李廣志 關(guān)瑩 陳玉芳 郭津津 劉周瑩 吳卓君 李倩 馬永強(qiáng)

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.07.012

引文格式：李廣志，關(guān)瑩，陳玉芳，等.藍(lán)靛果酵素粉體制備及加工特性的研究.中國調(diào)味品，2024，49（7）：79-85.

LI G Z， GUAN Y， CHEN Y F， et al.Study on preparation and processing characteristics of honeyberry enzyme powder.China Condiment，2024，49（7）：79-85.

摘要：為探究藍(lán)靛果酵素粉的發(fā)酵工藝及其加工特性，選取藍(lán)靛果為原料，通過單因素試驗研究酵母菌添加量、發(fā)酵溫度、醋酸菌添加量、發(fā)酵時間對總酚含量、總黃酮含量、花色苷含量、SOD活力的影響，結(jié)合正交試驗確定最佳發(fā)酵條件。通過試驗探究不同貯藏溫度4，25，37 ℃對粉體的堆密度、滑角、休止角等加工特性的影響。結(jié)果表明，酵母菌添加量1.5%、發(fā)酵溫度22 ℃、無氧發(fā)酵10 d，再接種醋酸菌1.5%、發(fā)酵溫度34 ℃、有氧發(fā)酵5 d，此時感官評分最高，為93分，在此條件下總酚含量為7.63 mg/L，總黃酮含量為38.63 mg/L，花色苷含量為6.56 mg/L，SOD活力為7 539 U/mL，將藍(lán)靛果酵素經(jīng)冷凍干燥避光磨粉，在4，25，37 ℃下測定粉體的加工特性，結(jié)果表明隨著溫度的升高，堆密度、滑角、休止角的變化逐漸增大，在4 ℃時藍(lán)靛果酵素粉的加工特性指標(biāo)最高。該試驗為藍(lán)靛果的深加工及應(yīng)用提供了理論參考。

關(guān)鍵詞：藍(lán)靛果酵素；醋酸菌；花色苷；加工特性

中圖分類號：TS255.36????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A????? 文章編號：1000-9973（2024）07-0079-07

Study on Preparation and Processing Characteristics of

Honeyberry Enzyme Powder

LI Guang-zhi1，2， GUAN Ying2， CHEN Yu-fang2， GUO Jin-jin2， LIU Zhou-ying2，

WU Zhuo-jun1， LI Qian2， MA Yong-qiang1*

（1.College of Food Engineering， Harbin University of Commerce， Harbin 150028， China;

2.College of Tourism Cuisine， Harbin University of Commerce， Harbin 150028， China）

Abstract： In order to explore the fermentation process and processing characteristics of honeyberry enzyme powder， honeyberry is selected as the raw material， the effects of yeast addition amount， fermentation temperature， acetic acid bacteria addition amount and fermentation time on the content of total phenols， total flavonoids， anthocyanins and SOD activity are? studied by single factor test， and the optimal fermentation conditions are determined by orthogonal test. The effects of different storage temperatures of 4， 25， 37 ℃ on the processing characteristics of powder such as bulk density， slip angle and rest angle are investigated. The results show that the sensory score is the highest of 93 points by adding 1.5% yeast， fermentation temperature 22 ℃， anaerobic fermentation for 10 d， and then inoculation with 1.5% acetic acid bacteria， fermentation temperature 34 ℃， aerobic fermentation for 5 d. Under these conditions， the content of total phenols is 7.63 mg/L， the content of total flavonoids is 38.63 mg/L， the content of anthocyanins is 6.56 mg/L， and the SOD activity is 7 539 U/mL. The honeyberry enzyme is freeze-dried and ground into powder in dark conditions， the processing characteristics of the powder are determined at 4， 25， 37 ℃. The results show that with the increase of temperature， the changes of bulk density， slip angle and rest angle gradually increase， and the processing characteristic indexes of honeyberry enzyme powder are the highest at 4 ℃. This test has provided theoretical references for the deep processing and application of honeyberry.

Key words： honeyberry enzyme; acetic acid bacteria; anthocyanins; processing characteristics

收稿日期：2024-02-26

基金項目：2023年中國烹飪協(xié)會全國餐飲職業(yè)教育教學(xué)指導(dǎo)委員會一般課題“多菌種藍(lán)靛果酵素產(chǎn)品研發(fā)”（CYHZW-YB2023021）；2023年度哈爾濱商業(yè)大學(xué)“青年科研創(chuàng)新人才”培育計劃（2023-KYYWF-0994）

作者簡介：李廣志（1993—），男，講師，博士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及綜合利用、烹飪科學(xué)。

*通信作者：馬永強(qiáng)（1963—），男，教授，碩士，研究方向：食品化學(xué)。

藍(lán)靛果，又名黑瞎子果、脫皮子等，富含花青素、花色苷、多酚、多糖等活性成分，在我國東北地區(qū)大量分布。藍(lán)靛果含有大量的糖類、花青素、花色苷等一些有益于身體健康的營養(yǎng)成分，具有抗氧化、降血糖、降血壓等功效，在食品、藥品和保健品等領(lǐng)域具有加工價值和研究潛力，是理想的醫(yī)療保健食品加工原料。藍(lán)靛果果實味道微酸，稍帶苦澀，直接食用口感一般，因此藍(lán)靛果經(jīng)常被加工成各種藍(lán)靛果制品。隨著藍(lán)靛果被逐漸開發(fā)研究，藍(lán)靛果的經(jīng)濟(jì)價值逐漸提高，我國對藍(lán)靛果的需求量日益增大，藍(lán)靛果具有十分廣闊的市場前景，藍(lán)靛果加工的產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；俏磥硭{(lán)靛果加工發(fā)展的必然趨勢。

食用酵素含有黃酮類、超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸、醋酸等生物活性成分，具有抗氧化、保護(hù)心血管、清除自由基等多種健康保健功效。由于藍(lán)靛果口味酸澀，通常與其他食品共同制成酵素制品，包怡紅等利用藍(lán)靛果與米糠共同發(fā)酵開發(fā)出一種新型復(fù)合酵素，優(yōu)化工藝過程并研究其代謝產(chǎn)物制得的酵素產(chǎn)品。戰(zhàn)偉偉等利用藍(lán)靛果和椰子制備酵素產(chǎn)品，確定發(fā)酵溫度、原料配比、菌種比例。于思文等為開發(fā)不同風(fēng)味的藍(lán)靛果酵素，對黑曲霉纖維素酶在藍(lán)靛果酵素中的作用進(jìn)行研究，確定揮發(fā)性化合物的種類。

因為藍(lán)靛果含水量高，易出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，并且酸澀口感較突出，所以常與其他水果復(fù)合制成飲品，影響單一藍(lán)靛果產(chǎn)業(yè)發(fā)展。同時由于人體缺乏相關(guān)的代謝酶而使藍(lán)靛果中部分營養(yǎng)成分不能被人體利用，所以市場上需要一種可以根據(jù)個人口味需求添加到液體食品或菜品中的藍(lán)靛果酵素粉產(chǎn)品。試驗通過酵母菌和醋酸菌對藍(lán)靛果進(jìn)行發(fā)酵，并將其冷凍干燥制成酵素粉，對粉體的加工特性和分散效果進(jìn)行表征，為藍(lán)靛果的深加工提供了理論支撐。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑

藍(lán)靛果：選用吉林長白山新鮮藍(lán)靛果。

試劑：鹽酸-氯化鉀緩沖溶液、鹽酸-乙酸鈉緩沖溶液、氯化鋁晶體（科密歐品牌）、醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液（科密歐品牌）、福林酚試劑（宇電品牌）、碳酸鈉溶液（科密歐品牌）、三羥甲基氨基甲烷（科密歐品牌）、EDTA-2Na（科密歐品牌）、鄰苯三酚（科密歐品牌），所有試劑均為分析純。

1.2? 儀器與設(shè)備

SP-1920型紫外可見分光光度計? 上海光譜儀器有限公司；Scientz-10N冷凍干燥機(jī)? 寧波新芝生物科技股份有限公司；PHS-2F型pH計? 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LKTC-E恒溫磁力攪拌器? 天津市賽得利斯實驗分析儀器制造廠；HWS-2電熱恒溫水浴鍋? 上海力辰邦西儀器科技有限公司；BPG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱、ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)搖床? 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TC-M600D空冷型臺式低速離心機(jī)? 寧波拓普森科學(xué)儀器有限公司。

1.3? 藍(lán)靛果酵素制備流程

藍(lán)靛果選擇→沖洗→榨汁（藍(lán)靛果∶水為1∶1）→酶解→滅菌→酵母菌發(fā)酵→醋酸菌發(fā)酵→冷凍干燥→用研缽研磨成粉末→密封保存。

1.4? 藍(lán)靛果酵素單因素試驗

考察酵母菌添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、酵母菌發(fā)酵溫度（18，22，25 ℃）、醋酸菌添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、醋酸菌發(fā)酵溫度（30，32，34，36 ℃）、醋酸菌發(fā)酵時間（5，6，7，8，9 d）對藍(lán)靛果酵素總酚含量、總黃酮含量、花色苷含量、SOD活力的影響。

1.5? 藍(lán)靛果酵素工藝配方優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以感官評分為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗，確定醋酸菌發(fā)酵工藝條件。正交試驗因素與水平見表1。

1.6? 藍(lán)靛果酵素指標(biāo)的測定

1.6.1? 花色苷含量的測定

以pH色差法測定酵素中花色苷含量。

C（mg/mL）=（Amax-A700）pH 1.0（Amax-A700）pH 4.5×Mwε×I×DF×1 000。

C（mg/mL）=A×Mwε×I×DF×1 000。

式中：Amax為最大吸收波長處的吸光度值（Abs）；C為樣品中花色苷含量（mg/mL）；Mw為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的分子量449.2 mg/mol；DF為總稀釋倍數(shù)；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)29 600 L/（mol·cm）；I為比色皿光程（cm）。

1.6.2? 總黃酮含量的測定

以蘆丁法測定藍(lán)靛果酵素中的總黃酮含量。

1.6.3? 總酚含量的測定

參考張洋婷等的福林酚比色法測定藍(lán)靛果酵素中總酚含量。

1.7? 藍(lán)靛果酵素抗氧化能力的測定

參照GB/T 5009.171—2003中鄰苯三酚自氧化法測定藍(lán)靛果酵素超氧化物歧化酶（SOD）活力。

SOD=×9/V×N。

式中：A0為鄰苯三酚自氧化速率；ΔA為樣液或SOD酶液抑制鄰苯三酚自氧化速率；V為樣液體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)9。

1.8? 藍(lán)靛果酵素粉體加工特性

1.8.1? 堆密度

稱取2.0 g凍干粉粉體質(zhì)量記為m，全部裝入10.0 mL量筒中，每隔2 s將量筒從3 cm處垂直落下，直到桶內(nèi)粉體體積停止改變，記最后的體積為V。

1.8.2? 滑角、休止角

稱取3.00 g凍干粉放在一塊平滑玻璃板上，輕輕振蕩使其均勻分布在玻璃板上，然后將玻璃板一邊緩慢勻速提起，當(dāng)粉體開始在玻璃板上滑動時，所測量出的夾角即為滑角。

取一漏斗，將其固定于距離臺面3 cm的鐵架臺上，在漏斗正下方放一張空白紙，將漏斗下端口堵住，然后將粉體全部倒入漏斗中，打開漏斗下端口，直到漏斗中的粉體下落完畢，測量粉體堆圓錐底部直徑為2R，高度為H，休止角記為α。

1.9? 藍(lán)靛果酵素成品感官分析

藍(lán)靛果酵素成品制備過程中，發(fā)酵液受不同霉菌添加量、溫度、時間的影響，其澄清度、色澤、氣味、品質(zhì)均不相同，選取10名感官評價人員對1.5%醋酸菌添加量、34 ℃、發(fā)酵9 d的成品藍(lán)靛果酵素進(jìn)行澄清度、色澤、氣味的分析。藍(lán)靛果酵素感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表2。

1.10? 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS、Excel軟件進(jìn)行試驗基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析、繪圖、精確度計算。

2? 結(jié)果分析

2.1? 酵母菌添加量對藍(lán)靛果酵素的影響

由圖1可知，當(dāng)酵母菌接種量為1.5%時，花色苷含量達(dá)到最高，為6.93 mg/L，接種量大于1.5%時，花色苷含量呈下降趨勢，這可能是因為酵母菌對花色苷的吸附作用，酵母菌越多，顏色越淺，花色苷被吸附的量越大，隨著酵母菌接種量的增大，總黃酮含量呈先上升后下降的趨勢，整體波動較小，這是由于酵母菌發(fā)酵時分泌的多種胞外酶破壞了藍(lán)靛果細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了黃酮的溶出。當(dāng)酵母菌接種量為1.5%時，總黃酮含量為38.32 mg/L，總酚含量為48.12 mg/L，SOD活力為7 517.2 U/mL。當(dāng)接種量超過1.5%時，總酚含量、SOD活力都呈下降趨勢，這可能是因為酵母菌大量生長繁殖，氧氣和糖消耗殆盡，開始分解有機(jī)酸，致使pH上升，總酚含量和SOD活力下降。

2.2? 酵母菌發(fā)酵溫度對藍(lán)靛果酵素的影響

由圖2可知，在發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵溫度的增加，總酚和花色苷含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。酒精發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇有利于果肉中酚類和花色苷的溶出，發(fā)酵初期，隨著酒精濃度的增加，總花色苷含量顯著增加，總酚質(zhì)量濃度變化不顯著，這可能是單寧類物質(zhì)聚合、酚類物質(zhì)氧化和微生物產(chǎn)生的酶促使多酚類物質(zhì)發(fā)生降解，與王勝利等在獼猴桃酒釀造過程中多酚和抗氧化性的研究結(jié)論相似。隨后由于酵母菌在生長發(fā)酵期間對花色苷進(jìn)行了降解轉(zhuǎn)化，故而總酚和花色苷含量逐漸減少，花色苷的降解還與酵母在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶和發(fā)酵后期酚類物質(zhì)的氧化有關(guān)。

2.3? 醋酸菌添加量對藍(lán)靛果酵素的影響

由圖3可知，藍(lán)靛果在發(fā)酵過程中，隨著醋酸菌添加量的增加，總黃酮、總酚、花色苷含量整體均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在醋酸菌添加量為1%時，總黃酮、總酚、花色苷含量均最大，分別為40.8，11.9，7.9 mg/L，SOD活性最高，為7 997.9 U/mL。當(dāng)繼續(xù)增加醋酸菌添加量時，生物活性物質(zhì)呈現(xiàn)下降趨勢，這是由于隨著醋酸菌添加量的增加，代謝產(chǎn)物隨之增加，阻礙了發(fā)酵的進(jìn)行。

2.4? 醋酸菌發(fā)酵溫度對藍(lán)靛果酵素的影響

由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為34 ℃時，花色苷含量達(dá)到最大值7.17 mg/L，隨后花色苷含量開始下降。這可能是因為隨著溫度的升高，微生物的代謝活動變得越發(fā)旺盛，營養(yǎng)物質(zhì)不再充足，加之花色苷自身并不穩(wěn)定，容易在溫度較高的環(huán)境下降解。在發(fā)酵過程中，隨著溫度的升高，總黃酮含量隨之升高，在34 ℃時達(dá)到最大值41.88 mg/L，隨后開始下降。這可能是由于發(fā)酵溫度過高使酶失活，且溫度過高也會破壞藍(lán)靛果中的活性成分，溫度過高或過低都會導(dǎo)致酶促反應(yīng)不能順利進(jìn)行，溫度過低時也會降低酶的活性，都會導(dǎo)致總黃酮含量降低?？偡雍?、SOD活力在發(fā)酵溫度超過34 ℃后開始下降，可能是因為溫度過高影響醋酸菌的生長，阻礙發(fā)酵進(jìn)行，使總酚含量和SOD活力下降。

2.5? 醋酸菌發(fā)酵時間對藍(lán)靛果酵素的影響

由圖5可知，隨著醋酸菌發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵過程中出現(xiàn)的生物活性物質(zhì)含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在發(fā)酵第6天時達(dá)到峰值，發(fā)酵時間繼續(xù)增加，活性物質(zhì)含量迅速下降，這是代謝產(chǎn)物逐漸增加、單寧類物質(zhì)聚合、活性物質(zhì)被氧化所致。

2.6? 藍(lán)靛果酵素最佳發(fā)酵工藝分析

藍(lán)靛果酵素發(fā)酵工藝配方正交試驗結(jié)果見表3，藍(lán)靛果酵素發(fā)酵工藝配方正交試驗方差分析見表4。

由表3可知，各因素對藍(lán)靛果酵素發(fā)酵工藝感官評分影響的大小順序為A＞C＞B，最優(yōu)條件為A3B2C1，最佳藍(lán)靛果酵素發(fā)酵工藝配方為醋酸菌接種量1.5%、醋酸菌發(fā)酵溫度34 ℃、醋酸菌發(fā)酵時間5 d，此時感官評分為93分，平行3次試驗測得總酚含量為7.63 mg/L，總黃酮含量為38.63 mg/L，花色苷含量為6.56 mg/L，SOD活力為7 539 U/mL。

2.7? 藍(lán)靛果粉掃描電鏡（SEM）微觀結(jié)構(gòu)分析

使用掃描電子顯微鏡觀察藍(lán)靛果原漿、酵母菌發(fā)酵、醋酸菌發(fā)酵后冷凍干燥粉顆粒的表面特性，見圖6。在分析之前對顆粒進(jìn)行噴金處理，放大倍率范圍為200×～10 000×。

注：A為藍(lán)靛果原漿凍干粉，B為酵母菌發(fā)酵后凍干粉，C為醋酸菌發(fā)酵后凍干粉。

由圖6中A可知，未經(jīng)過發(fā)酵的藍(lán)靛果顆粒呈連續(xù)片狀，碎片較少，黏度較大，這可能是果粉中果糖、果膠等物質(zhì)含量較高所致。由圖6中B可知，經(jīng)過酵母菌發(fā)酵后的果粉表面呈現(xiàn)“山巒狀”，表面較疏松，這可能是果粉中的糖分被酵母菌代謝，粉體黏度下降所致。由圖6中C可知，經(jīng)過醋酸菌發(fā)酵后的果粉呈絮狀結(jié)構(gòu)骨架和片狀結(jié)構(gòu)，這可能是由于果粉中糖分進(jìn)一步被代謝，黏度進(jìn)一步下降，使得粉體之間孔隙較多且大，結(jié)構(gòu)疏松，更有利于果粉的溶解和分散。

2.8? 抗氧化性

由表5可知，當(dāng)粉體pH為3.0，5.0，7.0時，隨著貯藏時間的增加，DPPH自由基清除率和SOD活力均下降，在貯藏過程中粉體的抗氧化能力呈現(xiàn)下降趨勢，當(dāng)粉體pH為3.0時，粉體的抗氧化能力隨貯藏時間的增加下降趨勢明顯，損失率較大。當(dāng)pH為5.0時，DPPH自由基清除能力下降較不明顯，SOD活力有所下降。當(dāng)pH為7.0時，粉體的DPPH自由基清除能力和SOD活力均下降。

2.9? 藍(lán)靛果酵素凍干粉加工特性研究

2.9.1? 貯藏溫度對粉體堆密度的影響

堆密度用于反映粉體在加工過程中的填充性，堆密度越大，粉體的填充性越好。由圖7可知藍(lán)靛果酵素凍干粉在貯藏期間堆密度的變化趨勢，粉體的堆密度在貯藏期間緩慢下降，而不同溫度下貯藏的粉體的堆密度差異不大，在貯藏過程中，由于溫度的升高，凍干粉之間水分增多，會團(tuán)聚成大顆粒使空隙增大，導(dǎo)致堆密度減小。因此，低溫條件更適合凍干粉的保存。

2.9.2? 貯藏溫度對粉體滑角和休止角的影響

滑角越小，表明粉體的流動性越好。由圖8中A可知藍(lán)靛果酵素凍干粉在貯藏15 d期間滑角的變化趨勢，粉體滑角的上升趨勢不明顯。休止角是指粉體顆粒堆積層表面在相對靜止的情況下與平面形成的最大夾角，通常情況下休止角越小，表明粉體的流動性越好。由圖8中B可知粉體在貯藏15 d期間休止角的變化趨勢，休止角逐漸上升，但是上升趨勢不明顯。在相同貯藏時間，4 ℃條件下藍(lán)靛果酵素粉體的滑角和休止角均小于25 ℃和37 ℃條件下，所以在低溫條件下貯藏有利于保持藍(lán)靛果酵素粉體的流動性。

3? 總結(jié)

本研究表明酵母菌添加量1.5%、發(fā)酵溫度22 ℃、無氧發(fā)酵10 d，再接種醋酸菌1.5%、發(fā)酵溫度34 ℃、有氧發(fā)酵5 d，此時感官評分最高，為93分，在此條件下平行3次試驗，測得總酚含量為7.63 mg/L，總黃酮含量為38.63 mg/L，花色苷含量為6.56 mg/L，SOD活力為7 539 U/mL，將藍(lán)靛果酵素經(jīng)冷凍干燥避光磨粉，在4，25，37 ℃下測量粉體的加工特性，結(jié)果表明隨著溫度的升高，堆密度、滑角、休止角的變化逐漸加大，在4 ℃時藍(lán)靛果酵素粉的加工特性指標(biāo)最高。

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