摘 要 以耐旱性差異較大的秈稻RT和秈稻SC及其雜交構(gòu)建的第10代RIL群體為材料，使用濃度10% PEG-6000溶液模擬干旱環(huán)境處理7 d，采用相關(guān)性分析、主成分分析、聚類分析等方法對(duì)萌發(fā)期間水稻種子根、芽相關(guān)萌發(fā)特性、生長(zhǎng)特性與根系形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析與QTL定位。結(jié)果表明：各萌發(fā)特性呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.24～0.95，其中根干重與根鮮重的相關(guān)性最強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)為0.95；聚類分析結(jié)果表明：可以將246個(gè)株系分為3大類群，第I類長(zhǎng)勢(shì)最好。通過(guò)復(fù)合區(qū)間作圖法共檢測(cè)到20個(gè)與水稻萌發(fā)期相關(guān)的耐旱性狀QTL，分布于水稻的3號(hào)、4號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、11號(hào)和12號(hào)染色體上，對(duì)數(shù)幾率比（LOD）值為2.01～4.45，解釋的表型貢獻(xiàn)率為3.38%～7.35%。7號(hào)染色體上的RM481-RM5100標(biāo)記區(qū)間可同時(shí)影響水稻發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。8號(hào)染色體RM5887-RM6155標(biāo)記區(qū)間可同時(shí)檢測(cè)到控制根與芽鮮重的位點(diǎn)，說(shuō)明該區(qū)間可同時(shí)影響多個(gè)鮮重性狀，表現(xiàn)為緊密連鎖或一因多效。

關(guān)鍵詞 水稻種子；耐干旱；RIL群體；QTL定位

中圖分類號(hào)：S335 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.09.001

水稻（Oryza sativa L.）是最主要的糧食作物之一，全世界超過(guò)一半的人口都以稻米為主食[1]。水稻生產(chǎn)的耗水量非常大，約消耗淡水資源的50%，占農(nóng)業(yè)用水量的70%左右[2]。傳統(tǒng)灌溉水稻生產(chǎn)方式，加劇了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與水資源短缺的矛盾，使得干旱已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中影響作物生產(chǎn)與產(chǎn)量最主要的非生物脅迫因素之一[3]。

遺傳研究表明，水稻的耐旱性狀是一個(gè)復(fù)雜的、由多基因控制的數(shù)量性狀，具有復(fù)雜的遺傳背景與分子調(diào)控機(jī)制[4-5]。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展與高密度遺傳圖譜的建立，許多控制水稻在不同脅迫環(huán)境下生長(zhǎng)的QTL已經(jīng)通過(guò)連鎖圖譜鑒定出來(lái)，不同的水稻群體已經(jīng)被用于QTL定位分析。目前已有的Meta分析共記錄了來(lái)自27個(gè)遺傳圖譜的653個(gè)水稻耐旱QTL。收集的QTL包括與水稻響應(yīng)干旱的13個(gè)性狀相關(guān)的QTL，即株高、根、葉和種子等[6]。聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）模擬干旱環(huán)境處理是研究萌芽期和苗期耐旱性常用的方法，高分子量的聚乙二醇（PEG-4000～8000）不易被植物吸收，可以改變營(yíng)養(yǎng)液的滲透勢(shì)，引起植物水分虧缺[7]。

本研究以耐旱性差異較大的秈稻RT和秈稻SC及其雜交構(gòu)建的第10代RIL群體為材料，在干旱脅迫條件下（使用濃度10% PEG-6000溶液模擬干旱環(huán)境），測(cè)量種子萌發(fā)期間表型性狀及相關(guān)生理指標(biāo)，以175個(gè)RT F10代自交系為作圖群體進(jìn)行QTL定位分析。為了更進(jìn)一步篩選水稻耐干旱候選基因，將RT和SC種子萌發(fā)期間RNA序列與QTL定位基因結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合分析，輔助水稻耐旱新品種選育，為開發(fā)理想類型的標(biāo)記輔助育種提供可行方案。

1" 材料與方法

1.1" 材料

以秈型水稻重組自交系群體（F10）及其親本為供試材料。該RIL群體以秈稻SC為母本、秈稻RT為父本，二者雜交得到F1代，F(xiàn)1代植株套袋自交得到F2代，再采用單籽粒傳法，衍生得到F10代，其中F10代RIL群體共包含246個(gè)株系。

1.2" 方法

1.2.1" 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2022年7月在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。發(fā)芽實(shí)驗(yàn)設(shè)置在溫度26 ℃，光照強(qiáng)度10 000 Lx培養(yǎng)箱中進(jìn)行。發(fā)芽期間每個(gè)處理重復(fù)4次，每次重復(fù)25粒，具體方法如下：

前期通過(guò)不同濃度聚乙二醇（PEG-6000）發(fā)芽預(yù)備實(shí)驗(yàn)，最后確定了濃度為10%的PEG-6000為最佳模擬干旱脅迫濃度，能夠使大部分品種受到明顯脅迫又不致死。從親本與F10代中精選均一飽滿的健康水稻種子，經(jīng)濃度為5%的NaClO（次氯酸鈉）溶液浸泡消毒20 min后，用去離子水反復(fù)沖洗3～4次，然后將其置于去離子水中浸泡24 h后（約12 h換1次浸泡液，37 ℃），將種子均勻地播種于鋪有發(fā)芽紙的發(fā)芽盒中，每皿添加7 mL濃度為10%的PEG-6000溶液，每播種25粒為1個(gè)重復(fù)，每處理設(shè)4個(gè)重復(fù)。

將種子置于光照培養(yǎng)箱中，光照強(qiáng)度為10 000 lx，相對(duì)濕度70%，光照14 h黑暗10 h。在水稻種子萌發(fā)期間，每天觀察記錄萌發(fā)種子數(shù)。在種子培養(yǎng)第3 d時(shí)，計(jì)算發(fā)芽勢(shì)（當(dāng)胚根伸長(zhǎng)到與種子等長(zhǎng)，胚芽伸長(zhǎng)到種子長(zhǎng)度的一半時(shí)，稱為發(fā)芽），連續(xù)3 d發(fā)芽種子數(shù)不足供試種子的1%則發(fā)芽結(jié)束，計(jì)算種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等。在第7 d精確測(cè)量根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根粗、芽粗、根鮮重、芽鮮重、根干重、芽干重指標(biāo)。

1.2.2" 性狀調(diào)查

1）水稻種子萌發(fā)特性的測(cè)定

種子發(fā)芽勢(shì)=（第3 d時(shí)的種子發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù)）×100%

種子發(fā)芽率=（第7 d時(shí)的種子發(fā)芽總數(shù)/種子總數(shù)）×100%

2）水稻種子根和芽生長(zhǎng)的測(cè)定

在水稻種子萌發(fā)至第7 d后，將幼苗用蒸餾水清洗干凈，然后用濾紙將其表面殘留水分吸取干凈。隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的20株水稻幼苗，用游標(biāo)卡尺測(cè)量其胚根和胚芽的寬度及長(zhǎng)度，用分析天平稱其中10株胚根和胚芽的鮮重和干重，重復(fù)4次。

1.2.3" 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，運(yùn)用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Origin 2021繪圖。

1.2.4" 連鎖圖譜構(gòu)建與QTL定位

利用Windows QTL Cartographer 2.5結(jié)合前人建立的分子標(biāo)記連鎖圖譜，檢測(cè)發(fā)芽特性相關(guān)QTL，并計(jì)算貢獻(xiàn)率、加性效應(yīng)等。QTL命名遵循McCouch等的原則[8]，將LOD＞2.0的位點(diǎn)作為得到的QTL結(jié)果，將這些位點(diǎn)整理在一起制作成表格。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 親本水稻種子耐干旱能力的表型鑒定

由圖1和表1水稻種子耐干旱萌發(fā)性狀（發(fā)芽率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根粗、芽粗）的表型結(jié)果可知，親本SC發(fā)芽率為80%，根長(zhǎng)為2.67 cm，芽長(zhǎng)為1.94 cm，根粗為0.48 cm，芽粗為0.93 cm，分別是親本RT的1.10、2.38、1.19、1.06、1.02倍。在干旱脅迫條件下，兩親本間表型差異較大、萌發(fā)能力有顯著差異，且親本SC比親本RT種子的萌發(fā)能力更強(qiáng)。RIL群體中各表型性狀變異豐富，變異系數(shù)為24.05%～107.04%。芽粗的變異系數(shù)最小，為24.05%。發(fā)芽勢(shì)的變異系數(shù)最大，為107.04%。發(fā)芽率的分布范圍廣，為0～100%。從圖2可知，芽長(zhǎng)、根粗、芽粗、芽干重、芽鮮重的分布頻率均表現(xiàn)為連續(xù)性變異的正態(tài)分布，說(shuō)明SC與RT非常適合作為水稻種子耐干旱萌發(fā)性狀QTL定位群體的親本，其后代多態(tài)性較高，可以為QTL定位提供豐富的試驗(yàn)材料。

2.2" 水稻種子耐干旱萌發(fā)性狀的相關(guān)性分析

對(duì)RIL群體的根、芽相關(guān)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，由圖3可知，各性狀間均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.21～0.95，其中，芽干重與芽鮮重的相關(guān)性最強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)為0.95；牙鮮重與根粗相關(guān)性最弱，為0.21。

2.3" 水稻種子耐干旱萌發(fā)性狀的主成分分析

把RIL群體的耐干旱萌發(fā)相關(guān)性狀進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如表2。由表2可知，第1主成分貢獻(xiàn)率為62.66%，它的主要作用因子是芽長(zhǎng)、芽干重，載荷值分別為0.358 07、0.353 97，累計(jì)貢獻(xiàn)率為82.54%、99.73%。第2主成分貢獻(xiàn)率為11.3%，根粗是該主成分中最主要的作用因子，載荷值為0.606 04，累計(jì)貢獻(xiàn)率為90.53%，發(fā)芽率對(duì)該主成分貢獻(xiàn)小。

2.4" 水稻RIL群體耐旱性相關(guān)性狀的聚類分析

基于耐干旱性狀的表型值對(duì)RIL群體的246個(gè)株系進(jìn)行聚類分析，如表3，第Ⅰ類群包括37份材料，其中發(fā)芽率為89%，發(fā)芽勢(shì)為35%，根長(zhǎng)為4.44 cm，芽長(zhǎng)為3.66 cm，芽粗為1.07 mm，耐旱性相關(guān)性狀均值在3大類群中排名首位，此類群水稻種子長(zhǎng)勢(shì)最好。第Ⅱ類群包括117份材料，其中發(fā)芽率為35%，發(fā)芽勢(shì)僅為11%，根長(zhǎng)為0.81 cm、芽長(zhǎng)為1.11 cm，在3大類群中排名第3位，此類群水稻種子長(zhǎng)勢(shì)較差。第Ⅲ類群包括109份材料，其中發(fā)芽率為80%，發(fā)芽勢(shì)為26%，根長(zhǎng)為2.90 cm，芽長(zhǎng)為2.14 cm，在3大類群中排名中等，此類群水稻種子長(zhǎng)勢(shì)中等。

2.5" 水稻RIL群體耐旱性相關(guān)性狀的QTL定位分析

水稻耐干旱性狀的QTL定位結(jié)果如表4。共檢測(cè)到20個(gè)相關(guān)QTL位點(diǎn)，分布在3號(hào)、4號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、11號(hào)和12號(hào)染色體上，LOD值為2.01～4.45，解釋的表型貢獻(xiàn)率為3.38%～7.35%。檢測(cè)到4個(gè)控制發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)的QTL位點(diǎn)，位于第3號(hào)、7號(hào)、8號(hào)染色體上，分別能解釋4.10%～6.38%的表型變異，其在7號(hào)染色體上加性效應(yīng)為負(fù)，其增效等位基因來(lái)自親本RT；在第3號(hào)和第8號(hào)染色體上加性效應(yīng)為正，增效等位基因來(lái)自親本SC。7號(hào)染色體上的RM481-RM5100標(biāo)記區(qū)間可同時(shí)影響水稻發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，表現(xiàn)為緊密連鎖或一因多效。

檢測(cè)到2個(gè)控制根長(zhǎng)的QTL位點(diǎn)，位于第3號(hào)染色體的RM6349-RM4108標(biāo)記區(qū)間和12號(hào)染色體的RM19-RM247標(biāo)記區(qū)間，分別解釋7.35%和5.93%的表型變異，加性效應(yīng)為負(fù)，其增效等位基因均來(lái)自親本RT。檢測(cè)到3個(gè)控制芽長(zhǎng)的QTL位點(diǎn)，位于第7染色體的RM481-RM5100標(biāo)記區(qū)間、8號(hào)染色體的RM5887-RM6155標(biāo)記區(qū)間和11號(hào)染色體的RM332-RM5599標(biāo)記區(qū)間，分別能解釋5.66%、6.65%和3.89%的表型變異，其在7號(hào)染色體和11號(hào)染色體上加性效應(yīng)為負(fù)，其增效等位基因來(lái)自親本RT；在8號(hào)染色體上加性效應(yīng)為正，其增效等位基因來(lái)自親本SC。

檢測(cè)到1個(gè)控制根粗的QTL位點(diǎn)，位于12號(hào)染色體的RM700-RM27990標(biāo)記區(qū)間，解釋3.88%的表型變異，加性效應(yīng)為負(fù)，其增效基因來(lái)自于RT。檢測(cè)到3個(gè)控制芽粗的QTL位點(diǎn)，位于4號(hào)染色體的RM7279-SFP42標(biāo)記區(qū)間、8號(hào)染色體的RM22726-RM44標(biāo)記區(qū)間和9號(hào)染色體的RM3769-RM3909標(biāo)記區(qū)間，解釋4.98%、3.38%、9.86%的表型差異，其在4號(hào)染色體上的加性效應(yīng)為正，在8號(hào)、9號(hào)染色體上的加性效應(yīng)為負(fù)。

與根鮮重、根干重、芽鮮重、芽干重相關(guān)的QTL定位，分布在7號(hào)、8號(hào)和11號(hào)染色體上，8號(hào)染色體的RM5887-RM6155標(biāo)記區(qū)間同時(shí)檢測(cè)到了控制根與芽鮮重的位點(diǎn)，說(shuō)明該區(qū)間可同時(shí)影響多個(gè)鮮重性狀，表現(xiàn)為緊密連鎖或一因多效。

3" 結(jié)論與討論

耐旱性是作物的抗旱機(jī)制之一，是作物對(duì)于干旱環(huán)境形成的一種適應(yīng)機(jī)制，受微效多基因控制[8]。水稻萌發(fā)期相對(duì)于水稻其他生長(zhǎng)時(shí)期，抗旱性鑒定具有歷時(shí)短、重復(fù)性強(qiáng)、容量大、受環(huán)境影響小等特點(diǎn)[9-10]。本研究應(yīng)用水稻RIL群體，通過(guò)前期預(yù)備試驗(yàn)，選擇濃度為10%的PEG-6000模擬干旱脅迫對(duì)水稻萌發(fā)期進(jìn)行處理，用發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根粗、芽粗、根鮮重、根干重、芽鮮重、芽干重作為形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行QTL定位分析。共檢測(cè)到20個(gè)水稻萌芽期與根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)等相關(guān)的QTL，分別位于3號(hào)、4號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、11號(hào)和12號(hào)染色體上，LOD值為2.01～4.45，解釋的表型貢獻(xiàn)率為3.38%～7.35%，其中在7號(hào)、8號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了熱點(diǎn)QTL區(qū)域，熱點(diǎn)QTL是指基因組中幾個(gè)形態(tài)生理學(xué)特征的QTL共定位的區(qū)域[11-13]。Rizky利用從RIL基因組序列得到的55 205個(gè)SNP標(biāo)記構(gòu)建了12條水稻染色體上1 980 cM的連鎖圖，總共測(cè)定了175個(gè)與干旱脅迫相關(guān)的形態(tài)生理性狀，在水稻染色體1號(hào)、3號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、12號(hào)的13個(gè)區(qū)域共檢測(cè)到41個(gè)QTL。此外，在6號(hào)和8號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了3個(gè)熱點(diǎn)QTL區(qū)域，在9號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了2個(gè)主要的QTL[11]。這與本研究定位相關(guān)染色體具有相似性。在本研究中，7號(hào)染色體上的RM481-RM5100標(biāo)記區(qū)間可同時(shí)影響水稻的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)；8號(hào)染色體RM5887-RM6155標(biāo)記區(qū)間可同時(shí)檢測(cè)到控制根與芽鮮重的位點(diǎn)，說(shuō)明該區(qū)間可同時(shí)影響多個(gè)鮮重性狀，表現(xiàn)為緊密連鎖或一因多效。

發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、根粗、芽粗、根鮮重、根干重、芽鮮重、芽干重在本研究中均呈極顯著正相關(guān)，該研究與穆平[13]研究結(jié)果基本一致。把RIL群體的耐干旱萌發(fā)相關(guān)性狀進(jìn)行主成分分析，第1主成分貢獻(xiàn)率為62.66%，它的主要作用因子為芽長(zhǎng)、芽干重；第2主成分貢獻(xiàn)率為11.30%，根粗是該主成分中最主要的作用因子，累計(jì)貢獻(xiàn)率為90.53%。利用聚類分析，本研究將246個(gè)株系分為3大類，為水稻耐旱分子基礎(chǔ)研究和遺傳改良提供了試驗(yàn)條件參考和重要的種質(zhì)資源。

綜上所述，本研究檢測(cè)到7號(hào)染色染上RM481-RM5100，8號(hào)染色體上RM5887-RM6155都為熱點(diǎn)區(qū)域，3號(hào)、4號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、11號(hào)和12號(hào)染色體上都存在水稻萌發(fā)期種子生長(zhǎng)可能的QTL位點(diǎn)，利用這些QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，可望同時(shí)對(duì)多個(gè)性狀進(jìn)行改良。

參考文獻(xiàn)：

[1] MIURA K，IKEDA M，MATSUBARA A，et al. OsSPL14 promotes panicle branching and higher grain productivity in rice[J]. Nature Genetics，2010，42（6）：545-549.

[2] LUO L J. Breeding for water-saving and drought-resistance rice （WDR） in China[J]. Journal of Experimental Botany，2010，61（13）：3509-3517.

[3] BARNABáS B，J?GER K，F(xiàn)EHéR A. The effect of drought and heat stress on reproductive processes in cereals[J]. Plant，Cell amp; Environment，2008，31（1）：11-38.

[4] CATTIVELLI L，RIZZA F，BADECK F W，et al. Drought tolerance improvement in crop plants：An integrated view from breeding to genomics[J]. Field Crops Research，2008，105（1）：1-14.

[5] ZHANG J，JIA W，YANG J，et al. Role of ABA in integrating plant responses to drought and salt stresses[J]. Field Crops Research，2006，97（1）：111-119.

[6] SELAMAT N，NADARAJAH K K. Meta-analysis of quantitative traits loci （QTL） identified in drought response in rice （Oryza sativa L.）[J]. 2021，10（4）：716.

[7] KATO Y，HIROTSU S，NEMOTO K，et al. Identification of QTLs controlling rice drought tolerance at seedling stage in hydroponic culture[J]. Euphytica，2008，160（3）：423-430.

[8] MCCOUCH S，CHO Y，YANO M，et al.Report on QTL nomenclature[J].Rice Genet Newsl，1997，14.

[9] 姜雪，馬孝松，羅利軍，等. 水稻苗期模擬干旱脅迫條件下表型性狀QTL定位[J]. 作物雜志，2016（5）：31-37.

[10] 楊瑰麗，楊美娜，李帥良，等. 水稻萌芽期抗旱指標(biāo)篩選與抗旱性綜合評(píng)價(jià)[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36（2）：1-5.

[11] SHEN X，YUAN，ZHANG H，et al. The hot QTL locations for potassium，calcium，and magnesium nutrition and agronomic traits at seedling and maturity stages of wheat under different potassium treatments[J].Genes，2019，10（8）：607.

[12] SWAMY B P M，KUMAR A. Genomics-based precision breeding approaches to improve drought tolerance in rice[J]. Biotechnology Advances，2013，31（8）：1308-1318.

[13] 穆平，李自超，李春平，等. 水、旱稻根系性狀與抗旱性相關(guān)分析及其QTL定位[J]. 科學(xué)通報(bào)，2003（20）：2162-2169.

（責(zé)任編輯：易" 婧）