基金項(xiàng)目：宜昌市自然科學(xué)研究項(xiàng)目（A23-2-037）。

作者簡(jiǎn)介：張小驥（1990—），男，湖北宜昌人，碩士，工程師。研究方向：食品安全。

摘 要：酵母活細(xì)胞率作為評(píng)判活性干酵母質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)之一，準(zhǔn)確快速地檢測(cè)出結(jié)果顯得尤為重要。本文針對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)行活細(xì)胞率檢測(cè)存在效率低、過程復(fù)雜等問題開發(fā)了一款計(jì)數(shù)軟件，并將血球計(jì)數(shù)板替換為96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)比人工計(jì)數(shù)和軟件計(jì)數(shù)在檢測(cè)酵母活細(xì)胞率的誤差以及采用不同容器進(jìn)行檢驗(yàn)的效率，結(jié)果表明，相對(duì)于人工計(jì)數(shù)，軟件計(jì)數(shù)耗時(shí)更短，且誤差較??；采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板批量檢測(cè)比采用血球計(jì)數(shù)板耗時(shí)更短。

關(guān)鍵詞：酵母計(jì)數(shù)；活細(xì)胞率；霍夫圓變換；圖像處理

A Rapid Measurement System for the Survival Rate of Yeast Living Cells Based on Image Recognition

ZHANG Xiaoji， QIN Leilei， JIANG Yifei， HE Xiaoyan， ZHANG Xueqi

（Three Gorges Public Inspection and Testing Center， Yichang 443000， China）

Abstract： As one of the important indicators for evaluating the quality of active dry yeast， accurate and rapid detection of the results is particularly important. A counting software was designed for solving the issues of low efficiency and complex process in traditional method， blood cell counting plate is replaced by 96-well cell plate in this measurement system. Comparing the errors of manual counting and software counting in measuring survival rate of yeast living cells and the efficiency of different containers， the results reveal that software counting has less time consuming and errors compared with manual counting; compared with blood cell counting plate a significant advantage has shown in measuring a large number of samples by using 96-well cell plate.

Keywords： yeast counting; survival rate of living cells; Hough circle transform; image recognition

活性干酵母是鮮酵母經(jīng)干燥脫水后仍保持生物活性的干制品[1]，它是利用現(xiàn)代生物技術(shù)與生產(chǎn)工藝，將規(guī)模化生產(chǎn)的酵母細(xì)胞制成干物質(zhì)含量超過95%的實(shí)用性酵母產(chǎn)品?；钚愿山湍赋缓鞍踪|(zhì)和維生素外，還含有必需微量元素和生長(zhǎng)因子，具有穩(wěn)定性好、成本低廉、效果優(yōu)良等特點(diǎn)[2]。酵母活細(xì)胞率是評(píng)判活性干酵母質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)，目前常規(guī)的活細(xì)胞率檢測(cè)方法為《酵母產(chǎn)品質(zhì)量要求 第1部分：食品加工用酵母》（GB/T 20886.1—2021）中附錄D，該方法原理為活細(xì)胞能將進(jìn)入細(xì)胞的次甲基藍(lán)染色劑還原為無色，死細(xì)胞由于無還原能力，次甲基藍(lán)進(jìn)入細(xì)胞后將其染成藍(lán)色[3]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中采用血球計(jì)數(shù)板作為容器計(jì)數(shù)，通過人工計(jì)數(shù)方式統(tǒng)計(jì)血球計(jì)數(shù)板中4個(gè)視野內(nèi)中方格里酵母細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出活細(xì)胞率。該方法的缺點(diǎn)是每次使用完血球計(jì)數(shù)板需要反復(fù)清洗、晾干后才能進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)，不便于批量處理；人工細(xì)胞計(jì)數(shù)耗時(shí)長(zhǎng)、易視覺疲勞，若期間受到干擾或打擾，常面臨返工風(fēng)險(xiǎn)，效率低，出錯(cuò)率高。

筆者利用Python編寫了計(jì)數(shù)軟件替代人工計(jì)數(shù)，以解決以上難題。顯微鏡電子目鏡采集圖像后，通過霍夫圓變換識(shí)別所有酵母細(xì)胞，再將圖片進(jìn)行閾值分割及二值化變換，利用形態(tài)學(xué)方法處理圖片，識(shí)別圖中輪廓數(shù)，即可識(shí)別出死細(xì)胞個(gè)數(shù)。1塊血球計(jì)數(shù)板單次只能測(cè)單個(gè)樣品，而1塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，且不需要清洗，批量處理速度快。以下對(duì)該軟件計(jì)數(shù)方法進(jìn)行介紹。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

儀器：全功能手動(dòng)正置光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴

鍋、電子天平、倒置熒光顯微鏡。試劑和耗材：次甲基藍(lán)、氯化鉀、碳酸氫鈉、葡萄糖、氯化鈉、六水氯化鈣、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、血球計(jì)數(shù)板。

1.2 前處理方法

1.2.1 血球計(jì)數(shù)板前處理方法

稱取高活性干酵母0.1 g于50 mL離心管，向其中加入20 mL生理鹽水，溫度為38～40 ℃，將離心管放入32 ℃水浴鍋中活化1 h，活化完畢后，將離心管內(nèi)樣品混合均勻，再吸取混合液0.1 mL于

1 mL離心管，向其中加入次甲基藍(lán)染色液0.9 mL，搖勻，室溫下染色10 min，將蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室上，使之緊緊蓋在血球計(jì)數(shù)板上，吸取

20 μL染色后的溶液至血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室內(nèi)，靜置1～2 min，用正置顯微鏡觀察[4]。正置顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板細(xì)胞形態(tài)如圖1所示。

圖1 顯微鏡視野下血球計(jì)數(shù)板上酵母形態(tài)

1.2.2 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板前處理方法

稱取高活性干酵母0.1 g于50 mL離心管，向其中加入20 mL生理鹽水，溫度為38～40 ℃，將離心管放入32 ℃水浴鍋中活化1 h，活化完畢后，將離心管內(nèi)樣品混合均勻，再吸取混合液0.1 mL于

1 mL離心管，向其中加入次甲基藍(lán)染色液0.9 mL，搖勻，室溫下染色10 min，取100 μL染色后溶液至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板小孔內(nèi)，靜置1～2 min，用倒置顯微鏡觀察。倒置顯微鏡下96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞形態(tài)如圖2所示。

圖2 顯微鏡視野下96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上酵母形態(tài)

1.3 計(jì)數(shù)原則

1.3.1 人工計(jì)數(shù)

將載玻片放入顯微鏡中，在10倍目鏡和16倍物鏡下找到血球計(jì)數(shù)板中目標(biāo)方格，再切換40倍物鏡，調(diào)整焦距至視野最清晰處，開始對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，如果細(xì)胞在方格線上，則記上不記下，記左不記右。隨機(jī)計(jì)數(shù)4個(gè)中方格（100個(gè)小方格）內(nèi)酵母細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取3次計(jì)數(shù)的算術(shù)平均值。無色透明的細(xì)胞為酵母活細(xì)胞，被染為藍(lán)色的為酵母死細(xì)胞。

1.3.2 軟件計(jì)數(shù)

在10倍目鏡和16倍物鏡下找到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中目標(biāo)方格，再切換40倍物鏡，調(diào)整焦距至視野最清晰處，開始計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)范圍為視野內(nèi)全部細(xì)胞，隨機(jī)計(jì)數(shù)4個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞。

1.4 自動(dòng)識(shí)別計(jì)數(shù)方法的實(shí)現(xiàn)

1.4.1 細(xì)胞總數(shù)識(shí)別計(jì)數(shù)原理

由于大多數(shù)種類酵母細(xì)胞在顯微鏡下呈類圓形[5]，可利用霍夫圓變換檢測(cè)顯微鏡視野下的酵母細(xì)胞數(shù)[6-7]?；舴驁A變換在圖像處理中使用頻率很高，可以用來檢測(cè)圖像中的圓形。該算法的原理是基于圓的數(shù)學(xué)特性，對(duì)圖像中所有的像素點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和梯度計(jì)算，找出圓心和半徑，從而實(shí)現(xiàn)圓的檢測(cè)。在霍夫圓變換中，首先需要對(duì)圖像進(jìn)行邊緣檢測(cè)，以便找出圖像中的邊緣。對(duì)可能組成圓的邊緣像素點(diǎn)采取梯度計(jì)算，得到每個(gè)像素點(diǎn)的梯度值和方向。再將梯度值和方向轉(zhuǎn)換為霍夫空間中的曲線，通過對(duì)曲線進(jìn)行投票，找出圓心和半徑[8]。在軟件中調(diào)用霍夫圓變換法進(jìn)行圓檢測(cè)，需要將圖像轉(zhuǎn)換為灰度圖像，流程見圖3。

圖3 總細(xì)胞計(jì)數(shù)流程

活的酵母細(xì)胞在顯微鏡視野下呈透明類圓形，死亡酵母細(xì)胞被次甲基藍(lán)染色，呈藍(lán)綠色透明類圓形（圖4）。

圖4 顯微鏡下酵母細(xì)胞

通過電子目鏡將顯微鏡下視野截圖并上傳至計(jì)數(shù)軟件識(shí)別計(jì)數(shù)，被計(jì)數(shù)軟件統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞外側(cè)會(huì)標(biāo)記圓圈（圖5）。

圖5 識(shí)別并標(biāo)記的酵母細(xì)胞

1.4.2 死細(xì)胞識(shí)別計(jì)數(shù)原理

酵母死細(xì)胞染成藍(lán)色，顏色明顯區(qū)別于活細(xì)胞和背景。電子目鏡拍攝圖片為RGB色彩模式，是一種面向硬件的色彩模式，屬于加法混色原理，RGB色彩模式中3個(gè)色彩分量之間聯(lián)系緊密，只要亮度變化，分量值均會(huì)發(fā)生變化，且光線亮度對(duì)RGB值影響較大。因此，可以采用HSV色彩空間替代RGB色彩空間。相對(duì)于RGB色彩空間，HSV色彩空間能更直觀顯示出顏色的鮮艷程度、敏感程度等，方便人眼進(jìn)行顏色對(duì)比[9-10]。HSV色彩空間相比于RGB色彩空間更容易實(shí)現(xiàn)對(duì)某種顏色的物體的追蹤，也常用于分割指定顏色的物體。將圖像轉(zhuǎn)換為HSV色彩空間后，能使目標(biāo)顏色更突出，更易通過設(shè)定閾值將圖像二值化，排除背景干擾，留下感興趣區(qū)域（Reigion of Interest，ROI）。將ROI區(qū)域圖像進(jìn)行優(yōu)化處理后，即可識(shí)別并計(jì)數(shù)死細(xì)胞，識(shí)別流程見圖6。

圖6 死細(xì)胞識(shí)別計(jì)數(shù)流程圖

（1）閾值分割。將RGB色彩空間轉(zhuǎn)換為HSV色彩空間，觀察者通過色調(diào)、飽和度和亮度能更好地感知顏色。從細(xì)胞的HSV圖像可以發(fā)現(xiàn)，染色的死細(xì)胞與活細(xì)胞及背景的對(duì)比度較大[圖7（a）]，可以采用閾值分割法將死細(xì)胞和活細(xì)胞以及背景區(qū)分開。通過設(shè)定相應(yīng)閾值，對(duì)圖像進(jìn)行二值化處理，在閾值范圍內(nèi)的點(diǎn)像素設(shè)為255，閾值范圍外的點(diǎn)像素設(shè)為0，得到一副只有黑白點(diǎn)的圖像，白點(diǎn)為死細(xì)胞輪廓[圖7（b）]。

（2）形態(tài)學(xué)處理。圖像二值化后雖然能將死細(xì)胞像素點(diǎn)分離出來，但設(shè)定閾值可能會(huì)導(dǎo)致部分組成單個(gè)死細(xì)胞的像素團(tuán)中出現(xiàn)像素點(diǎn)不連續(xù)的情況，造成計(jì)數(shù)誤差。因此，需要將組成同一細(xì)胞的像素點(diǎn)連接起來，同時(shí)將噪聲點(diǎn)去除掉。本文采用圖像形態(tài)學(xué)運(yùn)算去除背景和連接組成同一細(xì)胞的像素點(diǎn)。腐蝕操作可以將圖像中對(duì)象的邊緣縮小和消除，達(dá)到去除特定像素的目的[11]。它可以用來將二值化圖像中的前景部分進(jìn)行收縮以及細(xì)化，可借此實(shí)現(xiàn)去除噪聲的功能，見圖8（a）。利用膨脹可將圖像中像素對(duì)象的邊界向外擴(kuò)展，從而使得相鄰的像素點(diǎn)或像素團(tuán)連接在一起成為一個(gè)對(duì)象，該操作可以很好地彌補(bǔ)在腐蝕過程中造成的圖像中間部分缺失的錯(cuò)誤，從而達(dá)到將單個(gè)細(xì)胞像素點(diǎn)或像素團(tuán)填充連接的效果，見圖8（b）。

（3）計(jì)數(shù)。在二值化圖像中，經(jīng)過腐蝕、膨脹操作后，會(huì)留下多個(gè)獨(dú)立的組成死細(xì)胞的像素團(tuán)，對(duì)像素團(tuán)計(jì)數(shù)即為死細(xì)胞數(shù)。但像素團(tuán)多為不規(guī)則形，無法采用霍夫圓變換進(jìn)行計(jì)數(shù)，此時(shí)可通過輪廓識(shí)別對(duì)像素團(tuán)計(jì)數(shù)。圖像輪廓是指圖像中具有相同顏色或灰度值的連續(xù)點(diǎn)的曲線，可以有各種形狀，通過對(duì)圖像輪廓進(jìn)行標(biāo)記，可獲得目標(biāo)圖像相關(guān)信息[12]。本文采用圖像輪廓識(shí)別并標(biāo)記死細(xì)胞，死細(xì)胞輪廓用黑色標(biāo)記出來（圖9）。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工計(jì)數(shù)和軟件計(jì)數(shù)結(jié)果差異

實(shí)驗(yàn)室選取了5個(gè)酵母產(chǎn)品測(cè)定活細(xì)胞率，采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為容器，分別用人工計(jì)數(shù)和軟件計(jì)數(shù)比對(duì)，結(jié)果如表1所示。相對(duì)于人工計(jì)數(shù)，軟件計(jì)數(shù)中細(xì)胞總數(shù)和死細(xì)胞數(shù)略偏低（不采用軟件中人工修正功能時(shí)），活細(xì)胞率的相對(duì)誤差在3%以內(nèi)。軟件計(jì)數(shù)的數(shù)據(jù)偏低有以下幾個(gè)原因：少量細(xì)胞不夠圓，形態(tài)偏扁，軟件無法識(shí)別為細(xì)胞；存在大量細(xì)胞團(tuán)，少量細(xì)胞粘連程度高，無法分開計(jì)數(shù)；部分死細(xì)胞顏色偏淺，無法通過設(shè)置閾值將其分割出來。

2.2 采用不同容器檢測(cè)流程的區(qū)別

采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板和血球計(jì)數(shù)板分別檢測(cè)

5個(gè)酵母產(chǎn)品的活細(xì)胞率指標(biāo)，對(duì)比結(jié)果見表2。采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板檢測(cè)活細(xì)胞率在單個(gè)樣品檢測(cè)或者批量檢測(cè)中均能體現(xiàn)出更高的檢測(cè)效率。

3 結(jié)論

本文基于圖像識(shí)別技術(shù)實(shí)現(xiàn)了酵母活細(xì)胞率的快速檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、識(shí)別準(zhǔn)確率高，識(shí)別產(chǎn)生的計(jì)數(shù)誤差也可通過軟件人工修正功能進(jìn)行手動(dòng)干預(yù)調(diào)整。該方法能滿足日常檢測(cè)活細(xì)胞率的需要，可有效輔助或替代人工計(jì)數(shù)進(jìn)行樣品檢測(cè)。采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板替代血球計(jì)數(shù)板在批量檢測(cè)方面具有更高的效率。

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