8]。

1.7 腸道菌群檢測

分別取各組的每只小鼠糞便0.5 g，置于裝有玻璃珠的無菌小瓶內(nèi)加0.01 mol/L PBS（pH 7.2）4.5 mL稀釋，于振蕩器上振蕩20 min，當小鼠糞便均質(zhì)化后，配置成終濃度10 g/L的母液，設定為10-1。根據(jù)預實驗結(jié)果，用PBS對母液進行10倍梯度稀釋，將濃度為10-3的糞便稀釋液0.1 mL接種于腸桿菌培養(yǎng)基（EMS培養(yǎng)基），10-4的糞便稀釋液0.1 mL接種于腸球菌培養(yǎng)基（疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂），10-4的糞便稀釋液0.1 mL接種于類桿菌培養(yǎng)基（BDS培養(yǎng)基），10-5的糞便稀釋液0.1 mL接種于乳酸桿菌培養(yǎng)基（LBS培養(yǎng)基），10-5的糞便稀釋液0.1 mL接種于雙歧桿菌培養(yǎng)基（BBL培養(yǎng)基）。然后將上述培養(yǎng)基分別放置于37 ℃恒溫箱中，需氧培養(yǎng)48 h或厭氧培養(yǎng)48～72 h后。用菌落形態(tài)比較、革蘭染色鏡檢等方法對所生長出的菌落進行鑒定，確定為目標菌后進行菌落計數(shù)，計算菌含量（CFU/g），CFU/g=每一稀釋度平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×100，結(jié)果以對數(shù)值lgCFU·g-1表示。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以[AKx-D]±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用t檢驗，重復測量設計采用雙因素方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)? 果

2.1 CLD對ALD小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

灌胃期間對各組小鼠的一般情況進行觀察，A組小鼠毛發(fā)有光澤，活動敏捷，食欲良好；B組小鼠灌胃第5天時開始出現(xiàn)食欲不振、畏寒和毛發(fā)枯槁等情況；C～E組小鼠毛發(fā)黑亮，精神狀態(tài)與活動均正常。重復測量設計的方差分析結(jié)果顯示，分組、時間、分組與時間交互對各組小鼠體質(zhì)量具有顯著影響（F時間=17.510，F(xiàn)組間=10.220，F(xiàn)交互=2.365，P<0.05）。單獨效應結(jié)果顯示，組內(nèi)比較，A、E組小鼠各時間點體質(zhì)量均無明顯差異（P＞0.05），B、C、D組小鼠第10、15天與第0、5天相比體質(zhì)量明顯降低（q=3.872～6.604，P<0.05），組間比較，第0、5天時各組小鼠體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05）；第10天時，B、D組與A、E組相比體質(zhì)量均明顯降低（q=6.346～6.561，P<0.05），其余各組間體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05）；第15天時，B、D組與A組相比體質(zhì)量明顯降低（q=5.550～7.788，P<0.05），C、E組與B組相比、E組與D組相比體質(zhì)量明顯升高（q=4.217～7.573，P<0.05），其余各組間體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05）。見圖1。

實驗第15天時A～E組小鼠肝臟指數(shù)分別為4.49±0.67、5.81±1.02、5.11±0.93、4.76±0.80、4.48±0.74，各組間比較差異有顯著性（F=4.347，P<0.05）；兩兩比較結(jié)果顯示，B組與A、E組相比，小鼠肝臟指數(shù)均有明顯升高（q=4.960～4.997，P<0.05），其余各組兩兩比較均無明顯差異（P＞0.05）。

2.2 CLD對ALD小鼠肝功能的影響

各組小鼠血清當中的ALT、AST、γ-GT、ALP、T-BIL、TG、TC水平比較差異均具有顯著性（F=5.226～138.600，P<0.05），其中與A組相比，B組小鼠血清中ALT、AST、γ-GT、ALP、T-BIL、TG水平均顯著增高（q=9.361～20.530，P<0.05），血清中TC水平比較無顯著差異（P＞0.05）。與B組相比，C～E組小鼠血清中的ALT、AST、γ-GT、ALP、T-BIL、TG的水平呈劑量依賴性降低（q=4.705～19.790，P<0.05），血清中TC水平比較無顯著差異（P＞0.05）。見表1。

2.3 CLD對ALD小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果顯示，A組肝組織肝細胞以中央靜脈為中心單行排列成板狀結(jié)構(gòu)，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，未見炎性浸潤。B組小鼠肝細胞間出現(xiàn)不規(guī)則空泡，肝竇充血，可見炎性浸潤。與B組相比，C～E組小鼠脂肪空泡和炎性浸潤明顯減少，肝竇充血明顯緩解，肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，其中E組與A組肝臟形態(tài)接近一致。見圖2。

2.4 CLD對ALD小鼠腸道菌群的影響

各組小鼠腸桿菌、腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、類桿菌豐度比較差異均具有顯著性（F=5.059～115.400，P<0.05）；兩兩比較結(jié)果顯示，與A組相比，B組小鼠腸桿菌、腸球菌的豐度均顯著升高（q=10.870、11.190，P<0.05），乳桿菌、雙歧桿菌以及類桿菌的豐度均顯著降低（q=5.009～20.700，P<0.05）；與B組相比，D組和E組腸桿菌、腸球菌的豐度均呈劑量依賴性降低（q=7.209～11.730，P<0.05），乳酸桿菌、雙歧桿菌的豐度均呈劑量依賴性地升高（q=4.811～23.470，P<0.05），E組小鼠腸道類桿菌的豐度與B組相比顯著升高（q=4.651，P<0.05）。見表2。

3 討? 論

肝臟是人體的重要臟器，具有代謝、解毒等重要功能，肝臟損傷主要與氧化應激、感染、微循環(huán)障礙、細胞凋亡等有關[9-10]。ALD的主要干預措施為戒酒聯(lián)合藥物治療，截至目前仍缺乏有效的防治手段。隨著ALD藥物治療的發(fā)展，越來越多的藥物應用于臨床治療，然而藥物副作用常導致肝細胞損傷和腸道菌群紊亂，進一步引起肝功能損傷[11]。因此，尋求新的防治藥物成為抗肝病藥物治療的關鍵。中藥復方治療肝損傷在中國已經(jīng)有上千年的歷史，近年來研究顯示，中藥復方治療ALD具有效果明顯、作用靶點多、副作用少等優(yōu)勢，具有保肝降酶、促進肝細胞再生等作用[12-13]，應用前景廣闊，是近年來研究的熱點之一。

CLD方劑中黨參、白術(shù)、茯苓、甘草可健脾益氣滲濕；柴胡、白芍配伍疏肝柔肝，斂陰合營；陳皮、半夏配伍降逆和胃，重在理氣[14]。研究顯示，CLD可降低慢性乙型肝炎患者血清ALT、ALP、TG、TC水平，有改善肝臟功能的效果[15-16]。王軍義[17]研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合CLD和抗病毒藥物治療慢性乙型肝炎患者，治療組總有效率大于90%。鐘銳[18]采用CLD治療慢性乙肝肝纖維化患者，相較于對照組，治療組的臨床有效率更高，肝功能指標、細胞因子譜等各項生化指標較治療前都具有明顯改善。肝臟作為酒精代謝的主要場所，過量的酒精攝入可導致肝組織損傷，肝細胞膜通透性增加，釋放AST、ALT、ALP入血，因此血液中ALT、AST、ALP水平升高是肝細胞損傷的特征性表現(xiàn)[19]。此外，肝臟也是脂質(zhì)代謝的重要器官，在TG、TC等脂質(zhì)物質(zhì)的生物合成以及脂質(zhì)的轉(zhuǎn)化與排泄等過程中發(fā)揮重要作用[20]。酒精引起肝細胞功能受損，影響線粒體脂肪酸-β氧化，血脂、脂蛋白及載脂蛋白的合成、轉(zhuǎn)運、代謝等過程紊亂，使脂肪在血液和肝細胞內(nèi)沉積，導致血液中TG、TC明顯升高[21]。本研究使用酒精誘導小鼠肝損傷后，與對照組比較，小鼠一般狀態(tài)變差，體質(zhì)量下降，肝臟功能指標ALT、AST、ALP以及T-BIL水平均顯著增高，血脂水平指標TG升高，肝臟組織肝細胞排列紊亂，有不規(guī)則脂肪空泡產(chǎn)生，肝血竇充血和炎性細胞浸潤，表明肝臟組織呈病理損傷狀態(tài)。CLD各劑量組與模型組比較，肝功能指標劑量依賴性恢復正常，血脂水平降低，表明CLD對ALD具有治療作用。

腸道菌群以一定的組成規(guī)律分布在腸道，維持腸內(nèi)微生態(tài)平衡[22]。然而長期飲酒會影響腸道菌群組成和分布，且損傷腸黏膜，有益菌減少而有害菌增多，產(chǎn)生大量內(nèi)毒素等有害物質(zhì)，這些物質(zhì)隨門靜脈進入肝臟，最終造成肝臟損傷[23-25]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，以CLD不同劑量治療后，小鼠腸道的有益菌乳酸桿菌、雙歧桿菌和類桿菌豐度顯著升高，而致病菌腸桿菌、腸球菌豐度顯著降低。說明CLD對小鼠ALD的治療作用與腸道中條件致病菌相對豐度降低及有益菌相對豐度升高有關。

基于腸道菌群結(jié)構(gòu)復雜、功能多樣的特點，本研究只對豐度較高的腸道有益菌和有害菌的代表性物種進行了初步分析，其他大部分菌群還有待進一步的檢測與分析?；诟咄繙y序技術(shù)對ALD小鼠腸道菌群的深度分析，將對CLD的作用機制提供更豐富的數(shù)據(jù)支持，也是下一步的研究方向之一。

綜上，CLD可顯著改善酒精引起的小鼠肝臟功能的損傷，其機制可能與調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)紊亂有關。本研究結(jié)果提示CLD在治療ALD上有潛在應用價值，為中藥復方應用于臨床防治ALD提供了新的思路和參考，值得進一步的深入研究。

倫理批準和動物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學醫(yī)學部倫理委員會的審核批準（文件號QDU-AEC-202401-1）。所有實驗過程均遵照科技部《實驗動物管理條例》進行。

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