分別提取茯苓和枸杞多糖，將兩者按照1：1組合得到組合多糖（PM），通過三種自由基清除試驗以及過氧化氫氧化損傷的人正常肝細胞模型，檢測多糖對細胞抗氧化活性。兩種多糖和組合多糖均顯示了較好的抗氧化活性，在過氧化氫造成的損傷肝L02細胞，組合多糖顯示了顯著的抗氧化作用，在濃度為100μg/mL時，L02細胞存活率最高。組合多糖可以明顯下降過氧化氫損傷L02細胞的MDA濃度，并可以顯著提高損傷細胞的兩種抗氧化酶SOD和GSH-Px的活力。

食品來源多糖（Polysacharide） 結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有多種生物學(xué)功能，包括抗氧化、減輕炎癥、降糖、降脂等功能。很多研究表明不同食品來源多糖具有較好的抗氧化的功能，其主要是通過促進抗氧化酶活性、減少自由基生成及抑制脂質(zhì)過氧化來完成。有研究表明，不同組合多糖共同應(yīng)用的抗氧化效果更強。人體肝臟的正常功能對于維持人體代謝非常重要，肝臟代謝非?；钴S，其在不同生理狀態(tài)下產(chǎn)生活性氧自由基，在一定的條件下引發(fā)的氧化應(yīng)激認(rèn)為會造成不同程度的肝臟細胞損傷，積累的自由基損傷會加速慢性肝病的形成和發(fā)展。目前在體外使用肝L02細胞的過氧化氫損傷模型，能較為有效的評價食品中活性成分的抗氧化能力。

茯苓，為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，《名醫(yī)別錄》中記載其能“調(diào)臟氣，伐腎邪，長陰，益氣力，保神守中”。枸杞味甘性平、補腎益精、補血安神。枸杞和茯苓配伍，具有健脾益腎的效果。

前期實驗中，我們對不同種類食品來源提取的多糖進行了抗氧化能力的初步評價，發(fā)現(xiàn)其中茯苓和枸杞制備多糖及兩者組合的多糖，在自由基清除等抗氧化活性評價中顯示了較好的抗氧化能力，在此基礎(chǔ)上，我們使用人正常肝細胞L02的過氧化氫損傷模型進行檢測評估，試圖為今后進一步的組合多糖應(yīng)用提供可能的依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

枸杞，產(chǎn)自寧夏，為茄科植物枸杞Lycium barbarum L的干燥成熟果實。茯苓，產(chǎn)自云南，為多孔菌科茯苓屬真菌茯苓Poria cocos P的菌核。它們購自廣州至信中藥飲片有限公司。1，1-二苯-2-苦基肼、抗壞血酸VC和MTT（噻唑藍）均購自上海麥克林生化科技有限公司，MDA檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒和GSH-Px檢測試劑盒均購自上海碧云天公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號EYELA，日本）、冷凍干燥機（寧波新芝）、全波長分光光度計（上海元析）、酶標(biāo)儀（美國Thermo）、二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo）。

1.2 方法

參照兩種不同方法提取枸杞多糖（LBP）和茯苓多糖（PP）。分別將購買的枸杞、茯苓清洗后烘干、研磨為粗粉，熱水浸泡提取，經(jīng)離心，醇沉，Sevage法除蛋白，然后透析，產(chǎn)物經(jīng)冷凍干燥后制得樣品。將制備的枸杞、茯苓多糖質(zhì)量進行制備茯苓：枸杞（1：1）組合多糖（TP）。

自由基清除的檢測，多糖濃度分別設(shè)置為1mg/mL、 0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL，VC作陽性對照，進行DPPH自由基清除率、 ·OH清除率測定和超氧陰離子自由基的清除率測定。

H2O2氧化損傷L02細胞的評價

細胞以1×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL加入完全培養(yǎng)液，設(shè)置正常細胞組、H2O2組、多糖組。細胞多糖組分別加入終濃度為0、25、50、100、200、400、800μg/mL的枸杞多糖、茯苓多糖和組合多糖的含血清培養(yǎng)液處理24小時，H2O2組和多糖各組都加入100μL含50μmol/L H2O2培養(yǎng)液，損傷4h，正常細胞組加入100μL培養(yǎng)液處理4h。用噻唑藍染色法檢測后獲得細胞存活率。

設(shè)置正常組，H2O2組和篩選出的100μg/mL多糖濃度組，參照使用說明書檢測丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力。

統(tǒng)計分析運用Graphpad軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)以 x±s（標(biāo)準(zhǔn)差）表示，P<0.05 表示顯著差異，P<0.01 表示差異極顯著。

2.結(jié)果與分析

2.1 枸杞多糖、茯苓多糖、組合多糖清除DPPH自由基的檢測

如圖1，隨著培養(yǎng)液中多糖濃度的增加，清除DPPH自由基比例逐漸升高。相同濃度時，組合多糖清除效果略強于兩種多糖，枸杞多糖的清除率高于茯苓多糖組。組合多糖清除DPPH自由基能力在0.6 mg/mL時達到最高。

2.2 枸杞多糖、茯苓多糖和組合多糖清除·OH自由基的檢測

由圖2顯示，隨著濃度升高，枸杞多糖、茯苓多糖和組合多糖對·OH自由基的清除能力增強，清除比例增加。組合多糖濃度在0.2-0.4 mg/mL時，對·OH自由基清除作用強于其他多糖組，組合多糖清除·OH自由基能力在0.6 mg/mL時達到最高。

2.3 枸杞多糖、茯苓和組合多糖清除超氧陰離子自由基檢測

圖3顯示，各組多糖隨著濃度的升高，清除超氧陰離子自由基的能力先增強，但到0.6 mg/mL濃度時開始減弱，對O2-·自由基的清除能力均低于同濃度的VC溶液。在0.4mg/mL濃度時，組合多糖清除O2-·自由基最強。

2.4多糖對L02細胞保護濃度的測定

在之前的實驗中，50μmol/L的H2O2與L02細胞共培養(yǎng)R0ahEuMJ//wZbcK8V92P9IWCr2lTw9i/vCjhiQQRBN4=4小時，細胞存活率約為50%，使用此條件對肝細胞進行損傷造模。如圖4，在100μg/mL濃度，LBP組和PP組的存活率最高。組合多糖濃度在25、50、100μg/mL時，肝細胞活力高于同濃度的兩種多糖。當(dāng)組合多糖濃度是100μg/mL時，細胞存活率為84.3%，達到最高。

2.5 L02細胞抗氧化指標(biāo)檢測

如表1，過氧化氫損傷L02細胞后，與正常細胞組相比，損傷組的MDA濃度顯著增加，損傷組的SOD和GSH-Px活力顯著減低。多糖各組與過氧化氫損傷組相比，細胞MDA濃度降低，細胞的抗氧化酶SOD和GSH-Px活力均顯著增加。其中組合多糖的兩種抗氧化酶活性最高，明顯高于單種多糖。

3.討論

肝臟是機體代謝活動非常活躍的器官，肝臟細胞在代謝過程中線粒體產(chǎn)生大量的氧自由基（ROS），在一些特殊因素作用下，導(dǎo)致產(chǎn)生過量的自由基引起氧化應(yīng)激會導(dǎo)致肝臟細胞的受損，這種損傷在一定范圍內(nèi)，細胞可以通過自身抗氧化酶的激活及其他清除自由基的方式來修復(fù)損傷，當(dāng)損傷超出修復(fù)能力時候，細胞自身功能不能得到改善，將導(dǎo)致細胞衰老或者死亡。食品來源的一些多糖能夠清除過量活性氧自由基，并維持細胞線粒體的正常生理機能，減少自由基對細胞的損傷。

在前期的實驗中，我們對多種食品來源多糖進行抗氧化活性檢測，根據(jù)之前實驗的結(jié)果選擇了枸杞和茯苓多糖，發(fā)現(xiàn)其多糖在清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的方面能力較強。在正常肝細胞L02細胞過氧化氫氧化損傷實驗中，組合多糖濃度在100μg/mL時，細胞活力最高，與其他單種多糖相比，低濃度的組合多糖抗氧化能力更強。據(jù)此認(rèn)為，組合茯苓枸杞多糖通過提高兩種抗氧化酶的活性，降低丙二醛的濃度，減少了過氧化氫的氧化應(yīng)激對肝細胞的損傷。

上述結(jié)果表明，組合多糖自由基清除能力與單種多糖相近，在肝L02細胞過氧化氫損傷實驗中，低濃度的組合多糖與單種多糖相比，抗氧化能力更強。期待組合多糖后續(xù)應(yīng)用于護肝功能添加。

基金項目

2022年廣東省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目“運動肽健康營養(yǎng)素”（編號：S202210573038）。

作者簡介

王祈蘅（2002.11-），女，漢族，廣東珠海人，本科在讀；研究方向：生物技術(shù)。

*通訊作者

黃宏靚（1974.06-），男，漢族，湖南桂東人，博士，副教授；研究方向：生物技術(shù)。