摘要：【目的】鑒定金魚草細(xì)胞壁相關(guān)受體激酶（Wall-associated kinase，WAK）及類WAK蛋白（WAK-like kinases，WAKL）基因家族成員，并挖掘抗核盤菌的候選基因，為深入解析金魚草抗核盤菌的WAK/WAKL分子調(diào)控機(jī)制提供理論參考。【方法】以擬南芥WAK/WAKL家族蛋白為參考序列，利用生物信息學(xué)方法從金魚草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出WAK/WAKL基因家族成員，并對(duì)其理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、順式作用元件及共線性關(guān)系等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)該家族基因在金魚草抗感核盤菌材料中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。【結(jié)果】從金魚草基因組中共鑒定出27個(gè)WAK/WAKL基因家族成員，其中WAK家族基因16個(gè)（AmWAKI～AmWAK?6），WAKL家族基因11個(gè)（AmWAKLI～AmWAKLI1），編碼的氨基酸數(shù)量為615～1085個(gè)；理論等電點(diǎn)（pI）為4.94～8.69，絕大多數(shù)蛋白呈酸性；所有蛋白的總平均親水性指數(shù)（GRAVY）值小于0，均為親水性蛋白；大多數(shù)蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)膜區(qū)域，少部分定位于細(xì)胞外、液泡、高爾基體和細(xì)胞核。27個(gè)WAK/WAKL基因家族成員不均勻地分布在金魚草的8條染色體上，且與擬南芥WAK/WAKL家族基因存在7對(duì)共線性同源基因；基因啟動(dòng)子區(qū)域含有與防御和脅迫響應(yīng)、茉莉酸甲酯響應(yīng)及水楊酸響應(yīng)等順式作用元件。通過(guò)葉片離體接種核盤菌試驗(yàn)，篩選出抗性差異明顯的易感病品種Aml和抗病品種Am6。有12個(gè)WAK/WAKL家族基因在金魚草抗感材料中顯著差異表達(dá)（Plt;0.05），有9個(gè)基因表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致。這9個(gè)基因中，有5個(gè)基因（AmWAK7、AmWAKL2、AmWAKL8、AmWAK6和AmWAK13）在金魚草的根、莖和葉組織中高表達(dá)，而剩余4個(gè)基因（AmWAK2、AmWAK8、AmWAK9和AmWAK12）在根、莖和葉中基本不表達(dá)?！窘Y(jié)論】篩選出的27個(gè)金魚草WAK/WAKL基因家族成員，具有相似的基因結(jié)構(gòu)和蛋白功能結(jié)構(gòu)域，其中AmWAK6、AmWAK7、AmWAK13、AmWAKL2和AmWAKL8為金魚草抗核盤菌的關(guān)鍵候選基因，具有介導(dǎo)抗病的潛在功能。

關(guān)鍵詞：金魚草；WAK/WAKL基因家族；鑒定；核盤菌抗性；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；候選基因挖掘

中圖分類號(hào)：S681.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）01-0024-13

Genome-wide identification and mining of candidate genes against Sclerotinia sclerotiorum ofWAK/WAKL gene family in snapdragon（Antirrhinummajus L.）

YANG Dong-mei，XIA Wen-nian，SONG Jia-yi，YANG Jie，YAN Cang-hai，SU Yun-li，WANG Zhong-yi，HU Hui-zhen*

（College of Landscape and Horticulture Sciences，Southwest Forestry University/Engineering Research Center of Func-tional Flower Resources and Industrialization Technology of Yunnan Province，Kunming，Yunnan650224，China）

Abstract：[Objective]To identify the gene family members of the cll wallassociated kinase（WAK）and WAK-like kinases（WAKL）of Amtirhimm majus L.，and explore the candidate genes against Sclerotinia scleroliorum.This study provided atheoretical reference for further analysis of WAKWAKL molecular regulatory mechanism of A.majus against S.sclerotiorum.【Method]JUsingArabidopsis thaliana L.WAK/WAKL family proteins as reference sequences，theWAK/WAKL gene family members were identified from the A.majus genome database by bioinformatics method，and their physicochemical properties，phylogeny，gene structure，conserved mods，cis-acting elements and collinear relationships were predicted.Transcriptome sequencing and real-time fluorescence quantitative PCR were used to analyze the expres-sion patterns of the family genes involved in S.sclerotiorum resistance.[Result]Atotal of27WAK/WAKL gene family members were identified from the A.majus genome，including16WAK genes（AmWAK1-AmWAK16）and11WAKL genes（AmWAKLI-AmWAKLII），encoding615-1085amino acids.The theoretical isoelectricpoint（pI）ranged from4.94to8.69，and the most proteins were acidic.The total mean hydrophilic index（GRAVY）of all proteins was lessthan0，indi cating that all proteins are hydrophilic proteins.Most of the subcellular proteins werelocated in the plasma membrane re-gion of thecell，and afew were located in the extracellular，vacuole，Golgi apparatus and nucleus.There were27members of WAK/WAKL gene family distributed unevenly on8chromosomes of A.majus，and7pairs of collinear homologous genes with A.thaliana WAK/WAKL gene family.The gene promoter region contained cis-acting elements involved in de-fense and stress response，methyl jasmonate response and salicylic acid response.The susceptible variety Aml andresis-tant variety Am6were screened by inoculating the leaves of sclallodiscus in viro.There were12WAK/WAKL family genes significantly differentially expressed（Plt;0.05）among the resistant materials，and the expression patterns of9genes were basically consistent with the transcriptome sequencing results.Of the nine genes，five（AmWAK7，AmWAKL2，Am-WAKL8，AmWAK6and AmWAK?3）were highly expressed in the root，stem，and leaf tissues of A.majus，while the remai-ning four（AmWAK2，AmWAK8，AmWAK9and AmWAK12）were largely unexpressed in the root，stem and leaf tissues

【Conclusion]Twenty-seven members of the WAK/WAKL gene family arescreened，which havesimilar gene structure and protein functional domains.Among them，AmWAK6，AmWAK7，AmWAK13，AmWAKL2and AmWAKL8are key candidate genes for resistance to S.sclerotioram，and have potential functionsof mediating disease resistance.

Key words：Antirrhinum majus L.;AmWAK/WAKL gene family;identification;Sclerotinia sclerotiorum resis-tance;transcriptome sequencing;candidate gene mining

Foundation items：Youth Project of National Natural Science Foundation of China（31901571）;Yunnan College Stu dent Innovation and Entrepreneurship Training Project（202110677078）;Southwest Forestry University Research Initia-tion Project（01102-112109）

0引言

【研究意義】金魚草（Antirrhinum majus L.）是車前科金魚草屬的多年生草本植物，其花型獨(dú)特、花色艷麗、花香濃郁、花期長(zhǎng)，是重要的觀賞花卉和切花材料（羅維平等，2008）。金魚草花卉品質(zhì)及觀賞價(jià)值極易受到真菌性病害的影響，特別是由核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）侵染其根、莖和葉引起的根腐病、莖腐病和苗腐病是影響金魚草生長(zhǎng)發(fā)育的典型病害（韓月冷，2019）。近年來(lái)，植物細(xì)胞壁抗性（Cell wall-mediated resistance）因其具有廣譜性，且能與病程相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular pattern，PAMPs）激活的免疫反應(yīng)（PAMPs-triggered immunity，PTI）協(xié)同互作（Bigeard et al.，2015），已成為植物抗病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，也是研究植物抗核盤菌的理想突破口。植物細(xì)胞壁抗性指通過(guò)識(shí)別植物細(xì)胞壁自身產(chǎn)生的損傷相關(guān)分子模式（Damage-associated molecular patterns，DAMPs）而激活的免疫反應(yīng)（DAMPs-triggered immunity，DTI）。其中，植物細(xì)胞壁相關(guān)受體激酶（Wall-associated kinase，WAK）及類WAK蛋白（WAK-like kinases，WAKL）（WAK/WAKL）是受體樣激酶（Receptor-like kinases，RLK）家族中一類特殊的植物類受體激酶，在病原菌侵染過(guò)程中可通過(guò)與果膠相關(guān)的DAMPs結(jié)合來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞壁的完整性，將信息傳遞到細(xì)胞內(nèi)，激活相應(yīng)的信號(hào)途徑調(diào)控植物抗病原菌、逆境脅迫及生長(zhǎng)發(fā)育等生理過(guò)程（Anderson et al.，2001）。因此，對(duì)金魚草WAK/WAKL基因家族成員進(jìn)行鑒定，并挖掘金魚草抗核盤菌的關(guān)鍵候選基因，為植物抗核盤菌育種提供新的基因資源，對(duì)深入解析金魚草抗核盤菌的分子機(jī)制具有重要的意義。【前人研究進(jìn)展】植物細(xì)胞壁是高度復(fù)雜的異質(zhì)型動(dòng)態(tài)復(fù)合網(wǎng)絡(luò)，由纖維素、半纖維素、果膠、木質(zhì)素和壁蛋白等組成，是植物重要的保護(hù)屏障（Christensen et al.，2010;Wang et al.，2016）。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞壁不僅是結(jié)構(gòu)性的被動(dòng)防御屏障，更是動(dòng)態(tài)性的主動(dòng)防御體系，其微小損傷或結(jié)構(gòu)成分的改變均會(huì)引起植物抗病信號(hào)途徑和防衛(wèi)反應(yīng)的激活（Lipka et al.，2005）。WAK/WAKL蛋白結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、0-2表皮生長(zhǎng)因子（EGF）結(jié)構(gòu)域及與細(xì)胞壁果膠緊密相連的細(xì)胞外半乳糖醛酸結(jié)合（GUB）結(jié)構(gòu)域。因此，WAK/WAKL被認(rèn)為是果膠相關(guān)DAMPs的識(shí)別受體（Kohorn，2016），可激活鈣離子內(nèi)流、活性氧（ROS）迸發(fā)、有絲分裂原活化激酶（MAPK）信號(hào)途徑、防御相關(guān)激素和乙烯（ET）/茉莉酸（JA）信號(hào)等途徑，并與PTI和效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫（Effector-triggered immunity，ETI）脅同互作，從而全面激活植物的免疫反應(yīng)（Hu et al.，2021）。目前，在模式植物擬南芥中共鑒定了5個(gè)AWAKs和22個(gè)AIWAKLs基因（He et al.，1999;Zhang et al.，2005），這些基因在生物和非生物脅迫下均能被顯著誘導(dǎo)表達(dá)（Meier et al.，2010），其中AtWAK1和AtWAK2可與寡聚半乳糖醛酸（Oligogalacturonides，OGs）結(jié)合來(lái)激活活性氧（ROS）爆發(fā)及MPK3、MPK6等相關(guān)防御基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)擬南芥對(duì)灰葡萄球菌的抗性（Ferrari et al.，2013）。在大豆中，GmWAK1通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上調(diào)來(lái)提高大豆對(duì)疫霉菌的抗性（趙明等，2020）。在番茄中，微生物相關(guān)分子模式（MAMPs）如細(xì)菌鞭毛蛋白N端22個(gè)氨基酸的肽段flg22及其衍生物flgII-28，分別激活模式識(shí)別受體Flagellin-sensitive2（Fls2）/Flagellin-sensitive3（Fls3），誘導(dǎo)SIWAK1轉(zhuǎn)錄本增加，從而調(diào)控質(zhì)外體后期的PTI（Zhang et al.，2020）。在棉花中，GhWAK7A分別與GhLYK5和GhCERK1互作，促進(jìn)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的GhLYK5-GhCERK1二聚化，從而介導(dǎo)對(duì)枯萎病病原體的反應(yīng)（Wanget al.，2020）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)JWAK/WAKL是通過(guò)識(shí)別DAMPs介導(dǎo)細(xì)胞壁抗性的關(guān)鍵因子，但目前WAK/WAKL家族基因只在部分模式植物或作物中有研究（Decreux and Messiaen，2005），在金魚草等觀賞性花卉中鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以擬南芥WAK/WAKL家族蛋白為參考序列，利用生物信息學(xué)方法從金魚草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出WAK/WAKL基因家族成員，并對(duì)接種核盤菌后的金魚草抗感材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，挖掘出金魚草抗核盤菌的WAK/WAKL家族候選基因，為植物抗核盤菌育種提供新的基因資源，為深入解析金魚草抗核盤菌的WAK/WAKL分子機(jī)制提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以種植于云南省昆明市西南林業(yè)大學(xué)后山溫室的7個(gè)云南省常見(jiàn)金魚草切花品種——波托馬克系列為研究材料，包括Aml（深紫色A.majus L.‘Royal Purple'）、Am2（櫻桃紅色A.majus L.'Cherry Red'）、Am3（橙紅色A.majus L.‘Orange'）、Am4（蘋果花色A.majusL.‘Apple Flower'）、Am5（粉色A.majusL‘Early Pink'）、Am6（白色A.majus L.'White'）及Am7（黃色A.majus L.‘Yellow'）。核盤菌Ss-1由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李國(guó)慶老師提供。Eastep?Super總RNA提取試劑盒購(gòu)自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；All-In-One5×RT Master-Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和BlastaqTM2×qPCR Master Mix試劑盒購(gòu)自南京愛(ài)必夢(mèng)生物材料有限公司。主要設(shè)備儀器：RXM型智能人工氣候箱（寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]。

1.2金魚草WAK/WAKL基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

分別從擬南芥數(shù)據(jù)資源庫(kù)TAIR（http：//www.Arabidopsis.org）和金魚草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：/bio-info.sibs.Ac.Cn/Am/download_vl.php）下載擬南芥和金魚草基因組的WAK/WAKL家族基因及編碼區(qū)（CDS）序列和蛋白序列。將所獲得的擬南芥序列作為子序列，通過(guò)TBtools的本地Blast（Elt;1×1010）初步篩選金魚草WAK/WAKL家族基因，通過(guò)HMMER3.0（http：/hmmer janelia.org/）對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析，利用Pfam和SMART（http：//smart.emblheidel-berg.De/）對(duì)鑒定獲得的WAK/WAKL家族成員進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析，將同時(shí)含有N-末端WAK結(jié)合域、EGF結(jié)構(gòu)域（Pfam）和C-末端Pkinase結(jié)構(gòu)域的成員判定為WAK家族成員，將包含N-端WAK結(jié)合域和C-末端Pkinase結(jié)構(gòu)域，且不含EGF結(jié)構(gòu)域的成員判定為WAKL家族成員。通過(guò)ExPASy對(duì)WAK/WAKL家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析，最后利用在線預(yù)測(cè)工具ProtComp9.0進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3金魚草WAK/WAKL家族基因染色體定位及共線性分析

分別下載金魚草和擬南芥的全基因組及注釋文件，利用TBtools中的Gene Location Visualize from GTF/GFF對(duì)已下載的金魚草基因組文件及相應(yīng)注釋文件進(jìn)行染色體定位的可視化分析。使用TBtools中Dual systeny Plot for MC scanX功能分別將金魚草與擬南芥WAK/WAKL家族基因的共線性關(guān)系進(jìn)行可視化分析。

1.4系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用DNAMAN9.0對(duì)獲得的金魚草WAK/WAKL家族蛋白進(jìn)行氨基酸序列多重序列比對(duì)，并利用MEGA11.0的最大似然法（Maximum likelihood estimation，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，自展值1000，其他參數(shù)默認(rèn)（Tamura et al.，2021）。

1.5金魚草WAK/WAKL家族基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序分析結(jié)果

根據(jù)金魚草WAK/WAKL家族基因序列及基因組GFF3數(shù)據(jù)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，利用在線軟件MEME對(duì)WAK/WAKL家族蛋白進(jìn)行保守基序分析，利用TBtools中的Gene Location Visualize from GTF/GFF進(jìn)行保守基序和基因結(jié)構(gòu)可視化分析（Chen et al.，2020）。

1.6金魚草WAK/WAKL基因家族啟動(dòng)子分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提取WAK/WAKL家族基因上游2000bp啟動(dòng)子序列，使用PlantCARE預(yù)測(cè)其順式作用元件。順式作用元件分為三大類：環(huán)境應(yīng)激元件、激素響應(yīng)元件和發(fā)育相關(guān)元件。使用TBtools進(jìn)行可視化并繪制熱圖（Lescot et al.，2002）。

1.7金魚草抗感材料篩選

對(duì)7個(gè)金魚草切花品種進(jìn)行葉片離體接種核盤菌Ss-1，比較抗性差異。取抗性顯著差異的品種進(jìn)行核盤菌的離體接種處理（取金魚草同一葉齡的葉片排置于一個(gè)透明的方形盒中，下面鋪多層濾紙片，取新鮮制備的直徑1～2mm菌絲塊，有菌絲的面朝下，接種于葉片中部稍稍偏離主脈的位置，蓋上蓋子保濕），置22℃黑暗培養(yǎng)。從接種后0～42h持續(xù)對(duì)葉片進(jìn)行觀察拍照，并分別在0、6、12和24h取樣，于-80℃保存。

1.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

通過(guò)深圳華大基因科技有限公司的DNBSEQ平臺(tái)，對(duì)金魚草苗腐病易感（S）品種Aml和抗苗腐?。≧）品種Am6離體接種核盤菌24h后病斑周圍新鮮葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。為了檢測(cè)金魚草WAK/WAKL家族基因在核盤菌侵染下的表達(dá)模式，分別對(duì)離體接種核盤菌后0、6、12和24h的葉片進(jìn)行取樣，利用EasteTSuTer總RNA提取試劑盒提取核盤菌處理0、6、12和24h葉片的總RNA，并利用All-In-One5×RT MasterMix試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，使用Primer Premier5.0在該基因的編碼區(qū)（CDS）設(shè)計(jì)特異性引物（表1），通過(guò)BlastaqTM2×qPCR Master Mix分析WAK/WAKL家族基因在核盤菌誘導(dǎo)下的表達(dá)模式。此外，提取金魚草的根、莖、葉和花的總RNA，進(jìn)一步分析WAK/WAKL家族基因在不同組織中的表達(dá)模式。反應(yīng)體系15.0μL：2×SYBR qPCR MasterMix7.0μL，正、反向引物（10μmol/L）各0.5μL，cDNA（100ng/μL）模板2.0μL，焦碳酸二乙酯（DEPC）處理過(guò)的無(wú)菌水補(bǔ)足至15.0μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30s;95℃5s，60℃30s，72℃27s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以AmUBI為內(nèi)參基因，使用2-AAQ法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果與分析

2.1金魚草WAK/WAKL家族基因鑒定及蛋白理化性質(zhì)分析

通過(guò)比對(duì)分析擬南芥和金魚草WAKWAKL家族蛋白的氨基酸序列和保守結(jié)構(gòu)域，從金魚草中共鑒定出27個(gè)WAK/WAKL家族基因，其中WAK家族基因16個(gè)（AmWAKI～AmWAK?6），WAKL家族基因11個(gè)（AmWAKLI～AmWAKLI1），根據(jù)染色體定位的結(jié)果依次編號(hào)，如表2所示。這些金魚草WAK/WAKL家族基因編碼的氨基酸數(shù)量為615～1085個(gè)；分子量為68027.38～19585.23kD;理論等電點(diǎn)（pI）為4.94～8.69，其中24個(gè)成員呈酸性（pilt;7.00），3個(gè)成員為堿性（plgt;7.00）;所有蛋白的總平均親水性指數(shù)（GRAVY）值均小于0，表明均為親水性蛋白。此外，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，17個(gè)WAK/WAKL家族蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜區(qū)域，其余10個(gè)分別定位于細(xì)胞外、液泡、高爾基體和細(xì)胞核等位置。

2.2金魚草WAK/WAKL家族基因染色體定位及共線性分析結(jié)果

為了探究金魚草WAK/WAKL家族基因的進(jìn)化關(guān)系，利用TBtools對(duì)27個(gè)WAK/WAKL家族基因進(jìn)行染色體定位，同時(shí)分析了該基因家族在擬南芥與金魚草種間的共線性關(guān)系。染色體定位分析結(jié)果顯示，WAK/WAKL家族基因在金魚草8條染色體上均有分布，其中除AmWAK1基因定位在Chr2外，其余AmWAKs基因主要定位于Chr8和Chr5上；而AmWAKLs主要定位于Chr4和Chr6上（圖1-A）。共線性分析結(jié)果顯示，金魚草與擬南芥共有7對(duì)同源基因，主要定位于AmWAKs和AmWAKLs基因集中分布的Chr8、Chr5和Chr4上（圖1-B）。

2.3金魚草WAK/WAKL家族基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

通過(guò)MEGA7.0中的最大似然法（ML）和氨基酸序列的多重比對(duì)，構(gòu)建了金魚草和擬南芥的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖2）顯示，所有WAK/WAKL蛋白可分為三大組（I、Ⅱ和Ⅲ）。16個(gè)AmWAKs（AmWAK10、AmWAK7、AmWAK11、AmWAK8、AmWAK9、AmWAK12、AmWAK13、AmWAK16、AmWAK15、AmWAK14、AmWAK3、AmWAK4、AmWAK2、AmWAKL7、AmWAK5和AmWAK1）蛋白均與擬南芥AtWAK1～AtWAK5蛋白聚在第I組，其余3個(gè)AmWAKs（AmWAK1、AmWAK5和AmWAK6）聚在第Ⅲ組，而10個(gè)AmWAKLs蛋白（AmWAKL10、AmWAKL1、AmWAKL11、AmWAKL4、AmWAKL3、AmWAKL5、AmWAKL6、AmWAKL2、AmWAKL9和AmWAKL8）則聚在第Ⅱ組。

2.4金魚草WAK/WAKL家族基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果

對(duì)金魚草WAK/WAKL家族基因的外顯子和內(nèi)含子分布和位置進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金魚草WAK/WAKL家族基因的外顯子數(shù)量為1～7個(gè)，同一組基因外顯子的數(shù)量也各不相同，如在第Ⅲ組中，AmWAK6基因僅有1個(gè)外顯子，而AmWAK8基因有7個(gè)外顯子（圖3-A和圖3-B）。推測(cè)金魚草WAK/WAKL家族基因結(jié)構(gòu)的差異會(huì)導(dǎo)致基因功能出現(xiàn)分化或冗余。

WAK/WAKL基因家族編碼蛋白含有特征結(jié)構(gòu)域，即GUB-WAK結(jié)合域、EGF或EGF-Ca和Ser/Thr蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，其中含有EGF或EGF-Ca結(jié)構(gòu)域?yàn)閃AK家族成員，其余則為WAKL家族成員。此外，大多數(shù)WAK/WAKL家族蛋白結(jié)構(gòu)含有跨膜結(jié)構(gòu)域（TM）和信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域（SP）（圖4-A）。蛋白序列比對(duì)結(jié)果顯示，WAK/WAKL家族蛋白成員含有WAK基因家族典型的結(jié)構(gòu)域特征（圖4-B）。蛋白保守基序分析結(jié)果顯示，27個(gè)金魚草WAK/WAKL蛋白可分為三大組（I、Ⅱ和Ⅲ）（圖3-A），與圖2中系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分類結(jié)果一致，相較于Ⅱ，I和Ⅲ的基因結(jié)構(gòu)相似性更大（圖3-B）。金魚草WAK/WAKL家族蛋白含有12個(gè)保守基序，Motif1、Motif3、Motif4、Motif9、Motif6和Motif10為WAK/WAKL家族蛋白共有，組間差異主要體現(xiàn)在N端（圖3-C）。

2.5金魚草WAK/WAKL家族基因啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果

進(jìn)一步對(duì)27個(gè)金魚草WAK/WAKL基因上游2000bp的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)，并篩選出應(yīng)激、生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)和植物激素信號(hào)響應(yīng)的元件（圖5）。在應(yīng)激相關(guān)元件中，只有AmWAKL10和AmWAK3基因啟動(dòng)子序列具有創(chuàng)傷反應(yīng)元件WUN基序。此外，約65%的WAK/WAK家族基因啟動(dòng)子含有干旱誘導(dǎo)元件MBS和低溫脅迫元件LTR，30%的WAK/WAKL家族基因啟動(dòng)子包含用于防御和脅迫反應(yīng)的調(diào)控順式作用元件TC富集重復(fù)序列。在激素響應(yīng)相關(guān)元件中，90%的WAK/WAK基因啟動(dòng)子含有茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)元件（TGACG和CGTCA），少數(shù)WAK/WAKL家族基因啟動(dòng)子含有生長(zhǎng)素（IAA）響應(yīng)元件（AuxRR核心和TGA元件）、赤霉素（GA）響應(yīng)元件（GARE基序）和水楊酸（SA）響應(yīng)元件（TCA元件）。在生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)元件中，絕大多數(shù)WAK/WAKL家族基因含有分子組織響應(yīng)元件（CAT-box），僅AmWAK6有1個(gè)參與種子特異性調(diào)控的元件（RY-element）。

2.6葉片離體接種篩選金魚草抗感材料

為了驗(yàn)證WAK/WAKL家族基因在金魚草中對(duì)核盤菌的抗性，對(duì)7個(gè)云南省常見(jiàn)金魚草切花品種進(jìn)行葉片離體接種試驗(yàn)，接種36h后觀察葉片表型，初步篩選出抗性差異明顯的易感?。⊿）品種Aml和抗?。≧）品種Am6（圖6）。為進(jìn)一步明確Aml和Am6的抗性，觀察并記錄接種后0、6、12、18、24、30、36和42h葉片發(fā)病情況，并對(duì)菌斑面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖7-A和圖7-B所示。在接種后12h Aml葉片菌斑開(kāi)始從瓊脂塊向外擴(kuò)展，而Am6還未出現(xiàn)明顯可見(jiàn)的菌斑；從接種后12～42h，Am6的菌斑面積均極顯著小于Aml（Plt;0.01，下同），說(shuō)明相較于Aml，Am6品種對(duì)金魚草苗腐病表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性。由此篩選出Am6和Aml2個(gè)抗性差異明顯的材料作為后續(xù)研究的抗感材料。

2.7金魚草抗核盤菌的候選基因表達(dá)驗(yàn)證及篩選

對(duì)金魚草抗感材料Am6和Aml離體接種核盤菌24h后的葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出23個(gè)顯著（Plt;0.05，下同）差異表達(dá)的WAK/WAKL家族基因（圖8-A）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些基因的表達(dá)差異，取接種后0、6、12和24h的葉片進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有12個(gè)基因在Am6或Aml中被誘導(dǎo)表達(dá)，其中AmWAKL2、AmWAKL8、AmWAK2、AmWAK7、AmWAK8、AmWAK9、AmWAKL10和AmWAK4這8個(gè)基因在核盤菌侵染早期（0和6h）或中后期（12和24h）的抗病材料Am6中的相對(duì)表達(dá)量顯著或極顯著高于感病材料Am1，而AmWAK6、AmWAK12、AmWAK13和AmWAKL3基因表達(dá)量在接種后所有時(shí)期均表現(xiàn)為Aml顯著高于Am6。除AmWAKL10、AmWAK4和AmWAKL3外，其他9個(gè)基因表達(dá)模式（圖8-B～圖8-J）與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致。因此，初步篩選AmWAKL2、AmWAKL8、AmWAK2、AmWAK7、AmWAK8、AmWAK9、AmWAK6、AmWAK12和AmWAK13為抗病候選基因。

由于核盤菌侵染金魚草的根、莖和葉，分別引發(fā)根腐病、莖腐病和苗腐病，對(duì)27個(gè)WAK/WAKL家族基因進(jìn)行組織表達(dá)特異性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述初步篩選的9個(gè)的候選基因中，有5個(gè)基因（AmWAK7、AmWAKL2、AmWAKL8、AmWAK6和AmWAK13）在金魚草的根、莖或葉組織中高表達(dá)，而剩余4個(gè)基因（AmWAK2、AmWAK8、AmWAK9和AmWAK12）在根、莖和葉中基本不表達(dá)（圖9）。由于高表達(dá)的5個(gè)基因中AmWAK7、AmWAKL2、AmWAKL8和AmWAK6基因編碼蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)膜，AmWAK13編碼蛋白預(yù)測(cè)定位在液泡膜，推測(cè)這5個(gè)基因編碼蛋白具有受體識(shí)別DAMPs介導(dǎo)金魚草抗根腐病、莖腐病和苗腐病的潛力。因此，最終將這5個(gè)基因作為金魚草對(duì)核盤菌抗性的關(guān)鍵候選基因，用于后續(xù)分子機(jī)理研究。

3討論

WAK/WAKL蛋白家族是一類重要的受體激酶。部分模式植物或作物的研究表明，WAK/WAKL可通過(guò)識(shí)別DAMPs介導(dǎo)細(xì)胞壁抗性，從而增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的廣譜抗性（Decreux and Messiaen.，2005;Cay-rol et al.，2016），但WAK/WAKL家族在金魚草等觀賞性花卉中研究尚不深入。本研究共鑒定出27個(gè)WAK/WAKL家族基因，且家族成員間未發(fā)生串聯(lián)重復(fù)的事件。在不同物種中WAK/WAKL家族成員數(shù)量差異明顯，如從擬南芥（He et al.，1999）、馬鈴薯（余慧芳，2022;Chen et al.，2022）和山荊子（冒霞等，2022））中分別鑒定出27、26和27個(gè)WAK/WAKL基因家族成員，與本研究金魚草WAK/WAKL基因家族成員數(shù)量相近，而從水稻（Vaid et al.，2012）、大白菜（Zhang et al.，2019）和甘蔗（Wang et al.，2023）中分別鑒定出125、44和68個(gè)WAK/WAKL基因家族成員，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了金魚草WAK/WAKL基因家族成員數(shù)量。據(jù)此推測(cè)，WAK/WAKL基因家族成員在不同物種間存在著廣泛的變異和擴(kuò)展，數(shù)量的增加可能與基因重復(fù)事件有關(guān)，預(yù)示著WAK/WAKL基因家族在功能上存在冗余和分化。

植物激素是介導(dǎo)植物抵御病原體的重要信號(hào)分子，如JA主要誘導(dǎo)植物對(duì)壞死性病原體的免疫應(yīng)答，SA主要誘導(dǎo)植物對(duì)生物營(yíng)養(yǎng)和半生物營(yíng)養(yǎng)病原體的免疫應(yīng)答（Glazebrook，2005）。研究表明，植物主要通過(guò)激活JA/乙烯（ET）信號(hào)途徑來(lái)介導(dǎo)對(duì)核盤菌的抗性（Hu etal.，2021）。本研究通過(guò)金魚草WAK/WAKL基因家族成員的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，大部分家族成員均含有MeJA響應(yīng)元件（TGACG和CGTCA），推測(cè)這些WAK/WAKL基因可能通過(guò)某種機(jī)制激活JA信號(hào)途徑來(lái)介導(dǎo)金魚草對(duì)核盤菌的抗性。

基因結(jié)構(gòu)分布和保守基序是基因家族進(jìn)化和蛋白功能差異的基礎(chǔ)（Bagavathi and Malathi，1996）。WAK/WAKL家族蛋白具有胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)Ser/Thr蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，胞外結(jié)構(gòu)域能結(jié)合寡聚半乳糖醛酸、損傷誘導(dǎo)的果膠片段等信號(hào)分子，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)張和激活抗病信號(hào)通路等多種機(jī)制參與植物抗?。╖uo et al.，2015）。Zhang等（2023）在大白菜抗霜霉病的研究中發(fā)現(xiàn)，感病自交系91-112中過(guò)量表達(dá)BrWAK1基因可顯著增強(qiáng)其抗病性，而在抗病自交系T12-19中敲除BrWAKI基因能增強(qiáng)其感病性；構(gòu)建BrWAK1重要結(jié)構(gòu)域的嵌合載體，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化研究發(fā)現(xiàn)，BrWAK1的GUB結(jié)構(gòu)域變異是感病自交系91-112喪失抗性的主要原因。本研究鑒定出的金魚草WAK/WAKL家族基因均含有GUB-WAK結(jié)合域和Ser/Thr蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，其中WAK還含有EGF或EGF-Ca結(jié)構(gòu)域。深入分析這些特征結(jié)構(gòu)域的差異對(duì)進(jìn)一步揭示金魚草WAK/WAKL家族基因的生物學(xué)功能有著重要的作用。

WAK/WAKL家族基因的功能與其組織特異性表達(dá)密切相關(guān)。在擬南芥中，AtWAK1、AtWAK2、AtWAK3和AtWAK5基因主要在葉和莖中差異表達(dá)（He et al.，1999），能增強(qiáng)植株對(duì)灰葡萄球菌（Botrytis cinerea）的抗性。甘蔗SsWAK6b和SsWAK16基因在根、芽和莖表皮中高表達(dá)，參與對(duì)黑穗病病原體—鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）的免疫反應(yīng)（Wang et al.，2023）。馬鈴薯SWAKL2基因在葉片和根中特異性表達(dá)，能提高馬鈴薯對(duì)晚疫病菌（Phytophthora infestans）的抗性（Chen et al.，2022;余慧芳，2022）。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證初步篩選出9個(gè)抗病候選基因，其中5個(gè)正向調(diào)控金魚草對(duì)核盤菌的抗性，4個(gè)為負(fù)向調(diào)控金魚草對(duì)核盤菌的抗性。對(duì)篩選出的金魚草WAK/WAKL家族基因進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5個(gè)基因在金魚草的根、莖和葉組織中高效表達(dá)。由于金魚草的根、莖和葉受核盤菌侵染最為嚴(yán)重，分別引發(fā)根腐病、莖腐病和苗腐病，推測(cè)5個(gè)在金魚草根莖葉中高表達(dá)的WAK/WAKL家族基因具有更強(qiáng)的抗病功能。后續(xù)需進(jìn)一步驗(yàn)證WAK/WAKL家族基因的生物學(xué)功能，以期為金魚草抗病新品種的培育提供新的基因資源，同時(shí)篩選出WAK/WAKL蛋白的互作蛋白和下游靶標(biāo)基因，最終解析WAK/WAKL功能基因在植物抗核盤菌中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

4結(jié)論

篩選出的27個(gè)金魚草WAK/WAKL基因家族成員，具有相似的基因結(jié)構(gòu)和蛋白功能結(jié)構(gòu)域，其中AmWAK6、AmWAK7、AmWAK13、AmWAKL2和AmWAKL8為金魚草抗核盤菌的關(guān)鍵候選基因，具有介導(dǎo)抗病的潛在功能。

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（責(zé)任編輯 陳燕）