李雙 宋欣穎 劉春艷 李冰

［摘要］ 目的

探討B(tài)cl-2相關抗凋亡基因3（BAG3）對非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）細胞增殖和遷移能力的影響。

方法 通過查詢并整理TCGA數據庫，對不同腫瘤中的BAG3表達進行泛癌分析。通過蛋白免疫印跡實驗檢測NSCLC細胞系（H1299、A549、H460、Anip973、PC9、H358和95-D細胞）以及人正常肺上皮細胞系Beas-2B中BAG3蛋白的相對表達量。H1299細胞分別轉染Flag（A組）、Flag-BAG3質粒（B組），A549細胞分別轉染siControl（C組）和siBAG3（D組）。通過蛋白免疫印跡實驗檢測質粒和小干擾RNA轉染效率；采用CCK-8和平板克隆實驗檢測BAG3對NSCLC細胞增殖能力的影響；采用細胞劃痕和Transwell實驗檢測BAG3對NSCLC細胞遷移能力的影響。

結果 BAG3 mRNA在6種腫瘤中的表達均高于正常組織（t=8.45～24.13，P<0.05）。各NSCLC細胞系中BAG3的表達水平均明顯高于Beas-2B細胞（t=5.76～15.34，P<0.05）。相比于A組，B組細胞中BAG3蛋白的表達水平顯著升高（t=6.01，P<0.05）；相比于C組，D組細胞中BAG3的蛋白水平明顯降低（t=4.59，P<0.05）；相比于A組，B組細胞增殖和遷移能力明顯增強（t=5.12～17.10，P<0.05）；相比于C組，D組細胞增殖和遷移能力明顯下降（t=6.26～14.13，P<0.05）。

結論 BAG3在NSCLC組織和細胞中高表達，并可促進NSCLC細胞的增殖和遷移。

［關鍵詞］ 癌，非小細胞肺；凋亡調節(jié)蛋白質類；細胞增殖；細胞運動

［中圖分類號］ R747.2??? ［文獻標志碼］ A

研究顯示，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），作為肺癌的主要類型，其發(fā)病率占肺癌患者的80%～85%[1]。大多數NSCLC患者在確診時已處于晚期，手術與放療效果不佳，化療成為其重要的治療手段[2-3]，由于NSCLC患者的死亡率高，預后差，非常需要探索新的、更有效的治療方法。

NSCLC發(fā)生的基礎是細胞過度增殖和細胞凋亡抑制[4]。Bcl-2相關抗凋亡基因3（BAG3）蛋白是一種分子伴侶蛋白，在細胞應激、凋亡調控及信號轉導等多個生物學過程中扮演著不可或缺的角色，其功能的多樣性使BAG3在細胞生存與死亡的平衡中發(fā)揮著至關重要的作用[5-6]。BAG3作為一種分泌蛋白，能夠通過腫瘤微環(huán)境促進腫瘤生長[7-8]。BAG3在乳腺癌、卵巢癌或胰腺癌等多種人類腫瘤組織中表達上調[9–11]。然而，BAG3在NSCLC細胞中的表達水平及其在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用還不明確。本研究通過分析BAG3蛋白在NSCLC細胞中的相對表達水平，同時選取H1299和A549細胞對BAG3進行過表達和敲降處理，探究BAG3在NSCLC細胞增殖與遷移中的作用及其機制，旨在為NSCLC患者的臨床靶向治療提供新的靶點，以提高患者的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人正常肺上皮細胞系Beas-2B、NSCLC細胞系H460細胞及95-D細胞由山東大學生物化學與分子生物學系實驗室提供，NSCLC細胞系H1299、Anip973、PC9購買于上海吉凱生物技術有限公司，NSCLC細胞系A549和H358細胞由青島大學病理學系實驗室提供。過表達質粒Flag-BAG3及其空載體購自上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司，干擾BAG3的siRNA及其對照購自上海吉瑪制藥技術有限公司。Lipofectamine 2000購買于美國Invitrogen公司，細胞總蛋白提取試劑（RIPA）購自上海碧云天生物技術有限公司，BAG3抗體、GAPDH抗體購自英國Abcam公司，二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司，PVDF膜購自德國默克密理博公司，ECL顯色試劑盒購自美國GlpBio公司，Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 研究方法

1.2.1 BAG3基因的泛癌分析 在TCGA數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov）中下載33種腫瘤的RNAseq數據，再轉換成TPM格式，使用R包中的ggplot2[3.3.6]、stats[4.2.1]、car[3.1-0]對數據進行統計分析，通過繪制箱線圖分析BAG3基因在各種腫瘤組織中的相對表達量。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將Beas-2B細胞以及H1299、A549、H460、Anip973、PC9、H358和95-D細胞分別接種于含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，隨后在溫度37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)。當細胞生長密度達到80%～90%時，用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞轉染 將H1299細胞分為A、B組，A549細胞分為C、D組，分別接種于6孔板中，按照上述方法進行培養(yǎng)。當H1299細胞密度達80%～90%時，A549細胞密度達50%～60%時，將原培養(yǎng)基替換為無血清且不含有抗生素的培養(yǎng)基，接著加入預先配置好的轉染混合體系（由質?；蛘咝「蓴_RNA、Lipofectamine 2000、Opti-MEM配制而成），H1299細胞分別轉染Flag（A組）、Flag-BAG3質粒（B組），A549細胞分別轉染siControl（C組）以及siBAG3（D組），繼續(xù)培養(yǎng)6 h，然后更換原培養(yǎng)基為富含血清并添加雙抗的培養(yǎng)基。

1.2.4 Western blot實驗檢測細胞中BAG3蛋白表達水平 取生長密度約達90%的H1299、A549、H460、Anip973、PC9、H358、95-D、Beas-2B細胞，以及轉染后的A～D組細胞，分別加入蛋白酶抑制劑和蛋白質裂解液RIPA的混合液裂解細胞，提取細胞總蛋白。利用Bradford方法測定蛋白的濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液后高溫變性處理6 min，蛋白樣品在10% SDS-PAGE凝膠上分離以后，轉移到0.45 μm的PVDF膜上。在含有5%脫脂奶粉的TBST中封閉1 h后，將膜置于對應的一抗中，4 ℃下冰箱孵育過夜。加入與一抗匹配的二抗，室溫震蕩1 h，使用ECL化學發(fā)光試劑盒鑒定免疫反應條帶。使用Image J軟件分析條帶的灰度值，目標蛋白的相對表達量=蛋白顯色的灰度值/內參蛋白的灰度值。實驗重復3次，結果取均值。

1.2.5 CCK-8實驗檢測細胞活力率 取轉染后的A～D組細胞，經胰酶消化后，使用細胞計數法對細胞進行計數后，按照每孔2 000個細胞接種至96孔板中，每組設置5個復孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在A、B組細胞分別于培養(yǎng)第48、72小時時，C、D組細胞分別于培養(yǎng)第72、96小時時，每孔加入CCK-8試劑10 μL，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h。后使用酶標儀檢測450 nm波長處各孔吸光度（A）值，計算細胞活力率。細胞活力率=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100%，其中As=實驗孔（含有細胞、培養(yǎng)基、CCK-8和待測物）的吸光度值，Ab=空白孔（含有培養(yǎng)基和CCK-8）吸光度值，Ac=對照孔（含有細胞、培養(yǎng)基和CCK-8）的吸光度值。

1.2.6 平板克隆實驗檢測細胞增殖能力 取轉染后的A～D組細胞，通過胰酶消化并將細胞完全懸浮于完全培養(yǎng)基中，然后用細胞計數法將每孔約1 000個細胞接種到6孔板中。將6孔板置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約10 d，期間每3 d更換一次培養(yǎng)基并觀察細胞狀態(tài)，當多數單克隆細胞中的細胞數量超過50個時，用甲醇固定孔內細胞15～20 min，然后去除固定液，加入0.1%結晶紫染色2 h，最后用PBS洗滌平板并進行拍照，使用Image J軟件對細胞克隆形成進行計數。

1.2.7 細胞劃痕和Transwell實驗檢測NSCLC細胞系的遷移能力 取轉染后的A～D組細胞，用胰蛋白酶消化細胞并重懸于完全培養(yǎng)基中，吹打均勻，然后按照適當的細胞密度接種到6孔板中，第2天，當細胞密度達到約90%時進行劃痕。用200 μL的無菌槍頭沿著直尺垂直在6孔板底部劃出每孔大致相同寬度的劃痕，然后用PBS輕輕洗滌孔里細胞，加入2 mL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞，在劃痕后的第0、24、48小時觀察細胞并用顯微鏡拍照。使用Image J軟件計算細胞劃痕面積，并計算細胞遷移率。細胞遷移率=（初始劃痕面積-最終劃痕面積）/初始劃痕面積×100%。實驗重復3次，結果取均值。

取轉染后的A～D組細胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓12 h。胰蛋白酶消化細胞后，重新懸浮細胞，密度調整為1×104/mL。在小室中加入100 μL無血清培養(yǎng)基置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h后，在下室和上室分別加入700 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基和200 μL的細胞懸液。置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，用PBS清洗小室后在孔中加入甲醇溶液進行固定，然后加入0.1%的結晶紫染色0.5 h，用PBS洗滌小室3次后，在普通倒置顯微鏡下觀察遷移細胞，評估細胞遷移行為的變化，使用Image J軟件計數細胞。實驗重復3次，結果取均值。

2 結? 果

2.1 BAG3基因的泛癌分析

在TCGA數據庫對BAG3 mRNA在33種腫瘤中的表達水平進行分析，結果顯示，與正常組織相比，BAG3在12種腫瘤組織中的表達差異有顯著性，其中在非小細胞肺癌、結直腸癌、肝細胞肝癌、嗜鉻細胞瘤和副神經節(jié)瘤、甲狀腺癌的腫瘤組織中BAG3顯著高表達（t=8.45～24.13，P<0.05），在腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、膀胱尿路上皮癌、腎嫌色細胞癌、子宮內膜癌以及前列腺癌組織中BAG3顯著低表達（t=6.98～18.86，P<0.05）。

2.2 人正常肺上皮細胞及NSCLC細胞系中BAG3蛋白相對表達量比較

Western Blot實驗結果顯示，人正常肺上皮細胞Beas-2B及NSCLC細胞系H1299、A549、H460、Anip973、PC9、H358和95-D細胞中BAG3蛋白的相對表達量分別為0.27±0.01、0.84±0.05、1.23±0.04、0.32±0.03、0.72±0.01、0.51±0.02、0.64±0.01、1.09±0.03，其中NSCLC細胞系各細胞當中BAG3蛋白的相對表達量均顯著高于Beas-2B細胞（t=5.76～15.34，P<0.05）。 見圖1。

2.3 A～D組細胞中BAG3蛋白相對表達量比較

Western blot實驗檢測結果顯示，A、B組細胞中BAG3蛋白相對表達量分別為0.56±0.05以及1.37±0.02，B組顯著高于A組（t=6.01，P<0.05）；C組、D組細胞中BAG3蛋白的相對表達量分別為0.98±0.03、0.35±0.02，D組顯著低于C組（t=4.59，P<0.05）。見圖2。

2.4 A～D組細胞中NSCLC細胞增殖能力的比較

CCK-8實驗表明，A、B組細胞培養(yǎng)第48小時時細胞活力率分別為（100.0±0.8）%、（180.7±10.2）%，兩組比較差異具有顯著性（t=13.65，P<0.05）；培養(yǎng)第72小時時兩組細胞活力率分別為（100.0±1.7）%、（122.9±1.5）%，兩組比較差異具有顯著性（t=17.10，P<0.05）。C、D組細胞培養(yǎng)至第72小時時細胞活力率分別為（110.3±14.1）%、（40.8±1.6）%，兩組比較差異具有顯著性（t=8.47，P<0.05）；C、D組培養(yǎng)第96小時時后細胞活力率分別為（100.0±4.9）%、（48.7±3.9）%，兩組比較差異具有顯著性（t=14.13，P<0.05）。

平板克隆實驗結果顯示，A、B組細胞的克隆形成數目則分別為（180.3±14.5）、（288.0±19.3）個，兩組比較差異具有顯著性（t=7.72，P<0.05）；C、D組細胞的克隆形成數目則分別為（360.7±48.4）、（152.3±10.8）個，兩組比較差異具有顯著意義（t=6.26，P<0.05）。見圖3。

2.5 A～D組細胞中NSCLC細胞遷移率的比較

細胞劃痕實驗結果顯示，A、B組細胞培養(yǎng)第24小時時遷移率分別為（27.17±4.15）%、（45.20±4.50）%，兩組比較差異具有顯著性（t=5.12，P<0.05）；培養(yǎng)第48小時時遷移率分別為（39.39±1.40）%、（70.37±3.49）%，兩組比較差異有顯著性（t=14.27，P<0.05）。C、D組細胞培養(yǎng)至第24小時時的遷移率分別為（24.34±2.29）%、（9.22±2.46）%，兩組比較差異具有顯著性（t=7.79，P<0.05）；培養(yǎng)第48小時時遷移率分別為（41.88±3.56）%、（22.64±1.23）%，兩組比較差異有顯著性（t=8.83，P<0.05）。見圖4。

Tranwell實驗結果顯示，A組、B組細胞從小室上層穿過至下層的數目分別為（543.70±33.08）、（818.70±30.44）個，兩組比較差異有顯著性（t=10.60，P<0.05）；C、D組細胞從小室上層穿至下層的數目分別為（905.70±77.68）、（425.50±46.51）個，兩組相比較差異有顯著性（t=6.78，P<0.05）。見圖5。

3 討? 論

NSCLC是一種高度侵襲性的腫瘤，其發(fā)生和進展可能是由多個基因的過度表達/過度激活或突變/功能喪失所致[12-13]。基因突變會影響細胞增殖、程序性細胞死亡（細胞凋亡）和DNA修復等細胞正常功能，隨著細胞損傷積累的越多，NSCLC的微環(huán)境會發(fā)生缺氧和低pH、低代謝產物水平情況，致腫瘤發(fā)生的風險增高[14]。由于NSCLC早期臨床表現較為隱匿，高達75%的NSCLC患者在確診時已進入晚期階段。同時NSCLC患者在使用分子靶向治療藥物過程中具有耐藥性，為NSCLC患者的治療帶來了挑戰(zhàn)[15]。靶向治療藥物在癌癥治療中發(fā)揮著關鍵作用，它們通過精準作用于腫瘤特定的基因和蛋白質，實現對腫瘤生長和擴散的有效抑制或阻斷，進而達到治療的目的[16]。NSCLC的靶向治療發(fā)展迅速，明確的分子靶標加快了藥物上市的腳步。因此，進一步深入研究NSCLC發(fā)生發(fā)展的機制會促進NSCLC靶向治療的進展。

BAG3是細胞存活的重要調節(jié)因子，具有抑制細胞凋亡的作用[17]。BAG3又是一個高度保守的基因，主要分布在細胞質中，同時BAG3作為BAG共伴侶家族擁有眾多結構域，具有多種蛋白理化特性和生物學功能[18]。BAG3通過參與蛋白酶體和自噬蛋白降解途徑，控制細胞內蛋白質的穩(wěn)定性和生命過程[19]。研究發(fā)現，BAG3與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[20]，對腫瘤的生長、遷移、侵襲具有促進作用，同時也會影響腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性[21-23]。如研究顯示，BAG3可以通過調控蛋白的穩(wěn)定性，促進卵巢癌干細胞對鉑類藥物的耐藥[21]；紫杉素與BAG3抑制劑聯合使用可以使肝細胞癌細胞死亡，由此表明兩者的聯合使用在HCC中是一種潛在抗腫瘤策略[22]。此外，在肺癌中，BAG3被抑制表達時可以減輕肺癌患者對順鉑的耐藥性[23]。但是，BAG3在NSCLC增殖和遷移中的作用尚不清楚。

本研究首先通過TCGA數據庫進行BAG3的泛癌分析，結果顯示，BAG3在非小細胞肺癌、結直腸癌、肝細胞肝癌、嗜鉻細胞瘤和副神經節(jié)瘤、甲狀腺癌的腫瘤組織中高表達，在腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、膀胱尿路上皮癌、腎嫌色細胞癌、子宮內膜癌腫瘤和前列腺癌組織中BAG3顯著低表達。之后采用Western blot實驗分析比較了BAG3在H1299、A549、H460、Anip973、PC9、H358、95-D這些NSCLC細胞系和人正常肺上皮細胞系Beas-2B細胞中的表達水平，結果顯示這7種NSCLC細胞系的BAG3蛋白相對表達量顯著高于人正常肺上皮細胞系Beas-2B細胞。在深入探究BAG3基因在NSCLC細胞中的具體作用機制時，本研究廣泛參考了相關領域的文獻，并基于本實驗室的特定條件和資源，選取了A549細胞進行BAG3基因的敲降實驗，選擇了H1299細胞進行BAG3基因的過表達研究，采用Western blot實驗以檢測這兩種細胞中BAG3蛋白的表達情況，結果顯示，過表達BAG3基因使B組細胞中BAG3蛋白的表達顯著升高，敲降BAG3基因使D組細胞中BAG3蛋白的表達顯著降低。CCK-8和平板克隆實驗結果顯示，與對照組細胞相比，過表達BAG3后H1299細胞增長加速，敲降BAG3后A549細胞增長減緩，提示BAG3可促進NSCLC細胞增殖。細胞劃痕和Transwell實驗結果發(fā)現，與對照組細胞相比，過表達BAG3后H1299細胞遷移的數目增多，敲降BAG3以后A549細胞遷移的數目減少，提示BAG3可以促進NSCLC細胞遷移。由此可以推測，BAG3基因是NSCLC細胞的促癌基因之一，與NSCLC的發(fā)生發(fā)展密切相關。

綜上所述，BAG3在NSCLC組織和細胞中高表達。過表達BAG3后H1299細胞增長加速，細胞的遷移能力也明顯增強；敲降BAG3后A549細胞增長減緩，其遷移能力也顯著降低。上述實驗結果提示BAG3可以促進NSCLC細胞增殖和遷移，為NSCLC的治療提供了新的思路和方向。然而，關于BAG3促進NSCLC發(fā)生和發(fā)展的具體分子機制，尚需進一步的深入研究和探討。

［參考文獻］

[1]GANTI A K， KLEIN A B， COTARLA I， et al. Update of incidence， prevalence， survival， and initial treatment in patients with non-small cell lung cancer in the US[J]. JAMA Oncol， 2021，7（12）：1824-1832.

[2]SPAGNOLO C C， CIAPPINA G， GIOVANNETTI E， et al. Targeting MET in non-small cell lung cancer （NSCLC）：A new old story？[J]. Int J Mol Sci， 2023，24（12）：10119.

[3]WEINSTEIN I B. Cancer. Addiction to oncogenes： The achilles heal of cancer[J]. Science， 2002，297（5578）：63-64.

[4]SHEN Y L， CAI H J， MA S J， et al. Telocinobufagin has antitumor effects in non-small-cell lung cancer by inhibiting STAT3 signaling[J]. J Nat Prod， 2022，85（4）：765-775.

[5]HUANG X Y， GUO J Y， NING A Q， et al. BAG3 promotes proliferation and migration of arterial smooth muscle cells by regulating STAT3 phosphorylation in diabetic vascular remodeling[J]. Cardiovasc Diabetol， 2024，23（1）：140.

[6]BEHL C. BAG3 and friends： Co-chaperones in selective autophagy during aging and disease[J]. Autophagy， 2011，7（7）：795-798.

[7]BEHL C. Breaking BAG： The co-chaperone BAG3 in health and disease[J]. Trends Pharmacol Sci， 2016，37（8）：672-688.

[8]BONELLI P， PETRELLA A， ROSATI A， et al. BAG3 protein regulates stress-induced apoptosis in normal and neoplastic leukocytes[J]. Leukemia， 2004，18（2）：358-360.

[9]ZHAO F Y， ZHANG Q， WANG J M， et al. BAG3 epigenetically regulates GALNT10 expression via WDR5 and facilitates the stem cell-like properties of platin-resistant ovarian cancer cells[J]. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res， 2021，1868（9）：119077.

[10]DE MARCO M， GAUTTIER V， PENGAM S， et al. Concerted BAG3 and SIRPα blockade impairs pancreatic tumor growth[J]. Cell Death Discov， 2022，8（1）：94.

[11]LIU B Q， ZHANG S， LI S， et al. BAG3 promotes stem cell-like phenotype in breast cancer by upregulation of CXCR4 via interaction with its transcript[J]. Cell Death Dis， 2017，8（7）：e2933.

[12]SKOULIDIS F， HEYMACH J V. Co-occurring genomic alterations in non-small-cell lung cancer biology and therapy[J]. Nat Rev Cancer， 2019，19（9）：495-509.

[13]FOIS S S， PALIOGIANNIS P， ZINELLU A， et al. Molecular epidemiology of the main druggable genetic alterations in non-small cell lung cancer[J]. Int J Mol Sci， 2021，22（2）：612.

[14]WU F Y， FAN J， HE Y Y， et al. Single-cell profiling of tumor heterogeneity and the microenvironment in advanced non-small cell lung cancer[J]. Nat Commun， 2021，12（1）：2540.

[15]GARON E B， HELLMANN M D， RIZVI N A， et al. Five-year overall survival for patients with advanced non-small-cell lung cancer treated with pembrolizumab： Results from the phase I KEYNOTE-001 study[J]. J Clin Oncol， 2019，37（28）：2518-2527.

[16]STINCHCOMBE T E. Current management of RET rearranged non-small cell lung cancer[J]. Ther Adv Med Oncol， 2020，12：1758835920928634.

[17]DE MARCO M， TURCO M C， MARZULLO L. BAG3 in tumor resistance to therapy[J]. Trends Cancer， 2020，6（12）：985-988.

[18]MARCO M D， FALCO A， IACCARINO R， et al. An emerging role for BAG3 in gynaecological malignancies[J]. Br J Cancer， 2021，125（6）：789-797.

[19]STRNER E， BEHL C. The role of the multifunctional BAG3 protein in cellular protein quality control and in disease[J]. Front Mol Neurosci， 2017，10：177.

[20]LINDER B， KLEIN C， HOFFMANN M E， et al. BAG3 is a negative regulator of ciliogenesis in glioblastoma and triple-negative breast cancer cells[J]. J Cell Biochem， 2022，123（1）：77-90.

[21]MARCO M D， BASILE A， IORIO V， et al. Role of BAG3 in cancer progression： A therapeutic opportunity[J]. Semin Cell Dev Biol， 2018，78：85-92.

[22]LU J， LIU S Y， ZHANG J， et al. Inhibition of BAG3 enhances the anticancer effect of shikonin in hepatocellular carcinoma[J]. Am J Cancer Res， 2021，11（7）：3575-3593.

[23]MARIOTTO E， VIOLA G， ZANON C， et al. A BAGs life： Every connection matters in cancer[J]. Pharmacol Ther， 2020，209：107498.