王子怡 毛華 金婷婷 張香凝 韓帥 梁永新

［摘要］ 目的

探究姜黃素對1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)的帕金森病（Parkinson disease，PD）模型小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。

方法 將72只雄性C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為Control組（A組）、MPTP組（B組）和MPTP＋姜黃素組（C組）。實(shí)驗(yàn)前5 d，B、C組小鼠每天腹腔注射MPTP 30 mg/kg，A組小鼠腹腔注射等量生理鹽水；第6天始，C組小鼠每天腹腔注射姜黃素（溶于DMSO）50 mg/kg，A、B組小鼠每天腹腔注射等量的DMSO，連續(xù)7 d。給藥結(jié)束后，采用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評估各組小鼠的運(yùn)動、學(xué)習(xí)和記憶力功能。實(shí)驗(yàn)第15天，取各組小鼠黑質(zhì)區(qū)，ELISA法檢測TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，蛋白印跡法檢測CD86和NF-κB的相對含量，熒光免疫組織化學(xué)染色檢測TH陽性神經(jīng)元的數(shù)量。

結(jié)果 與B組相比，A、C組小鼠的下降時(shí)間明顯減少，脫落潛伏期和交替百分比明顯增加（F=17.29～19.28，P<0.05），黑質(zhì)中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明顯減少（F=31.73～80.97，P<0.05），黑質(zhì)中CD86、NF-κB蛋白的表達(dá)明顯減少（F=24.93、55.61，P<0.05），黑質(zhì)中TH陽性神經(jīng)元的數(shù)量顯著增加（F=47.64，P<0.05）。

結(jié)論 姜黃素可有效改善PD模型小鼠的行為障礙，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號通路，致小膠質(zhì)細(xì)胞活化抑制、炎性反應(yīng)發(fā)生降低、多巴胺能神經(jīng)元退化減輕有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 帕金森病；疾病模型，動物；姜黃素；小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；NF-κB；神經(jīng)炎癥性疾??；神經(jīng)保護(hù)

［中圖分類號］ R742.5??? ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

帕金森?。≒arkinsons disease，PD）是一種常見的神經(jīng)變性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，PD患者黑質(zhì)中存在神經(jīng)炎癥，當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞過多分泌炎性因子時(shí)，易對多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生毒性，并最終致其發(fā)生進(jìn)行性死亡[1-2]。因此通過干預(yù)降低黑質(zhì)區(qū)促炎因子的水平，減緩PD患者神經(jīng)炎癥進(jìn)展，是目前比較有效治療措施之一。目前臨床主要使用的一線藥物有左旋多巴和多巴胺受體激動劑，但效果并不滿意，長期服用患者可產(chǎn)生耐藥性，甚至出現(xiàn)異動癥、妄想和焦慮等不良反應(yīng)[3]。姜黃素提取于姜黃的根莖，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等作用，而且毒副作用小[4-6]。本研究通過腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）構(gòu)建PD模型小鼠，觀察姜黃素對小鼠行為學(xué)習(xí)和記憶功能的影響，并進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，為PD患者的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

姜黃素購于美國Sigma公司，小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒均購于上海江萊生物有限公司，MPTP購于美國GLPBIO公司，兔抗CD86抗體、兔抗p-NF-κB p65抗體和GAPDH均購買于英國Abcam公司，抗酪氨酸羥化酶抗體購于美國CST公司。轉(zhuǎn)棒測試儀和Y迷宮全自動測試儀購于美國Med Associates公司。

1.2 動物分組與處理

健康成年雄性C57BL/6J小鼠72只購自斯貝福（北京）生物有限公司（No.11032422010540776-5），隨機(jī)分為Control組（A組）、MPTP組（B組）和MPTP＋姜黃素組（C組），每組24只。實(shí)驗(yàn)前5 d，B、C組小鼠每天腹腔注射MPTP 30 mg/kg，A組小鼠腹腔注射等量生理鹽水；第6天始，C組小鼠腹腔注射姜黃素（溶于DMSO）50 mg/kg，A、B組小鼠每天腹腔注射等量的DMSO，連續(xù)7 d[7]。

1.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評估各組小鼠的運(yùn)動、學(xué)習(xí)和記憶功能

1.3.1 爬桿實(shí)驗(yàn)[8] 實(shí)驗(yàn)第13天時(shí)，分別從各組小鼠中隨機(jī)選取8只，置于表面粗糙木桿頂部（直徑8 mm、高55 cm），測量小鼠自頂部至前爪到達(dá)地面的時(shí)間（下降時(shí)間）。每只小鼠隔30 min測量一次，連續(xù)測試3次，結(jié)果取平均值。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后均將小鼠放回。

1.3.2 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)[9] 爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，間隔6 h，分別從各組中再隨機(jī)選取8只小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)。將各組小鼠放置于轉(zhuǎn)棒測試儀的轉(zhuǎn)棒上，從4 r/min到40 r/min勻速調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)棒的速度，記錄脫落潛伏期（小鼠從轉(zhuǎn)棒上掉落的時(shí)間）。每只小鼠測試3次，每次測試的間隔時(shí)間大于30 min，結(jié)果取均值。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后均將小鼠放回。

1.3.3 Y迷宮實(shí)驗(yàn)[8] 實(shí)驗(yàn)第14天時(shí)，分別從各組中再隨機(jī)選取8只小鼠進(jìn)行Y迷宮實(shí)驗(yàn)。將各組小鼠放置在Y迷宮全自動測試儀的一臂末端，并允許其在每個(gè)臂上自由爬行。記錄小鼠8 min內(nèi)入臂次數(shù)（當(dāng)小鼠的后爪完全進(jìn)入其余任何手臂時(shí)，認(rèn)為完成一次入臂過程）和自發(fā)交替次數(shù)（小鼠依次進(jìn)入不同臂認(rèn)為完成一次交替）。交替百分比=[（自發(fā)交替次數(shù)）/（入臂次數(shù)－2）]×100%。

1.4 ELISA法檢測各組小鼠黑質(zhì)中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量

實(shí)驗(yàn)第15天時(shí)，將每組24只小鼠隨機(jī)分為3份，每份8只。隨機(jī)取其中的一份8只小鼠，以異氟烷吸入麻醉后處死，剝離出小鼠腦組織，用濃度0.01 mol/L的PBS（pH 7.4）沖洗后，分離出黑質(zhì)并測量其質(zhì)量后，按照1∶9比例（1 g腦組織對應(yīng)0.01 mol/L的PBS 9 mL）加入PBS溶液，置于冰上充分研磨、離心后，收集上清液。按照ELISA試劑盒的說明檢測黑質(zhì)中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.5 蛋白印跡法檢測各組小鼠黑質(zhì)中CD86以及NF-κB的相對含量

再隨機(jī)取其中的一份8只小鼠，以異氟烷吸入麻醉后處死，剝離出腦組織，用濃度0.01 mol/L的PBS（pH 7.4）沖洗后，分離出黑質(zhì)并測量其質(zhì)量后，取20 mg的黑質(zhì)組織依次加入400 μL的RIPA裂解液、4 μL 蛋白酶抑制劑和4 μL colktail后，置于冰上充分研磨、離心后，收集上清液。提取黑質(zhì)的蛋白樣本，樣本經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等操作后，分別與一抗抗CD86（1∶1 000）、抗p-NF-κB p65（1∶1 000）和抗GAPDH（1∶5 000）在4 ℃下孵育過夜。TBST沖洗3次后，將膜分別與相應(yīng)的二抗（1∶5 000）在37 ℃下孵育2 h。TBST沖洗3次后顯影，以Image J軟件分析條帶灰度值。

1.6 熒光免疫組織化學(xué)染色檢測各組小鼠黑質(zhì)中TH陽性神經(jīng)元數(shù)量

剩余的一份8只小鼠，以異氟烷吸入麻醉后處死，將腦組織經(jīng)過剝離、固定、脫水等操作后。參考小鼠腦圖譜[10]，將其沿冠狀面以10 μm厚進(jìn)行切片。選擇其中含有黑質(zhì)組織的切片，經(jīng)過沖洗、通透以及封閉等操作后。用抗酪氨酸羥化酶（TH）抗體（1∶200）孵育切片并于4 ℃下過夜。第2天用0.01 mol/L的PBS沖洗切片3次，共計(jì)15 min，以熒光二抗（綠色，1∶100）在室溫下孵育1 h。用BX53熒光顯微鏡和DP50數(shù)碼相機(jī)觀察并拍攝黑質(zhì)中TH陽性神經(jīng)元數(shù)目。

2 結(jié)? 果

2.1 姜黃素對各組小鼠運(yùn)動、學(xué)習(xí)以及記憶功能的影響

三組小鼠的下降時(shí)間、脫離潛伏期、交替百分比比較差異有顯著性（F=17.29～19.28，P<0.05），各組間兩兩比較，差異也均具有顯著意義（P<0.05）。見表1。

2.2 姜黃素對各組小鼠黑質(zhì)中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響

三組小鼠黑質(zhì)中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較差異均有顯著性（F=31.73～80.97，P<0.05），各組間兩兩比較，差異也均具有顯著意義（P<0.05）。見表2。

2.3 姜黃素對各組小鼠黑質(zhì)中CD86和NF-κB表達(dá)的影響

蛋白印跡法檢測結(jié)果顯示，A～C組小鼠黑質(zhì)中CD86蛋白的相對表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.78±0.33、1.37±0.17，p-NF-κB p65蛋白的相對表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.44±0.12、1.22±0.13。各組間上述指標(biāo)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.93、55.61，P<0.05），各組間兩兩比較，上述兩個(gè)指標(biāo)差異也均具有顯著性（P<0.05）。見圖1。

2.4 姜黃素對各組小鼠黑質(zhì)中TH陽性神經(jīng)元數(shù)量的影響

A～C組小鼠黑質(zhì)中TH陽性神經(jīng)元數(shù)目分別為（60.62±10.29）、（25.25±4.83）、（39.00±5.55）個(gè)，各組間比較差異有顯著性（F=47.64，P<0.05），各組間兩兩比較，差異均具有顯著意義（P<0.05）。見圖2。

3 討? 論

PD是一種多因素導(dǎo)致的以黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性死亡為特征的疾病。目前的治療方案不能有效阻止或減緩PD的神經(jīng)退行性病變[11]。因此，需要進(jìn)一步探索PD發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制，并找尋有效的治療藥物。大量研究表明，神經(jīng)炎癥參與PD的病理生理過程。在PD患者的大腦中，均發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及促炎因子的過度表達(dá)[12-14]。

姜黃素具有顯著的抗炎、抗氧化以及抗癌的特性[15-17]。最近的一些研究指出，姜黃素在PD、阿爾茲海默癥和多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，具有神經(jīng)保護(hù)作用[18-20]。另有研究顯示，姜黃素可以通過抑制NLRP3炎癥小體的活化，以及緩解Drp1介導(dǎo)的線粒體功能障礙，發(fā)揮對PD患者的神經(jīng)保護(hù)作用[21]。本研究采用MPTP構(gòu)建經(jīng)典PD模型小鼠，通過爬桿實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和Y迷宮實(shí)驗(yàn)，對小鼠的運(yùn)動、學(xué)習(xí)以及記憶功能進(jìn)行測試，結(jié)果表明，與MPTP組小鼠相比，經(jīng)姜黃素治療的PD模型小鼠，下降時(shí)間縮短、脫離潛伏期增加和交替百分比提高。提示姜黃素可有效改善PD模型小鼠的運(yùn)動、學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。雖然目前已經(jīng)有大量研究證實(shí)，姜黃素具有神經(jīng)保護(hù)作用，然而姜黃素治療PD的機(jī)制尚不清楚。

在本研究中，首先鑒定了姜黃素對促炎因子的影響，再進(jìn)一步研究其對MPTP誘導(dǎo)的小鼠黑質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞的作用。ELISA法檢測結(jié)果顯示姜黃素能夠減少黑質(zhì)中TNF-α、IL-1β和IL-6的過度釋放，驗(yàn)證了姜黃素對神經(jīng)炎癥的調(diào)控作用。蛋白印跡法結(jié)果表明，姜黃素可以抑制MPTP誘導(dǎo)的小鼠黑質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD86的表達(dá)，表明姜黃素可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。為了進(jìn)一步探討姜黃素調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活性的分子機(jī)制，本研究還采用蛋白印跡法檢測了小鼠黑質(zhì)中NF-κB通路相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)姜黃素抑制了MPTP誘導(dǎo)的小鼠黑質(zhì)中NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果表明姜黃素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞，減輕神經(jīng)炎癥可能通過調(diào)控細(xì)胞中NF-κB信號通路蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞可以促進(jìn)神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展。在黑質(zhì)中可使多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生退化，因此抑制黑質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，也許可以作為一種治療PD的方案[22]。小膠質(zhì)細(xì)胞長期持續(xù)活化，會分泌如TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子。研究發(fā)現(xiàn)PD患者血清、黑質(zhì)和腦脊液中的炎性因子濃度較正常人群明顯升高。TNF-α是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α主要由小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，也能激活小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6等炎癥因子，誘導(dǎo)黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的漸進(jìn)性喪失。IL介導(dǎo)了神經(jīng)炎癥的惡性循環(huán)過程，對炎癥起主導(dǎo)作用。當(dāng)過度激活I(lǐng)L-1β和IL-6時(shí)，就會引起膠質(zhì)細(xì)胞活化并對神經(jīng)元產(chǎn)生損傷[23]。此外，NF-κB是炎性細(xì)胞因子的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，NF-κB這一經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已被證明可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，抑制NF-κB的活化可以改善小鼠的運(yùn)動遲緩癥狀[24]。NF-κB的激活可增加小膠質(zhì)細(xì)胞對IL-6和IL-1β等促炎因子的釋放，并且在6-OHDA介導(dǎo)的PD動物模型中，NF-κB信號通路的活化參與黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的死亡過程[25]。

TH代表黑質(zhì)-紋狀體通道的初始階段。此通路為大腦中比較重要的多巴胺傳遞途徑，因此TH在多巴胺合成中發(fā)揮不可或缺的作用。TH作為多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)志物，其水平與多巴胺能神經(jīng)元的活性有關(guān)。黑質(zhì)中TH陽性神經(jīng)元的表達(dá)隨PD的發(fā)展進(jìn)行性減少，也是PD進(jìn)展的標(biāo)志[26]。本研究中姜黃素治療可顯著抑制MPTP誘導(dǎo)的小鼠黑質(zhì)中TH陽性神經(jīng)元的減少。這些結(jié)果證實(shí)姜黃素對PD具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，姜黃素可有效改善PD模型小鼠的運(yùn)動、學(xué)習(xí)、記憶障礙，降低黑質(zhì)中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，抑制黑質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減緩黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元退化，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制或與抑制NF-κB信號通路相關(guān)。本研究為姜黃素應(yīng)用于PD治療提供了理論和實(shí)驗(yàn)支持。

倫理批準(zhǔn)和動物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動物實(shí)驗(yàn)均已通過青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會的審核批準(zhǔn)（文件號QDU-AEC-2023116）。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》進(jìn)行。

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