維生素K2是一類重要的脂溶性維生素，在凝血、抗骨質(zhì)疏松等方面具有重要作用。為了提升納豆芽孢桿菌發(fā)酵過程中維生素K2（MK-7）的產(chǎn)量，以納豆芽孢桿菌ND09為出發(fā)菌株，采用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術(shù)進(jìn)行選育，獲得一株MK-7高產(chǎn)突變株，產(chǎn)MK-7含量達(dá)到26.42mg/L，為出發(fā)菌株的2.1倍。經(jīng)10代傳代培養(yǎng)性能穩(wěn)定，對其搖瓶發(fā)酵裝液量、接種量、發(fā)酵溫度進(jìn)行優(yōu)化，MK-7含量最終達(dá)到38.7mg/L，為生物發(fā)酵生產(chǎn)MK-7提供了有利的微生物資源。

維生素 K2 被稱做甲萘醌（Menaquinone，MK），其C3位的側(cè)鏈?zhǔn)怯刹煌瑪?shù)量的異戊二烯基組成的，存在一系列亞型，可記作 MK-n（n 代表異戊二烯基的個數(shù)），其中最為重要的兩類亞型是MK-4和MK-7，與其他維生素K2相比，MK-7 在人體中具有半衰期長、親緣性高的特點(diǎn)，在醫(yī)藥和功能性食品等領(lǐng)域備受關(guān)注，并且MK-7是生物活性最高的一種維生素K2。它在食品中含量極少，可以預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥，有“鈾金維生素”之稱，主要通過調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣離子的沉積，從而刺激骨組織內(nèi)骨鈣素的合成。此外，MK-7是哺乳動物正常血液凝固時不可或缺的營養(yǎng)素。天然MK-7只能通過微生物發(fā)酵法獲得，其中，納豆芽孢桿菌是目前工業(yè)化生產(chǎn)MK-7的主要菌種。因為它不僅容易培養(yǎng)、生長速度快，而且產(chǎn)MK-7含量相對高。對于野生型的納豆芽孢桿菌往往需要進(jìn)行誘變育種提高產(chǎn)量，從而滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

常壓室溫等離子體誘變（ARTP）是一種通過在常壓和室溫下產(chǎn)生等離子體來引發(fā)基因突變的技術(shù)。ARTP誘變利用高能量等離子體中的化學(xué)反應(yīng)和物理效應(yīng)，對細(xì)胞的DNA進(jìn)行改變，從而引起基因組的突變。 ARTP作為一種生物育種技術(shù)，因其操作便捷、安全、高效的特點(diǎn)，在生物科學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。本實驗以前期分離保存的納豆芽孢桿菌作為出發(fā)菌株，旨在篩選得到MK-7產(chǎn)量高且遺傳穩(wěn)定性好的突變菌株，為該菌株能夠進(jìn)一步應(yīng)用于生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1材料

納豆芽孢桿菌（Bacillus natto），由新拓洋生物工程有限公司技術(shù)中心分離并保存（分離自濮陽南堤村發(fā)酵型豆醬）。

1.1.2 培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、氯化鈉1%、瓊脂1.5-2%、pH自然。

種液培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、氯化鈉1%、pH自然。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖50g/L、蛋白胨50g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L。NaCl 3g/L、pH6.7-7.0、115℃滅菌20min。

1.1.3 試劑

MK-7標(biāo)準(zhǔn)品（≥99.8 %）：Sigma；異丙醇、甲醇（色譜純）：美國 TEDIA 公司；其他試劑均為分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備

常壓室溫等離子體誘變育種儀（ARTP-M 型，無錫源清天木生物）；高壓蒸汽滅菌鍋（LS-75HD，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）；高效液相色譜儀（Agilent 1260、Santa Clara、CA、USA）；高速冷凍離心機(jī)（GL-21M，湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；分析天平（賽多利斯）。SBA-40E生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所）。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

從融化的冷凍管中蘸取1環(huán)，劃線于平板培養(yǎng)基，37℃，培養(yǎng)過夜。用接種環(huán)挑選單菌落，接種于50/250mL種液搖瓶中，37℃200rpm，培養(yǎng)6-10h。

1.2.2 誘變方法

1.2.2.1 納豆芽孢桿菌生長曲線的測定

按1.2.1進(jìn)行種子培養(yǎng)，使用分光光度計在600nm下每隔1h測定OD值，用無菌液做為對照，用菌液培養(yǎng)時間、OD值分別為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.2.2 菌懸液的制備

取對數(shù)生長期的種子液在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min收集菌體，將菌體用滅菌后的生理鹽水重懸清洗兩次，得到菌懸液后，將菌數(shù)調(diào)整到105-106CFU/mL供誘變使用。

1.2.2.3 菌株誘變

開啟ARTP系統(tǒng)并對操作室內(nèi)外消毒，取1.2.2.3所制菌懸液10ul于載片，按無菌操作放至操作室臺面。在一定的照射距離及氣流量下，分別采用誘變時間10s、20s、30s、40s、50s、60s進(jìn)行誘變。誘變結(jié)束后，洗脫菌液至無菌生理鹽水中至1000ul。之后將菌液稀釋，涂布平板在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。依據(jù)致死率，確定合適的ARTP處理時間。

1.2.2.4 致死率的測定

用稀釋涂布平板法對誘變處理前后的菌液進(jìn)行培養(yǎng)，并計數(shù)。

致死率（%）= （A－B）/A×100

A：未經(jīng)誘變處理的菌落數(shù)，B：誘變處理后存活的菌落數(shù)。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

從搖瓶種液中轉(zhuǎn)接1mL種液于40/250mL無擋板發(fā)酵搖瓶中，37℃，220rpm遮光培養(yǎng)，定時取樣測定各指標(biāo)。

1.2.4 MK-7的檢測

取發(fā)酵液0.5mL于5mL棕色離心管中，加入萃取劑（異丙醇：正己烷的混合物=1：2）2mL渦旋攪拌機(jī)用力搖勻10min，靜置至兩相分離，吸取上層有機(jī)相，用HPLC分析。配備光電二極管陣列紫外檢測器和C18 ODS柱（5μm、250×4.6mm、Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA），柱溫40℃，流動相用甲醇：二氯甲烷（9：1，v/v），流速1mL/min，檢測波長254nm，進(jìn)樣量10μL。MK-7校準(zhǔn)曲線在1mg/L-100mg/L之間呈線性變化。

MK-7含量=液相結(jié)果×3.5（最終有機(jī)相體積約為發(fā)酵液的3.5倍）。

1.2.5 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性

將篩選獲得的菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)10代，并對每一代菌株按1.2.3進(jìn)行培養(yǎng)，比較每代菌株發(fā)酵MK-7含量變化，以評估菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.6 發(fā)酵工藝優(yōu)化實驗

1.2.6.1 搖瓶裝液量對發(fā)酵的影響

將培養(yǎng)好的種子液按3%接種量接種于250mL錐形瓶中，裝液量設(shè)置為：10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL，培養(yǎng)72h后檢測發(fā)酵液MK-7含量。

1.2.6.2 接種量對發(fā)酵的影響

接種量按1%、2.5%、5%、7.5%、10% ，分別接種于裝有20 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中（低于10%接種量的補(bǔ)加無菌水至10%），培養(yǎng)72h后檢測發(fā)酵液MK-7含量。

1.2.6.3 培養(yǎng)溫度對納豆芽孢桿菌ND09產(chǎn)MK-7的影響

將培養(yǎng)好的種子液按5%接種量接種于裝有20mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，分別在30℃、34℃、37℃、40℃、43℃培養(yǎng)，72h后檢測發(fā)酵液MK-7含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各實驗設(shè)置三個平行，試驗數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2019 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行整理及分析。

2.結(jié)果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌的生長曲線

根據(jù)納豆芽孢桿菌ND09的生長曲線（圖1），我們可以觀察到不同生長階段的特征。前4小時處于遲滯期，4-8小時是對數(shù)生長期，8-12小時是生長穩(wěn)定期。針對ARTP實驗需要，我們希望選擇處于對數(shù)生長的中后期的菌液作為實驗對象。因此，我們決定收集第6小時的菌液進(jìn)行誘變實驗。這個時間點(diǎn)對應(yīng)了納豆芽孢桿菌ND09的對數(shù)生長的中后期，有利于誘發(fā)變異并保持菌株的生長狀態(tài)。

2.2 致死率曲線

表1可以看到，隨著ARTP誘變處理時間的延長菌株致死率持續(xù)升高，我們選擇致死率80%-85%的處理時間定為ARTP的誘變劑量，故誘變時間確定為40s。

2.3 誘變菌株的篩選

ARTP誘變后從平板上挑選出92個形態(tài)較好的單菌落，分別接斜面固體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)培，再分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，篩選產(chǎn)量高的菌株。篩選到正突變株15株，突變株ND09-A6產(chǎn)量達(dá)到26.2 mg/L，高于其他突變株，確定對其進(jìn)一步研究。

圖2 突變株的篩選

2.4 突變株穩(wěn)定性分析

為了評價突變菌株ND09-A6遺傳穩(wěn)定性，將其連續(xù)10次傳代培養(yǎng)，并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵檢測MK-7產(chǎn)量。以未經(jīng)傳代的ND09-A6的MK-7產(chǎn)量為基準(zhǔn)計算變化率，結(jié)果見表2。從表中可以看到ND09-A6菌株的各代MK-7產(chǎn)量保持在26mg/L左右，各代的變化率在±4%以內(nèi)。表明該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

2.4.1 搖瓶裝液量對MK-7含量的影響

根據(jù)實驗結(jié)果（表3），發(fā)現(xiàn)裝液量為20mL時，MK-7的產(chǎn)量最高，隨著裝液量的增大呈先增大后減小的趨勢。可能是因為ND09-A6菌株屬于需氧菌，若裝液量過大會造成發(fā)酵過程中溶氧偏低，而裝液量過小水分蒸發(fā)會導(dǎo)致菌體早衰。故確定裝液量為20mL。

2.4.2 接種量對MK-7含量的影響

由表4可以看到，隨著接種量的增大MK-7的產(chǎn)量趨勢先增大后減小。接種量為5%時，MK-7的產(chǎn)量最高?？赡芙臃N量過大會使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)快速消耗，而接種量過小會影響菌體內(nèi)某些輔酶擴(kuò)散，這些都不利于MK-7的合成，故選擇接種量為5%。

2.4.3 溫度對 MK-7含量的影響

由表5可知，MK-7的產(chǎn)量隨著溫度的增大呈先增大后減小的趨勢，溫度為 40℃時，MK-7含量最高，這可能是由于40℃是MK-7合成關(guān)鍵酶的最適反應(yīng)溫度，更有利于MK-7合成。

結(jié)論

以實驗室保存的ND09為出發(fā)菌株進(jìn)行ARTP誘變選育，ARTP誘變處理最佳時間為40s。經(jīng)過多次篩選，最終獲得1株MK-7高產(chǎn)菌株ND09-A6，并連續(xù)傳代10次進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，MK-7的發(fā)酵含量平均 26.42mg/L，達(dá)到出發(fā)菌株的 2.1倍。然后對發(fā)酵條件接種量、裝液量、溫度進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后最佳發(fā)酵條件為：接種量5%，裝液量20mL，培養(yǎng)溫度40℃，培養(yǎng)72h后發(fā)酵液中MK-7含量達(dá)到了38.7mg/L。本實驗表明，采用本研究中的菌種誘變方法選育出的高產(chǎn)菌株ND09-A6具有良好的遺傳穩(wěn)定性，對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后顯著提高了MK-7含量。若要全面提高菌株的發(fā)酵水平，還需要對菌株進(jìn)行一定的改造，對培養(yǎng)基配方和發(fā)酵工藝進(jìn)一步優(yōu)化，從而應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

作者簡介

楊林（1982.10-），男，漢族，河北保定人，本科，工程師；研究方向：發(fā)酵工程。

*通訊作者

張建國（1972.11-），男，漢族，河南駐馬店人，本科，高級工程師；研究方向：生物化工。