摘要：［目的］每年有30 多萬(wàn)噸脲醛用做樹(shù)脂、粘合劑和絕緣材料，由于其降解持久性，此類(lèi)物質(zhì)廢棄后對(duì)環(huán)境造成廣泛的損害。本研究以產(chǎn)紅青霉菌（Penicillium rubens 23229）為對(duì)象，研究其對(duì)脲醛樹(shù)脂（UF）的降解過(guò)程和降解酶的性質(zhì)。［方法］用X?射線(xiàn)衍射（XRD）和失重率評(píng)價(jià)P. rubens 23229 及其酶的降解能力，通過(guò)液相-質(zhì)譜聯(lián)用（LCMS）分析降解過(guò)程中間代謝產(chǎn)物，應(yīng)用凝膠色譜柱對(duì)降解酶進(jìn)行純化。［結(jié)果］P. rubens 23229 作用于UF，30 d 后，材料失重率（降解率）為35%，結(jié)晶度由26. 21% 提升至29. 44%，經(jīng)計(jì)算得出，降解的35% 包括UF 結(jié)晶區(qū)7%，非結(jié)晶區(qū)28%；從菌種和脲醛共培養(yǎng)液中得到P. rubens 23229 脲醛降解粗酶液，其最適作用溫度為50 ℃，最適pH 為4. 0，LC-MS 結(jié)果表明該粗酶液在降解過(guò)程中，首先將高分子UF 主鏈降解，形成四甲基五脲、三甲基四脲等短鏈中間代謝物，然后進(jìn)一步分解中間代謝產(chǎn)物為二氧化碳以及甲醛等終產(chǎn)物，降解作用位點(diǎn)包括脲醛主鏈中亞甲基與尿素間的C-N、酰胺鍵等。進(jìn)一步對(duì)比了P. rubens 23229 粗酶液與商業(yè)脲酶、蛋白酶對(duì)UF 的降解能力，發(fā)現(xiàn)蛋白酶幾乎無(wú)降解效果，脲酶有一定降解能力，但顯著低于P. rubens 23229 粗酶液。粗酶經(jīng)純化后降解效率提高28 倍，凝膠滲透色譜（GPC）顯示出分子量為6. 89 kD 和220. 83 kD 的2 個(gè)峰，對(duì)應(yīng)前面降解過(guò)程分析，說(shuō)明降解過(guò)程包含主鏈降解酶和中間代謝物降解酶至少2 種酶的復(fù)合體系共同發(fā)揮作用。［結(jié)論］P. rubens 23229 脲醛降解酶由主鏈降解酶和中間代謝物降解酶共同組成，其中包含脲酶作用類(lèi)似的酶，但降解主鏈的酶與已有蛋白酶作用方式不同，其具體的組成與性質(zhì)有待于進(jìn)一步研究。本研究對(duì)UF 的生物降解具有一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：脲醛樹(shù)脂； P. rubens 23229； 脲醛降解酶； 生物降解

中圖分類(lèi)號(hào)：Q89；Q939.96 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-8151（2024）03-0099-09

脲醛樹(shù)脂（UF）是由尿素和甲醛聚合而成的高分子材料，其主鏈連接鍵為酰胺鍵以及C-N［1-3］，其中酰胺鍵結(jié)構(gòu)類(lèi)似于蛋白質(zhì)中的肽鍵。甲醛與尿素的比例不同，聚合反應(yīng)后會(huì)形成三維交聯(lián)和線(xiàn)性2 種結(jié)構(gòu)的過(guò)渡結(jié)構(gòu)，甲醛比例高更傾向于交聯(lián)結(jié)構(gòu)，而尿素比例高更傾向于線(xiàn)性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致UF 在硬度、絕緣性、結(jié)晶度等性能方面存在一定的差異［4-5］，從而使得UF 具有廣泛的用途。每年有30 多萬(wàn)噸脲醛用做樹(shù)脂、粘合劑和絕緣材料［6］。由于其降解持久性，這些樹(shù)脂產(chǎn)品廢棄后對(duì)環(huán)境造成廣泛的損害。2016 年的《國(guó)家危險(xiǎn)廢物名錄》已明確將廢UF 等樹(shù)脂類(lèi)廢物列為第13 類(lèi)危險(xiǎn)廢棄物［7］。

隨著UF 用量的增加，其降解性能逐漸成為研究熱點(diǎn)［8］。焚燒是世界范圍內(nèi)經(jīng)常使用的有機(jī)廢物處理技術(shù)，但運(yùn)營(yíng)成本高，且會(huì)產(chǎn)生大量空氣污染物［9］。熱解可以將UF 轉(zhuǎn)化為高價(jià)值的燃料或化學(xué)產(chǎn)品，但在廢氣中通常存在有毒含氮?dú)怏w，如一氧化氮、異氰酸等，且熱解要求材料干燥，處理成本較高［10-12］。水解UF 的過(guò)程中需要鹽酸或過(guò)氧化氫等化學(xué)試劑的參與，且降解后會(huì)留下含有甲醛的廢液［7］。因此迫切需要開(kāi)發(fā)環(huán)境友好的回收利用和降解脲醛的方式，利用微生物降解UF 作為一種清潔技術(shù)，具有環(huán)境安全、成本效益和不產(chǎn)生二級(jí)廢物的優(yōu)點(diǎn)，因而越來(lái)越受到重視［13-15］。

作為人工合成的有機(jī)高分子聚合物，UF 的降解過(guò)程可以參考聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯等塑料制品。有機(jī)高分子聚合物的降解過(guò)程，通常分為幾個(gè)階段，首先，材料通過(guò)機(jī)械、光、熱、酸堿等理化作用降解成微粒及較低分子量的聚合物，然后進(jìn)一步由理化作用或微生物參與徹底代謝為二氧化碳、水及生物質(zhì)［16］，如果微生物無(wú)法徹底代謝或代謝速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于產(chǎn)生速度，塑料微粒則經(jīng)由海洋、土壤等環(huán)境在生物鏈中逐步累積，造成巨大危害［17］。篩選能降解塑料微粒或有機(jī)大分子化合物的微生物成為解決問(wèn)題的關(guān)鍵，其生物降解過(guò)程及作用機(jī)制也是研究熱點(diǎn)。

通常隨著UF 分子量增大，交聯(lián)度和結(jié)晶度增高，UF 抗生物降解性增加。目前對(duì)UF 生物降解的研究較少。Jahns 等［18］采用從Rhodococcus、Burkholderia 等細(xì)菌中純化到能降解亞甲基脲（MDU）、異丁烯二脲（IDU）等脲醛小分子中間代謝物的降解酶，提出了亞甲基脲的降解途徑，該過(guò)程包含1 個(gè)MDUase（EC3. 5. 1. 21），其分子量為189 kD，可以將亞甲基脲水解逐步脫氨基、脫羧，代謝為尿素和甲醛。本實(shí)驗(yàn)室［19］設(shè)計(jì)了1 種以含磷、鉀的脲醛肥料為唯一碳源和氮源的篩選培養(yǎng)基，首次篩選到降解脲醛緩釋肥料的真菌產(chǎn)紅青霉菌（Penicillium rubens 23229）。

熱解是脲醛主鏈降解為小分子聚合物的1 個(gè)途徑，為了研究脲醛主鏈的生物降解，實(shí)驗(yàn)對(duì)脲醛材料進(jìn)行熱處理后得到相對(duì)耐熱的脲醛材料，發(fā)現(xiàn)P. rubens 23229 可以針對(duì)耐熱脲醛進(jìn)行降解，說(shuō)明P. rubens 23229 可以降解脲醛緩釋肥的主鏈。但是其降解過(guò)程和降解酶性質(zhì)尚不明確［19］。此外，P. rubens 23229 篩選中用到的脲醛肥料含磷酸根基團(tuán)，易成為主鏈降解的突破點(diǎn)。廢棄UF通常不含磷酸根基團(tuán)，且結(jié)晶度和硬度相對(duì)較高，其主鏈尤其不易被生物降解。P. rubens 23229 對(duì)不含磷酸根基團(tuán)的UF 是否有降解能力，能否在廢棄UF 的生物降解中發(fā)揮作用，仍不得而知。針對(duì)以上問(wèn)題，本文通過(guò)分析降解效率及中間代謝產(chǎn)物，探究P. rubens 23229 對(duì)結(jié)晶度相對(duì)較高的UF的降解過(guò)程及降解酶性質(zhì)。

1 材料與方法

1. 1 試劑與儀器

試劑：脲醛樹(shù)脂（UF）以尿素和甲醛（1. 5∶1）為原料酸催化制備，山西省高分子復(fù)合材料工程技術(shù)研究中心制備；葡聚糖凝膠G-50，索萊寶科技有限公司；脲酶（1. 7 eU·mg-1），上海邁坤化工有限公司；胃蛋白酶（1200 U·g-1），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器：立式壓力蒸汽滅菌器，BXM-30R（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，上海）；凈化工作臺(tái)，SW-CJ-2FD（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，上海）；X-射線(xiàn)衍射儀，MiniFlex600（日本理學(xué)公司，日本）；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，LCMS-8050（島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司，日本）；凝膠滲透色譜，Agilent 1260（安捷倫科技有限公司，美國(guó)）。

1. 2 耐熱UF 的制備

參照王芳等［19］方法處理UF，將處理后的UF于40 ℃干燥箱中烘干，備用。

1. 3 P. rubens 23229 的培養(yǎng)及降解酶液的制備

用脲醛培養(yǎng)基［19］培養(yǎng)P. rubens 23229，其中脲醛緩釋肥改用UF，按2% 的含量接種P. rubens23229，在28 ℃ 、100 rpm 的水浴搖床中培養(yǎng)。取P. rubens 23229 與UF 共培養(yǎng)液，用1 張中速濾紙過(guò)濾，棄去濾渣，在4000 rpm 條件下離心20 min，離心上清液即為P. rubens 23229 降解粗酶液。

1. 4 P. rubens 23229 對(duì)UF 的降解分析

脲醛培養(yǎng)基與P. rubens 23229 共培養(yǎng)，每隔3 d 取1 次混勻的培養(yǎng)液樣品，加入200 mL 去離子水，在溫度為100 ℃的條件下，恒溫水浴鍋中攪拌30 min，隨后用1 張快速濾紙過(guò)濾，棄去濾液。加入200 mL 去離子水重懸，用0. 45 μm 的濾膜抽濾，棄去濾液。將剩余的脲醛樹(shù)脂于40 ℃干燥箱中烘干24 h，計(jì)算材料失重率，公式如下：

M =（m1 - m2）／m1

式中，M：失重率；m1：降解前材料質(zhì)量，g；m2：降解后材料質(zhì)量，g。

1. 5 X?射線(xiàn)衍射分析

利用X - 射線(xiàn)衍射儀（XRD）分別對(duì)UF、經(jīng)100 ℃熱處理后的UF 和進(jìn)一步經(jīng)P. rubens 23229共培養(yǎng)30 d 后的UF 的晶型進(jìn)行表征。掃描角度范圍為10～80 °，掃描速度為1 °·min-1。材料結(jié)晶度由MDI jade 6 和HighScore Plus 分析得出。

1. 6 降解酶性質(zhì)研究

1. 6. 1 最適溫度及溫度穩(wěn)定性

量取10 mL 降解酶液，加入1 g UF，分別在10、20、30、40、50、60、75 ℃條件下，培養(yǎng)36 h，測(cè)定甲醛含量及其失重率。

1. 6. 2 最適pH 及pH 穩(wěn)定性

分別取10 mL 降解酶液，分別調(diào)節(jié)其pH 為2、3、4、5、6、7、8、9，加入1 g UF，常溫條件下培養(yǎng)36 h，測(cè)定甲醛含量及其失重率。

1. 7 不同酶降解性能比較

分別取10 mL 去離子水、10 mL P. rubens23229 降解酶液、10 mL 去離子水加50 mg 蛋白酶、10 mL 降解酶液加50 mg 脲酶、10 mL 去離子水加50 mg 脲酶，加入1 g UF，在常溫條件下降解24 h，測(cè)定甲醛含量及其失重率。

1. 8 降解中間代謝產(chǎn)物的HPLC-MS 分析

P. rubens 23229 降解粗酶液處理UF，15 d 后取上清液，過(guò)0. 22 μm 水系過(guò)濾膜，取過(guò)濾液進(jìn)行高效液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）分析。HPLC 條件：采用色譜柱（Waters C18 1. 7 μm，2. 1×100 mm）分離溶液，流動(dòng)相甲醛-水溶液（體積比為9∶1），柱溫為40 ℃ ，流速0. 75 mL·min-1。柱的末端引入質(zhì)譜儀，MS 條件：ESI+離子源，掃描模式為正離子，接口電壓為4. 0 kV，接口溫度為400 ℃，檢測(cè)器電壓為1. 76 kV，IG 真空度為2. 0×10-3 Pa，PG 真空度為1. 3×102 Pa，CID 氣為2. 7×105 Pa，掃描范圍為50～400 m·z-1。

1. 9 酶的提取與純化

使用Sephadex G-50 對(duì)降解粗酶液進(jìn)行凝膠柱色譜層析，流加速度1 mL·min-1，每10 mL 收集1 管，檢測(cè)其酶活變化，取純化酶液中活性較高的進(jìn)行進(jìn)一步純化，重復(fù)凝膠柱色譜層析。酶活計(jì)算如下：

酶的活力：每24 h 每毫克酶降解UF 產(chǎn)生1 mg甲醛為1 個(gè)單位（U）

U =m1／m2

式中，U：酶的活力；m1：甲醛生成量，mg；m2：酶的質(zhì)量，mg。

1. 10 凝膠滲透色譜分析

取純化后的酶液進(jìn)行真空冷凍干燥，將干燥后的粉末溶于水，過(guò)0. 22 μm 的濾膜，采用色譜柱（PL aquagel-OH 8 μm），檢測(cè)器為RI 檢測(cè)器、MLLS 激光光散射檢測(cè)器，以聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷為標(biāo)準(zhǔn)品，采用PTEF 0. 22 μm 針筒過(guò)濾頭，進(jìn)樣量50 μL，流速1 mL·min-1。

1. 11 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值并進(jìn)行方差分析，運(yùn)用單因素方差分析（ANOVA）中的最小顯著性差異（LSD）法進(jìn)行顯著性差異分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2019 和Origin 2021 軟件整理和作圖，采用SPSS 20. 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 P. rubens 23229 對(duì)UF 的降解性能

采用共培養(yǎng)體系研究P. rubens 23229 對(duì)熱處理后UF 的降解作用。脲醛材料經(jīng)熱處理后，去除了在合成及存儲(chǔ)過(guò)程中由熱引起的易自動(dòng)降解的短鏈小分子部分，因此熱處理后的材料更便于研究UF 長(zhǎng)鏈大分子的生物降解。從圖1 可以看出，隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，P. rubens 23229 以較為均一的速度對(duì)UF 進(jìn)行降解，30 d 之后，材料失重率達(dá)到35%；對(duì)照組的無(wú)菌體系經(jīng)過(guò)30 d 后，材料失重率為15%。結(jié)果表明，UF 在28 ℃實(shí)驗(yàn)條件下存在非生物性降解，加入P. rubens 23229 則可以在此基礎(chǔ)上疊加生物降解作用，降解效率加倍。

2. 2 降解粗酶液性質(zhì)研究

2. 2. 1 最適溫度及溫度穩(wěn)定性

如圖2 所示，在10～50 ℃范圍內(nèi)，降解酶隨作用溫度升高，降解效率增加，超過(guò)50 ℃，降解效率下降。說(shuō)明該降解粗酶液最適工作溫度為50 ℃左右。50 ℃條件下，降解36 h 后UF 失重率為11%。對(duì)比圖1 中P. rubens 23229 菌與脲醛共培養(yǎng)條件下72 h 失重率只有3% 左右。分析其原因，P. ru?bens 23229 為青霉菌，其最適生長(zhǎng)溫度在28 ℃ 左右，此溫度下酶處理UF 的失重率為50 ℃的18%，不能高效發(fā)揮其降解作用。由于溫度的限制，單純應(yīng)用活菌共培養(yǎng)對(duì)材料進(jìn)行降解不能發(fā)揮最優(yōu)效果；然而，從共培養(yǎng)液中提取出來(lái)的粗酶液則可以通過(guò)提高作用溫度達(dá)到UF 降解酶的最佳作用溫度，提高降解效率，表明從菌培養(yǎng)液中提取降解酶是提高生物降解效率的1 個(gè)有效途徑。

2. 2. 2 最適pH 及pH 穩(wěn)定性

在初始pH 4. 0 條件下，降解酶液在36 h 降解了7% 的UF，同時(shí)產(chǎn)生了2. 998 mg·mL-1 含量的甲醛，其降解效率遠(yuǎn)高于其它pH 條件。如圖3 所示，結(jié)果表明，酶工作的最適pH 在4. 0 左右。UF的降解包括將高分子主鏈降解為中間代謝物，然后徹底降解為甲醛和二氧化碳等小分子物質(zhì)的過(guò)程，因此，從菌和材料共培養(yǎng)液中提取出來(lái)脲醛降解粗酶液中可能至少包含主鏈降解酶和中間代謝物降解酶2 類(lèi)降解酶。從圖3 可以看出，除在pH 4處同時(shí)產(chǎn)生失重率和甲醛含量2 個(gè)最高值峰外，在pH 8 左右失重率又有1 個(gè)小峰，但甲醛含量沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的小峰，說(shuō)明此時(shí)UF 主鏈降解為可溶性物質(zhì)，導(dǎo)致失重率增加，但是沒(méi)有進(jìn)一步降解為甲醛。進(jìn)一步分析，可以得到以下結(jié)論：1）粗酶液中的主鏈降解酶在pH 4 活性最高，此外在pH 8 左右活性也比較高，它可以降解脲醛主鏈，使高聚合度的大分子不溶物含量下降，形成較多可溶性中間代謝物；2）將中間代謝物進(jìn)一步降解為小分子物質(zhì)，如甲醛的中間代謝物降解酶在pH 4 活性最高，在其它pH 值，包括pH 8 時(shí)活性較差；3）主鏈降解酶和中間代謝物降解酶協(xié)同作用降解UF，后者的低效率影響脲醛的徹底降解。

2. 3 不同酶降解性能比較

UF 以甲醛與尿素合成，連接鍵為酰胺鍵以及C-N，其中酰胺鍵結(jié)構(gòu)類(lèi)似于蛋白質(zhì)中的肽鍵。從酰胺鍵及尿素水解的角度考慮，蛋白酶及脲酶也有可能降解UF，為此本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了常用的蛋白酶胰蛋白酶、脲酶與P. rubens 23229 脲醛降解酶的降解性能。如圖4 所示，胰蛋白酶處理組與蒸餾水對(duì)照組無(wú)顯著差異，說(shuō)明胰蛋白酶沒(méi)有UF 降解活性。分析其原因，蛋白酶作用位點(diǎn)與蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)及氨基酸殘基相關(guān)，雖然UF 主鏈連接鍵酰胺鍵類(lèi)似于蛋白質(zhì)肽鍵，但缺乏蛋白酶作用的高級(jí)結(jié)構(gòu)與氨基酸殘基，因此蛋白酶并不能水解UF。因此，P. rubens 23229 脲醛降解酶可能是菌體在脲醛環(huán)境中誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性分解酶。與蛋白酶不同，脲酶對(duì)UF 產(chǎn)生較好的降解效果，其失重率為P. rubens 23229 脲醛降解酶的20%，甲醛產(chǎn)生量為34%，這一結(jié)果說(shuō)明P. rubens 23229 脲醛降解酶含有類(lèi)似于脲酶作用方式的中間代謝物降解酶，它可以將主鏈降解下來(lái)的中間代謝物降解為甲醛等小分子產(chǎn)物并促進(jìn)降解的順利進(jìn)行。為了進(jìn)一步驗(yàn)證脲醛中間代謝物降解酶的作用，在P. rubens 23229 脲醛降解酶中加入脲酶進(jìn)行UF 的降解，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示疊加脲酶后，其失重率是單獨(dú)P. rubens 23229 脲醛降解酶的107%，甲醛產(chǎn)生量是其110%，說(shuō)明脲酶的加入增強(qiáng)了中間代謝物降解酶的作用，提高了甲醛的產(chǎn)量，同時(shí)由于中間代謝物減少，產(chǎn)物抑制減少，主鏈降解酶的作用也相應(yīng)增加，體現(xiàn)在失重率也相應(yīng)增加。

2. 4 降解前后UF 的X-射線(xiàn)衍射

P. rubens 23229 降解前后UF 的X-射線(xiàn)衍射圖如圖5，結(jié)晶度計(jì)算結(jié)果表明，未進(jìn)行處理的樣品結(jié)晶度為25. 18%，經(jīng)熱處理后樣品的結(jié)晶度為26. 21%，說(shuō)明100 ℃熱處理導(dǎo)致非結(jié)晶區(qū)的一部分被降解去除，處理后的材料具有一定的耐熱降解性。經(jīng)熱處理的UF 經(jīng)P. rubens 23229 共培養(yǎng)后其結(jié)晶度進(jìn)一步增加為29. 44%，失重率為35%，結(jié)合失重率及結(jié)晶度提高可以計(jì)算得出，UF 35% 的失重率中7% 為UF 結(jié)晶區(qū)，28% 為非結(jié)晶區(qū)［10］。非結(jié)晶區(qū)由于不規(guī)則排列，物理和化學(xué)性質(zhì)相對(duì)不穩(wěn)定，較易生物降解，高分子材料降解通常從非結(jié)晶區(qū)開(kāi)始。結(jié)晶區(qū)排列緊密，通常較難生物降解。結(jié)果說(shuō)明P. rubens 23229 降解酶除了降解非結(jié)晶區(qū)，對(duì)結(jié)晶區(qū)規(guī)則排列的脲醛分子也進(jìn)行了一部分的降解。目前對(duì)高分子材料生物降解的報(bào)道多為對(duì)低結(jié)晶區(qū)的降解，如2016 年Science 期刊報(bào)道了對(duì)結(jié)晶度1. 6% 的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯薄膜的生物降及降解酶研究［16］。26%以上結(jié)晶度UF 的生物降解尚未見(jiàn)報(bào)道。

2. 5 HPLC-MS 分析降解過(guò)程

P. rubens 23229 降解粗酶液與UF 共培養(yǎng)后，取上清液進(jìn)行HPLC-MS 分析，從圖6 可以看出，與蒸餾水處理的對(duì)照組相比，上清液中出峰數(shù)量增加，新出現(xiàn)了③、⑦、⑧、⑨、⑩、?對(duì)應(yīng)的峰，說(shuō)明加入P. rubens 23229 降解粗酶液后可溶性代謝物種類(lèi)增加，增加的代謝物為P. rubens 23229 酶切產(chǎn)物。此外，與對(duì)照組相比，酶處理組① 、② 、④、⑤、⑥對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度有大幅增加，說(shuō)明酶的加入促進(jìn)或疊加了原有UF 的理化降解?；诜鍖?duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖分析出UF 降解形成的中間代謝產(chǎn)物，其中⑥號(hào)峰對(duì)應(yīng)的m/z 值為205，對(duì)應(yīng)的降解中間代謝物為二甲基三脲，⑨ 號(hào)峰對(duì)應(yīng)的m/z 值為277，對(duì)應(yīng)的降解中間代謝物為三甲基四脲。其它中間代謝物包括：亞甲基二脲、三甲基二脲、三甲基三脲、四甲基四脲、四甲基五脲等?；谥虚g代謝物的解析，分析在主鏈降解過(guò)程中降解酶的酶切位點(diǎn)主要涉及-CH2-NH-中C-N 的斷裂（a）、酰胺鍵中C-N 的斷裂（b）以及-CH2-NH-中脫氨基反應(yīng)，基于中間代謝物及降解酶性質(zhì)分析，結(jié)合Jahns 等［18］ 報(bào)道的MDUase，繪制的P. rubens23229 酶主導(dǎo)的UF 降解過(guò)程見(jiàn)圖7。

2. 6 酶的純化

為了進(jìn)一步研究酶的性質(zhì)，應(yīng)用凝膠柱色譜層析對(duì)P. rubens 23229 降解粗酶液進(jìn)行多次純化，結(jié)果如圖8 所示。以降解酶液的酶活作為純化物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，最初粗酶酶活力為1. 02 U，層析純化4 次后，酶活力達(dá)到28. 86 U，第5 次純化后，酶活力為29. 96 U，與第4 次純化后無(wú)顯著差異。經(jīng)過(guò)凝膠層析4 次后，酶活力較為穩(wěn)定，純化后酶的降解效率是粗酶的28 倍。

2. 7 凝膠滲透色譜

應(yīng)用凝膠滲透色譜對(duì)純化后的酶進(jìn)行分子量的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖9。純化后的酶主要呈現(xiàn)2 個(gè)峰，第1 個(gè)峰（P1）相對(duì)分子量為220. 83 kD，PDI 值為1. 138；第2 個(gè)峰（P2）相對(duì)分子量為6. 89 kD，PDI值為1. 034。從圖形來(lái)看，P1 仍然包含1 個(gè)以上的物質(zhì)，可應(yīng)用相應(yīng)的凝膠柱進(jìn)一步純化。已有分子量分布結(jié)果說(shuō)明在降解過(guò)程中，P. rubens 23229酶為至少由2 個(gè)酶組成的復(fù)合酶。

3 結(jié)論

以P. rubens 23229 及其分泌的酶對(duì)UF 進(jìn)行降解，對(duì)降解酶及降解過(guò)程中中間代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。凝膠滲透色譜分析顯示P. rubens 23229 脲醛降解酶包含分子量為6. 89 kD 和220. 83 kD 的2個(gè)峰，表明P. rubens 23229 脲醛降解酶至少為2 個(gè)酶蛋白組成的復(fù)合酶，從功能可分為主鏈降解酶和中間代謝物降解酶，主鏈降解酶首先將脲醛主鏈降解為四甲基五脲、三甲基四脲等短鏈中間代謝物，然后由中間代謝物降解酶進(jìn)一步降解為甲醛、二氧化碳等終產(chǎn)物，酶作用位點(diǎn)包括脲醛主鏈中亞甲基與尿素間的C-N、酰胺鍵等。進(jìn)一步研究表明P. rubens 23229 脲醛降解酶中有1 種酶作用方式與脲酶相似，但降解主鏈酰胺鍵的酶與已有的蛋白酶作用方式不同。粗酶作用的最適溫度為50 ℃，最適pH 為4，在最適條件下酶的降解效率遠(yuǎn)高于菌體最適生長(zhǎng)條件的降解效率，因此以酶來(lái)進(jìn)行生物降解效率更高。粗酶液經(jīng)凝膠色譜純化后酶活力提高了28 倍，其具體的組成與性質(zhì)有待進(jìn)一步研究。本研究對(duì)UF 的生物降解具有一定的參考價(jià)值。

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（編輯：郭玥微）

基金項(xiàng)目：中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金項(xiàng)目（YDZJSX2021B007）；山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（202302040201007）；納米功能復(fù)合材料山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金（NFCM202003）；山西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村領(lǐng)域“六新”項(xiàng)目；山西省高分子緩控釋肥料重點(diǎn)研發(fā)中心