董梓慧 馬青

摘 要 為了研究海藻酸寡糖對(duì)黃瓜灰霉病的防治效果及誘導(dǎo)抗病機(jī)理，以黃瓜感病品種3葉期植株為試材，通過(guò)盆栽試驗(yàn)、酶活測(cè)定法和實(shí)時(shí)熒光定量，測(cè)定接菌后0～48 h內(nèi)，黃瓜葉片的防御相關(guān)酶活性[超氧化物歧化酶（SOD）活性、氧化氫酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、氧化物酶（POD）活性]和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)量（茉莉酸途徑關(guān)鍵基因? JAR1和? EIN2；水楊酸途徑關(guān)鍵基因? NPR1和? PR1）。結(jié)果表明：①海藻酸寡糖的最佳誘導(dǎo)濃度為50 mg/L，誘導(dǎo)時(shí)間為3 d，防效可達(dá)66.75%；②防御相關(guān)酶的活性均顯著提高；③水楊酸途徑關(guān)鍵基因? NPR1和? PR1相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)?？梢姾Ｔ逅峁烟峭ㄟ^(guò)激發(fā)水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高植株體內(nèi)防御相關(guān)酶活，增加植株抗病性。

關(guān)鍵詞 海藻酸寡糖；誘導(dǎo)抗病性；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；防御相關(guān)酶活

灰霉病是設(shè)施黃瓜的重要病害，也是世界性重要病害。黃瓜灰霉病具有流行性強(qiáng)，再侵染頻率高等特點(diǎn)。全國(guó)各地受到不同程度的危害，一般年份可減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時(shí)損失可達(dá)50%[1]，可危害黃瓜的莖、葉、花和果實(shí)，嚴(yán)重影響黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。黃瓜灰霉病是典型低溫高濕性病害，病害發(fā)生的最適條件為外界環(huán)境溫度為20 ℃，濕度大于90%[2]。

目前，黃瓜灰霉病的防治主要依靠化學(xué)藥劑，雖然能快速有效地達(dá)到防治病害目的，但是隨著化學(xué)農(nóng)藥長(zhǎng)期大量使用，易使病原菌產(chǎn)生耐藥性，造成病害再猖獗，污染農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境殘毒超標(biāo)等一系列問(wèn)題。而生物制劑具有保護(hù)生態(tài)平衡、不易產(chǎn)生抗性、安全天然和易分解等優(yōu)點(diǎn)，是理想的化學(xué)藥劑替代品[3-4]。

因此，篩選出具有良好誘導(dǎo)防效的生物制劑是目前替代化學(xué)農(nóng)藥，防治病害大發(fā)生，保證可持續(xù)發(fā)展的有效措施。海藻酸寡糖具有較好的水溶性、吸收性和激發(fā)子活性和較強(qiáng)的應(yīng)用潛力，能夠克服化學(xué)防治帶來(lái)的副作用，如劉同梅[5]在研究中發(fā)現(xiàn)用50 mg/L海藻酸寡糖處理煙草感病品種，處理組防御相關(guān)酶活顯著提升，水楊酸途徑關(guān)鍵基因過(guò)表達(dá)，水楊酸含量增加，煙草的誘導(dǎo)抗病性顯著提升[5]；在干旱脅迫下，用海藻酸寡糖處理青菜，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的脯氨酸和丙二醛含量顯著增加，抗氧化酶活性顯著增強(qiáng)[6]；但其在誘導(dǎo)黃瓜抗灰霉病方面罕見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病原菌：黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病害綜合治理實(shí)驗(yàn)室? 提供。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、羧甲基纖維素培養(yǎng)基（CMC）供試品種：選用‘中農(nóng)6號(hào)，種子在無(wú)菌水中? 3～4 d，選取發(fā)芽一致的種子播種于大小一致的花盆中，待長(zhǎng)出3片真葉時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

供試藥劑：海藻酸寡糖由大連化工研究所提供，用無(wú)菌水配制成母液，稀釋成不同濃度目標(biāo)? 試劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 海藻酸寡糖盆栽試驗(yàn) 確定最適誘導(dǎo)濃度試驗(yàn)：選取生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致3葉期的黃瓜植株，稱取供試誘導(dǎo)劑用無(wú)菌水配成25 mg/L母液，再將母液按比例配制成目標(biāo)濃度，將藥液噴施于植株第2片真葉葉部表面，直至葉片完全濕潤(rùn)，自然晾干。以清水為空白對(duì)照。待處理1 d后，接種位置如圖1所示，在黃瓜植株第1片真葉、第2片真葉和第3片真葉上，分別接種2～3個(gè)灰霉菌菌餅，23 ℃、95%濕度條件下培養(yǎng)3 d后測(cè)量病斑直徑，計(jì)算病斑面積和誘導(dǎo)防效。每個(gè)處理10個(gè)植株，3次生物學(xué)重復(fù)[7-8]。

確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間：選取生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的3葉期的黃瓜植株，用最適誘導(dǎo)濃度的供試誘導(dǎo)劑噴施于植株第2片真葉葉部表面，直至葉片完全濕潤(rùn)，自然晾干。以無(wú)菌水為空白對(duì)照。待處理不同時(shí)間后，在黃瓜植株第1片真葉、第2片真葉和第3片真葉上，分別接種2～3個(gè)灰霉菌菌餅，23 ℃、90%濕度條件下培養(yǎng)，3 d后測(cè)量第1片真葉、第2片真葉和第3片真葉的病斑直徑，計(jì)算病斑面積和防治效果。每個(gè)處理10個(gè)植株，? 3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 測(cè)定防御酶活性 植株的處理：選取長(zhǎng)勢(shì)一致的3葉期黃瓜植株，將海藻酸寡糖（50?? mg/L）噴施于黃瓜第2片真葉，直至葉片完全濕潤(rùn)，自然晾干。以無(wú)菌水為空白對(duì)照。待處理3 d后，在黃瓜植株第1片真葉、第2片真葉和第3片真葉上，分別接種2～3個(gè)灰霉菌菌餅，23 ℃、95%濕度條件下培養(yǎng)，采集接菌后0 h、6 h、12 h、24 h和48 h的植株葉片，葉片采集后立即用錫箔紙包被，置于液氮中迅速冷凍，保存于-80 ℃冰箱。采用鄰苯三酚法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性、紫外線吸收法測(cè)定氧化氫酶（CAT）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、比色法測(cè)定氧化物酶（POD）活性。

1.2.3 抗病相關(guān)基因的實(shí)時(shí)定量分析 試驗(yàn)參照“1.2.2”中采樣方法，采用Trizol法提取黃瓜葉片總RNA，使用TaKaRa的Prime Script TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit，對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將待測(cè)cDNA置于-20 ℃保存。從葫蘆科作物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)里獲得病程相關(guān)蛋白（Pathogenesis related protein，PR蛋白）基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的完整mRNA序列，利用軟件Primer premier 5.0設(shè)計(jì)用于qRT-PCR的引物。引物長(zhǎng)度為15～30 bp，獲得產(chǎn)物長(zhǎng)度為80～200 bp，由上海生工合成。以待測(cè)cDNA為模板，采用20? μL體系，三步法，以黃瓜actin為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。加樣過(guò)程需在冰上進(jìn)行。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2019處理數(shù)據(jù)，利用2-ΔΔt的計(jì)算方法，IBM SPSS Statistics軟件進(jìn)行差異性分析，Graph Pad Prism 8作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸寡糖的最適誘導(dǎo)濃度

經(jīng)不同濃度海藻酸寡糖處理植株第2片真葉24 h后，接種病原菌。結(jié)果如表1所示，處理組的病斑面積與對(duì)照組具有顯著差異。說(shuō)明海藻酸寡糖能夠誘導(dǎo)黃瓜激活抗病系統(tǒng)。但海藻酸寡糖是否能夠激活黃瓜系統(tǒng)誘導(dǎo)抗病性，還需進(jìn)一步證明。如表2所示，在同一植株上，未經(jīng)海藻酸寡糖處理的第1片真葉和第2片真葉，接種病原菌后，處理組的病斑面積與對(duì)照組亦具有顯著差異，說(shuō)明海藻酸寡糖能夠激活黃瓜系統(tǒng)誘導(dǎo)抗病性。且表1和表2結(jié)果表明，濃度為50 mg/L時(shí)的防治效果好，說(shuō)明海藻酸寡糖的最適誘導(dǎo)濃度為50 mg/L。

2.2 海藻酸寡糖最佳誘導(dǎo)時(shí)間

誘導(dǎo)劑作用方式與化學(xué)農(nóng)藥不同，具有遲滯性，即植物經(jīng)誘導(dǎo)劑刺激后產(chǎn)生免疫應(yīng)答需要一定的時(shí)間，不同植物面對(duì)不同誘導(dǎo)物所產(chǎn)生免疫應(yīng)答所需時(shí)間不同。因此，在確定誘導(dǎo)劑最適誘導(dǎo)濃度的基礎(chǔ)上，設(shè)置時(shí)間梯度，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。經(jīng)50 mg/L海藻酸寡糖處理1～5 d后，接種病原菌，結(jié)果如表3和表4所示：植株的第2片真葉經(jīng)海藻酸寡糖處理3 d后，其誘導(dǎo)防效最高，可達(dá)66.75%。同時(shí)與其同一植株上未經(jīng)處理的第1、第3片真葉的誘導(dǎo)防效也在同一誘導(dǎo)時(shí)間內(nèi)最高，分別達(dá)21.67%和44.48%。說(shuō)明在該誘導(dǎo)時(shí)間下，海藻酸寡糖的系統(tǒng)抗病作用最好。

2.3 海藻酸寡糖誘導(dǎo)抗病性機(jī)理的研究

對(duì)PAL活性的影響：在接菌后，經(jīng)誘導(dǎo)劑處理的第2片真葉的PAL活性如圖2-A所示，其葉內(nèi)的PAL活性在接菌6 h時(shí)達(dá)到峰值，為240.51 U/（g·h），與對(duì)照組有顯著差異。與其同一植株上未經(jīng)誘導(dǎo)劑處理的第1、3片真葉中PAL活性如圖2-B和2-C所示，PAL活性均在接菌6 h達(dá)到峰值，分別為172.35 U/（g·h）、225.68?? U/（g·h），說(shuō)明植株體內(nèi)的PAL經(jīng)海藻酸寡糖誘導(dǎo)后活性增強(qiáng)。

對(duì)CAT活性的影響：同一植株上處理葉與未處理葉中的CAT活性如圖3-A所示，在接菌后6 h，處理組第2片真葉的CAT活性達(dá)到峰值，為12.50 U/（g·h），與對(duì)照組之間有顯著差異。同時(shí)，未處理葉中CAT活性如圖3-B和3-C所示，第1、第3片真葉的CAT活性分別在接菌后12 h、6 h時(shí)，達(dá)到峰值，分別為7.64 U/（g·h）和10.29 U/（g·h），與對(duì)照組之間有顯著差異。說(shuō)明植株體內(nèi)的CAT經(jīng)海藻酸寡糖誘導(dǎo)后活性增強(qiáng)。

對(duì)SOD活性的影響：接種后植株內(nèi)SOD活性隨時(shí)間變化如圖4-A、4-B、4-C所示，其中處理葉第2片真葉SOD活性在接菌后12 h達(dá)到峰值，為100.34 U/（g·h）。而未處理葉第1、第3片真葉SOD活性分別在12 h、24 h達(dá)到峰值，分別為89.95 U/（g·h）和92.24 U/（g·h）。說(shuō)明植株體內(nèi)的SOD經(jīng)海藻酸寡糖誘導(dǎo)后活性增強(qiáng)。

對(duì)POD活性的影響：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=? 0.031 4x-0.029 1，R2=0.999 3，測(cè)得POD酶活性如圖5所示，植株處理葉第2片真葉與未處理葉第1、第3片真葉，同時(shí)在接種24 h后POD活性達(dá)到峰值，分別為17.94 U/（g·min）、14.04 U/（g·min）和17 U/（g·min）。其中未處理葉第1片真葉POD活性與對(duì)照組沒有顯著差異，這與植物級(jí)性運(yùn)輸有關(guān)，說(shuō)明海藻酸寡糖是能夠通過(guò)局部誘導(dǎo)，激發(fā)黃瓜整體的POD活性，但位于處理葉下部葉片的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗病性低于上部葉片。

2.4 對(duì)相關(guān)防衛(wèi)基因表達(dá)量的影響

測(cè)定海藻酸寡糖處理組處理葉（第2片真葉）和未處理葉（第1片和第3片真葉）的PR1、NPR1在接菌后不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖6、圖7所示，處理組3片真葉的PR1、NPR1相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)，分別在接菌后12 h、24 h達(dá)到峰值，說(shuō)明植株體內(nèi)的水楊酸途徑被? 激活。

JAR1和? EIN2在不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果如圖8、圖9所示，處理組3片真葉的? JAR1和? EIN2相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)，說(shuō)明茉莉酸途徑未被激活。

3 討? 論

牛紅艷等[9]研究發(fā)現(xiàn)，海藻酸鈉的降解產(chǎn)物海藻酸寡糖具有較高的水溶性高，強(qiáng)吸收性和較高的激發(fā)子活性；江琳琳等[10]研究表明，海藻酸寡糖可以能夠激發(fā)大豆子葉產(chǎn)生植保素，對(duì)水稻植物細(xì)胞同樣具有激發(fā)子活性；張運(yùn)紅等[11]已證明，噴施海藻寡糖可以緩解干旱脅迫對(duì)小麥發(fā)育的抑制作用，苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)、生物量等增加，并且丙二醛、脯氨酸含量下降，葉綠素、部分抗氧化酶活力升高。但其在防治黃瓜灰霉病方面存在罕見? 報(bào)道。

本次試驗(yàn)旨在為海藻酸寡糖在黃瓜灰霉病防治方面提供理論支持，通過(guò)盆栽試驗(yàn)、抑菌試驗(yàn)、防御相關(guān)酶活測(cè)定和相關(guān)防衛(wèi)基因表達(dá)量測(cè)定，探究海藻酸寡糖的誘導(dǎo)抗病效果和系統(tǒng)誘導(dǎo)抗病機(jī)理。

有研究表明：誘導(dǎo)劑作用方式與化學(xué)農(nóng)藥不同，具有遲滯性，即植物經(jīng)誘導(dǎo)劑刺激后產(chǎn)生免疫應(yīng)答需要一定的時(shí)間，不同植物面對(duì)不同誘導(dǎo)物所產(chǎn)生免疫應(yīng)答所需時(shí)間不同，如水楊酸和茉莉酸甲酯處理甜瓜2～5 d后，其對(duì)枯萎病的防治效果最好[12]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，海藻酸寡糖也具有遲滯性，在處理黃瓜3 d后藥效最好。

防御酶與植物抗性有著很大關(guān)系，它們參與活性氧清除、酚類、木質(zhì)素和植保素等抗病相關(guān)物質(zhì)的合成，能抵御活性氧及氧自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，使植物抵抗病害的能力增強(qiáng)。當(dāng)防御酶活性顯著提高，說(shuō)明黃瓜抗病性增強(qiáng)[13-16]。測(cè)定酶活性試驗(yàn)表明，植株部分葉片經(jīng)誘導(dǎo)劑處理后，整株葉片的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性均顯著提升，說(shuō)明海藻酸寡糖可以通過(guò)局部誘導(dǎo)激發(fā)黃瓜整體的防御酶活性，增強(qiáng)抗病性。

植物在識(shí)別植物誘導(dǎo)劑后，會(huì)啟動(dòng)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在整個(gè)植物抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，主要由兩條不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用，一條是水楊酸途徑；另一條是茉莉酸/乙烯途徑[17]。根據(jù)研究，這兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑既存在拮抗關(guān)系，激活其中一個(gè)信號(hào)通路的同時(shí)，必然會(huì)影響另外一個(gè)途徑介導(dǎo)的對(duì)病原菌的抗性[18]，如劉同梅[5]在研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)海藻酸寡糖處理的煙草，在接種TMV后，其體內(nèi)的水楊酸途徑關(guān)鍵基因和水楊酸含量顯著上升，但茉莉酸含量無(wú)明顯變化；也存在同時(shí)發(fā)揮作用的情況[19]，如Feys等[20]研究報(bào)道，擬南芥根際細(xì)菌可以同時(shí)激發(fā)植物的水楊酸途徑和茉莉酸/乙烯途徑，從而提高番茄對(duì)丁香假單胞菌的抗性。本試驗(yàn)利用qRT-PCR技術(shù)，測(cè)定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)量。結(jié)果表明，海藻酸寡糖處理組葉內(nèi)的茉莉酸途徑關(guān)鍵基因? JAR1和? EIN2表達(dá)量均下調(diào)；水楊酸途徑關(guān)鍵基因? NPR1和 PR1表達(dá)量均上調(diào)，說(shuō)明海藻酸寡糖通過(guò)激活水楊酸途徑，提高黃瓜抗性。

為更加接近實(shí)際農(nóng)藥噴灑活動(dòng)，整體試驗(yàn)更具有說(shuō)服力和可操作性，在本試驗(yàn)中采用3片真葉期的黃瓜做為供試植株，僅用誘導(dǎo)劑處理中部葉片，測(cè)定整株葉片的防治效果、抗病相關(guān)酶活和基因表達(dá)量，探究海藻酸寡糖的生產(chǎn)實(shí)踐價(jià)值。試驗(yàn)結(jié)果表明，海藻酸寡糖比市面上應(yīng)用較為廣泛的殼寡糖的誘導(dǎo)抗病效果更好，并且其抗病機(jī)理是通過(guò)激活水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而激發(fā)植株體內(nèi)相關(guān)防御酶活性，來(lái)抑制病原菌在植株細(xì)胞中的增殖。

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Effciency? of Alginate Oligosaccharides on Induced Resistance against

Botrytis cinerea? in Cucumber and Their Mechanisms

DONG Zihui1，2 and MA Qing1

（1.College of Plant Protection，Northwest A&F University ，Yangling Shaanxi 712100，China;

2.Agricultural Technology Extension Center，Pingluo? Ningxia 753400，China）

Abstract In order to investigate effect of alginate oligosaccharides on induced resistance against? Botrytis cinerea in cucumber and understand their mechanisms，the trefoil stage of a susceptible variety of cucumber was used as the experimental materials. During 0-48 h after inoculation in pot experiment，enzyme activity determination method and real-time fluorescence quantification were used to determine the activities of defense related enzymes [（superoxide dismutase （SOD），hydrogen oxide （CAT），phenylalanine ammonia lyase （PAL）]，and peroxidase （POD） activity in cucumber leaves. The expression of key genes in the signal transduction pathway，including?? JAR1 and EIN2 （ key gene of plant in Jasmonic Acid Pathway），as well as? ?NPR1 and? PR1（key gene of plant in Salicylic Acid Pathway），were analyzed. The results showed that? the optimal induction concentration of ADO was 50 mg/L，with the induction period of 3 days，and the control efficiency? of 66.75%; the activities of defense related enzymes significantly increased; the relative expression of?? NPR1 and?? PR1，key genes of salicylic acid pathway，were up-regulated. Thre results suggest that alginate oligosaccharides have the potential to enhance the activity of defense related enzymes in plants，thereby increasing plant disease resistance through the stimulation of salicylic acid signal transduction.

Key words ADO; Induced disease resistance; Signal transduction pathway; Defense related enzyme activity

Received? 2022-11-06??? Returned 2023-03-23

Foundation item Key R&D Program of Shaanxi Province（No.2019ZDLNY03-07）.

First author DONG? Zihui，female，master student. Research area：plant pathology，comprehensive control of plant diseases.E-mail：zhibaodongzihui@163.com

Corresponding?? author MA Qing，female，doctoral supervisor，professor.Research area：plant pathology，comprehensive control of plant diseases. E-mail： maqing@nwafu.edu.cn

（責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）