摘要：【目的】明確狂犬病病毒（RABV）強(qiáng)毒株GX074的P蛋白和M蛋白第20位苯丙氨酸（Phe）替換至弱毒株rRC-HL的重組突變體在宿主細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)特性，為P蛋白和M蛋白轉(zhuǎn)錄復(fù)制機(jī)理研究提供理論依據(jù)?！痉椒ā窟\(yùn)用反向遺傳技術(shù)以強(qiáng)毒株GX074的M蛋白第20位Phe替換弱毒株rRC-HL（GX074P）的M蛋白第20位絲氨酸（Ser），構(gòu)建rRC-HL（GX074P-MS20F）突變體感染性cDNA克隆并拯救病毒。以重組突變體感染BSR/T7-9細(xì)胞，進(jìn)行多步生長(zhǎng)曲線測(cè)定，比較重組突變體與親本毒株的生長(zhǎng)能力，采用Western blotting檢測(cè)N蛋白、P蛋白和M蛋白相對(duì)表達(dá)水平，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)N基因、P基因和M基因的相對(duì)表達(dá)量。【結(jié)果】經(jīng)RT-PCR和測(cè)序鑒定，拯救的突變體rRC-HL（GX074P-MS20F）M蛋白第20位Ser成功替換為Phe。多步生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果顯示，構(gòu)建的重組突變體在感染24、48、72和96h后，病毒滴度均高于親本弱毒株rRC-HL和對(duì)照弱毒株rRC-HL（GX074PM1），平均約為親本弱毒株rRC-HL的10倍。在蛋白表達(dá)水平上，rRC-HL（GX074P-MS20FF）毒株在感染48h后，N蛋白和M蛋白相對(duì)表達(dá)水平均極顯著高于親本弱毒株rRC-HL（Plt;0.01），說(shuō)明強(qiáng)毒株GX074的P蛋白聯(lián)合M蛋白第20位Phe替換至弱毒株rRC-HL后，增加了突變體N蛋白和M蛋白表達(dá)。感染24和48h后，rRC-HL（GX074P-MS20F）毒株N基因、P基因和M基因的相對(duì)表達(dá)量均高于親本弱毒株rRC-HL和對(duì)照弱毒株rRC-HL（GX074PM1）。【結(jié)論】強(qiáng)毒株GX074的M蛋白第20位Phe替換可提高病毒的增殖能力，同時(shí)增強(qiáng)病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄能力，M蛋白第20位Phe可能是影響病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：狂犬病病毒（RABV）;P蛋白；M蛋白；生長(zhǎng)特性；反向遺傳

中圖分類號(hào)：S852.659.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）01-0253-10

Construction of rabiesvirus GX074P-MS20Fmutant and identification of its growth characteristics

PENG Jing12，LI Wen-fang12，LU Li-ying12，WEI Xian-kai12， LI Xiao-ning1·2*，LUO Ting-rong1·2*

（'College of Animal Science and Technology，GuangxiUniversity，Nanning，Guangxi530004，China;2State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Nanning，Guangxi530004，China）

Abstract：[Objective]To clarify the growth characteristics of the recombinant mutant with the replacement of Ppro-teinand the20\"phenylalanine（Phe）of Mprotein of the strong strain of rabies virus（RABV）strainGX074to the attenua-ted strain rRC-HL in host cells，and to provide theoretical basis for the study of the transcription and replication mecha-nism ofthe Pand Mproteins.【Method]The20#serine（Ser）of Mprotein of attenuated strain rRC-HL（GX074P）was re-placedby the20Pheof Mprotein of strong strainGX074by reverse genetic technique toconstruct the infectious cDNA clone of rRC-HL（GX074P-MS20FF）mutant and rescue the virus.BSR/T7-9cell was infected by recombinant mutant，and multi-step growth curve determination was performed to compare the growth ability ofthe recombinant mutant and that of the parent strain.The relative expression levels of N，P and Mproteins were detected by Western blotting，and the rela-tive expression levels of N，P and Mgenes were detected by real-time fluorescence quantitative PCR.【Result]RT-PCR and sequencing confirmed that the20#Ser of the Mprotein of the rescued mutant rRC-HL（GX074P-MS20FF）was success-fully replaced by the20Phe.The results of the multiple-step growth curve demonstrated that the viral titer of therecombi-nant mutant was higher than that of both the parental attenuated strain rRC-HL and the control attenuated strain rRC-HL（GX074PM1）at24，48，72and96h after infection，with10times of the parent attenuated rRC-HL.In terms of protein expression，the relative expression levels of Nprotein and Mprotein of rRC-HL（GX074P-MS20F）strain were extremely significantly higher than those of the parental attenuated strain rRC-HL at48h after infection（Plt;0.01）.These results indi cated that the substitution of the Pprotein of strong strain GX074with the20#Phe of Mprotein to the attenuated strain rRC-HL increased the expression of Nand Mproteins in the mutant.The relative expression levels of N，Pand Mgenes of rRC-HL（GX074P-MS0）strain were higher than those of parental attenuated strain rRC-HL and control attenuated strain rRC-HL（GX074PM1）strain at24and48h after infection.【Conclusion]The replacement of Phe at the20#posi-tion of Mprotein of strong strain GX074can improve the proliferation ability of virus，and enhance the replication and transcription ability of virus.Phe atthe20\"position of Mprotein maybe akey site affecting the replication and transcrip-tion of virus.

Keywords：rabies virus（RABV）;Pprotein;M protein;growth characteristics;reverse genetics

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32070161）;Guangxi Natural Science Foundation（2020GXNSFAA297212）

0引言

【研究意義]狂犬病是最古老的全球性人獸共患傳染病之一，人類、家畜和野生動(dòng)物中存在種內(nèi)和種間的狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）感染，持續(xù)威脅世界公共衛(wèi)生健康。中國(guó)報(bào)告的狂犬病死亡人數(shù)在全球排名第2，僅次于印度（Tan et al.，2017），盡管近10年死亡人數(shù)每年下降20%，狂犬病仍是中國(guó)兒童第二大最常見(jiàn)的傳染病死因（Dong et al.，2020）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016—2020年中國(guó)狂犬病病例總數(shù)排名前5的省份為湖南、河南、廣西、貴州和湖北，占中國(guó)狂犬病病例總數(shù)48%（覃晴等，2020）。目前，狂犬病無(wú)藥物可治療，而狂犬病死亡人數(shù)的下降主要依靠實(shí)施暴露后預(yù)防（Post-exposure prophylaxis，PEP）措施（Zhang et al.，2017）和家犬免疫預(yù)防措施（Wei et al.，2018b）。但農(nóng)村和城市的犬疫苗接種率差異較大，從近乎0到90%不等（Wang et al.，2011）。因技術(shù)相對(duì)落后和官方政策未得到嚴(yán)格執(zhí)行等，中國(guó)針對(duì)流浪犬和野生動(dòng)物的口服疫苗仍處于實(shí)驗(yàn)室研究水平，疫苗接種率較低，因此尋找高效、強(qiáng)有力的狂犬病預(yù)防控制措施十分必要（Miao et al.，2021）。深入了解和研究RABV基因結(jié)構(gòu)、感染后發(fā)病機(jī)制和遺傳變異機(jī)制是有效控制和治療狂犬病的基本前提。【前人研究進(jìn)展】RABV形似子彈狀，長(zhǎng)約180nm，直徑約90nm，由1個(gè)內(nèi)部核衣殼和1個(gè)外部膜結(jié)構(gòu)連接形成；內(nèi)部螺旋狀核衣殼由核蛋白（N）、磷蛋白（P）和病毒RNA依賴的RNA聚合酶（L）、單鏈基因組RNA組成（孫玉章等，2015）;外部病毒囊膜由病毒糖蛋白（G）的棘狀突起和從宿主細(xì)胞獲得的雙層脂膜形成；2個(gè)部分由基質(zhì)蛋白（M）連接，M蛋白與G蛋白相互作用，形成致密的病毒囊膜（Liu et al.，2021）。RABV的P蛋白是一種多功能蛋白，幫助RABV的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和運(yùn)輸，可沿著微管軌跡操縱動(dòng)力蛋白（Liu et al.，2022）。RABV的M蛋白是病毒成熟和出芽所必需的最小病毒蛋白（Riedel et al.，2020），其在病毒囊膜和核糖核蛋白（RNP）間形成結(jié)構(gòu)橋并調(diào)節(jié)病毒和宿主蛋白的表達(dá)（Liu et al.，2021）。M蛋白調(diào)節(jié)病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制間的平衡，參與病毒的裝配和出芽、病毒基因組的調(diào)節(jié)和mRNA的合成（Finke et al.，2003），被證實(shí)與病毒致病性有關(guān)（Faber et al.，2004）。RABV的M蛋白氨基酸位點(diǎn)突變可能對(duì)病毒復(fù)制產(chǎn)生重要影響。Finke和Conzelmann（2003）構(gòu)建了重組病毒SAD M（R58G），與SAD L16毒株相比，SAD M（R58G）毒株失去下調(diào)病毒轉(zhuǎn)錄和刺激復(fù)制能力，其轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)15倍，但病毒的裝配及出芽不受影響，說(shuō)明RABV的M蛋白僅影響RNA合成的調(diào)節(jié)而不影響裝配與出芽，M蛋白的差異表達(dá)表明其在RNA合成中的調(diào)節(jié)功能獨(dú)立于病毒裝配，第58位精氨酸（Arg）具有特殊作用。Wu等（2013）以PV疫苗株（M13215）為參照，鑒定出中國(guó)各地分離株中20個(gè)氨基酸變異，根據(jù)M蛋白比對(duì)結(jié)果將突變序列分為4組，第Ⅲ組含Q17H、S20F和P2IS特異性變化位點(diǎn)，包括來(lái)自安徽、浙江、廣西、湖南、山東和上海的分離株，M基因高變區(qū)位于潛在抗原區(qū)，可能影響毒株的抗原性和致病性。GX074為廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院亞熱帶家畜疫病致病機(jī)理和防治研究團(tuán)隊(duì)2003年從廣西百色市德?？h無(wú)臨床癥狀犬分離獲得的街毒株，屬于廣西流行RABVⅡ群毒株，其M蛋白也存在Q17H、S20F和P21S特異性變化位點(diǎn)，Wei等（2018c）研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)將強(qiáng)毒株GX074的P基因或M基因替換至標(biāo)準(zhǔn)弱毒株RC-HL相應(yīng)位置構(gòu)建的重組毒株未引起小鼠死亡，而聯(lián)合突變GX074毒株P(guān)-M基因的突變體對(duì)小鼠具有致病性。陸麗瑩等（2022）進(jìn)一步研究影響GX074毒株致病性的M蛋白相關(guān)區(qū)域，將GX074毒株M蛋白的M1（1～22位氨基酸）、M2（44～46位氨基酸）區(qū)域與P蛋白聯(lián)合替換至rRC-HL毒株，結(jié)果表明重組毒株rRC-HL（GX074PM1）、rRC-HL（GX074PM12）生長(zhǎng)趨勢(shì)與親本弱毒株rRC-HL相似，但復(fù)制和增殖能力略高于毒株rRC-HL，遠(yuǎn)高于親本強(qiáng)毒株GX074和強(qiáng)毒株CVS-11，推測(cè)GX074的M蛋白M1和M2區(qū)域與病毒致病性相關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】RABV的P蛋白和M蛋白聯(lián)合突變后的致死性是否與M蛋白某個(gè)位點(diǎn)相關(guān)尚未明確。GX074毒株M蛋白第20位氨基酸為苯丙氨酸（Phe），RC-HL毒株M蛋白第20位氨基酸為絲氨酸（Ser），將中性氨基酸Ser轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷被酨he，會(huì)導(dǎo)致氨基酸的凈電荷發(fā)生變化，可能影響病毒蛋白的功能。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題]運(yùn)用反向遺傳技術(shù)以強(qiáng)毒株GX074毒株M蛋白第20位Phe替換弱毒株rRC-HL（GX074P）的M蛋白第20位Ser構(gòu)建重組突變體，進(jìn)行多步生長(zhǎng)曲線測(cè)定、Western blotting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，探究重組突變體在宿主細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)能力、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平，為P蛋白和M蛋白轉(zhuǎn)錄復(fù)制機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

街毒株GX074為前期分離獲得，弱毒株rRC-HL和重組弱毒株rRC-HL（GX074P）、rRC-HL（GX074PM1）為前期通過(guò)反向遺傳技術(shù)拯救獲得，適應(yīng)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株CVS-11由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)趙凌教授惠贈(zèng)；穩(wěn)定表達(dá)T7RNA聚合酶的BSR/T7-9細(xì)胞由亞熱帶家畜疫病致病機(jī)理和防治研究團(tuán)隊(duì)保存；感染性cDNA克隆質(zhì)粒pRC-HL（GX074P）和pRC-HL（GX074PM1）為前期通過(guò)反向遺傳技術(shù)構(gòu)建；輔助質(zhì)粒pT7IRES-RN、pT7IRES-RP和pT7IRES-RL由日本岐阜大學(xué)源宣之教授惠贈(zèng)。高保真酶Prim-erSTAR MAX DNA Polymerase、反轉(zhuǎn)錄酶Reverse Treanscriptase（M-MLV）、RNase Inhibitor、DL15000DAN Marker、DL5000DAN Marker和DL1000DAN Marker購(gòu)自日本TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶AgeI、SacⅡ購(gòu)自美國(guó)NEB公司，ClonExpress?Ⅱ一步法克隆試劑盒、總RNA提取試劑盒和胎牛血清（FBS）購(gòu)自諾唯贊生物科技有限公司，大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司，無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek公司，DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM減血清培養(yǎng)基和LipofectaminelM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司，AlexaFluor488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、熒光二抗顯色試劑盒、堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒和RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，RABVN蛋白單克隆抗體購(gòu)自杭州大毒生物科技有限公司，RABVM蛋白單克隆抗體購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司，RABV P蛋白單克隆抗體由亞熱帶家畜疫病致病機(jī)理和防治研究團(tuán)隊(duì)保存，鼠抗β-actin單克隆抗體購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，二硫蘇糖醇（DTT）購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司，脫脂奶粉購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，PVDF膜（0.45μm）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。主要儀器設(shè)備：S1000熱循環(huán)PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）、熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）、ImageQuant LAS500成像儀（美國(guó)GE HealthCare公司）、NanoDrop1000分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技有限公司）、LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀[羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司]和恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成

從GenBank下載標(biāo)準(zhǔn)弱毒株RC-HL（GenBank登錄號(hào)AB009663.2）及廣西街毒株GX074（GenBank登錄號(hào)MG201923.1）全基因組序列，采用DNAMAN進(jìn)行堿基序列比對(duì)，使用Primer5.0設(shè)計(jì)包含M蛋白第20位氨基酸突變位點(diǎn)的上、下游引物；含有Age I和SacⅡ酶切位點(diǎn)的引物根據(jù)ClonExpress?Ⅱ克隆試劑盒說(shuō)明設(shè)計(jì)；引物信息見(jiàn)表1，所有引物均委托南寧捷尼斯生物科技有限公司合成。毒株RC-HL、CVS-11和GX074的N基因、P基因、M基因及β-actin內(nèi)參基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物由亞熱帶家畜疫病致病機(jī)理和防治研究團(tuán)隊(duì)保存。

1.3重組突變體感染性cDNA克隆構(gòu)建

以前期構(gòu)建的感染性cDNA克隆質(zhì)粒pRC-HL（GX074P）為模板，用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以Age I-F和S20F-R為引物擴(kuò)增N蛋白AgeI酶切位點(diǎn)至M蛋白第20位氨基酸突變位點(diǎn)的Age I～S20F片段，以S20F-F和Sac II-R為引物擴(kuò)增M蛋白第20位氨基酸突變位點(diǎn)至M蛋白間隔區(qū)SacⅡ酶切位點(diǎn)的S20F～Sac IⅡ片段，以Age I～S20F和S20F～Sac IⅡ片段為模板，Age I-F和Sac II-R為上、下游引物進(jìn)行重疊PCR，獲得包含M蛋白第20位氨基酸突變（S20F）的Age I酶切位點(diǎn)至Sac IⅡ酶切位點(diǎn)完整片段Age I～Sac IⅡ。將質(zhì)粒pRC-HL（GX074P）進(jìn)行雙酶切，獲得線性化載體，通過(guò)一步法克隆試劑盒將重疊片段連接至pRC-HL（GX074P）線性化載體，以連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌液PCR鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、測(cè)序鑒定，獲得rRC-HL（GX074P-MS20F）突變體感染性cDNA克隆。

1.4重組突變體拯救

將構(gòu)建成功的突變體感染性cDNA克隆進(jìn)行無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提，轉(zhuǎn)染前將BSR/T7-9細(xì)胞接種至12孔細(xì)胞板，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%，按比例將突變體感染性cDNA克隆質(zhì)粒、pT7IRES-RN、pT7IRES-RL、pT7IRES-RP輔助質(zhì)粒加入Opti-MEM減血清培養(yǎng)基，脂質(zhì)體和質(zhì)?；旌衔锇?00μL每孔加入細(xì)胞板中，5h后用含2%FBS的DMEM更換孔中液體，置于二氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)6d，將12孔細(xì)胞板置于-80℃反復(fù)凍融3次，收集第1代病毒上清液及細(xì)胞置于1.5mL EP管中，4℃下12000r/min離心5min，-80℃保存；進(jìn)行間接免疫熒光（IFA）試驗(yàn)，以未接種病毒的正常細(xì)胞為陰性對(duì)照，以RABVN蛋白單克隆抗體（1：2000）為一抗，Alexa Fluor488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1：1000）為二抗，通過(guò)熒光二抗顯色試劑盒顯色，使用熒光倒置顯微鏡觀察病毒在BSR/T7-9細(xì)胞上有無(wú)特異性熒光灶。親本弱毒株rRC-HL、對(duì)照弱毒株rRC-HL（GX074PM1）、強(qiáng)毒株CVS-11、親本強(qiáng)毒株GX074的接種及測(cè)定方法同上。經(jīng)IFA鑒定成功后，取盲傳第3代的突變體培養(yǎng)液及細(xì)胞進(jìn)行RNA抽提，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用引物Age I-F和Sac II-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，進(jìn)行膠回收并測(cè)序，通過(guò)SnapGene將測(cè)序結(jié)果與參考序列進(jìn)行比對(duì)，鑒定突變體序列是否與預(yù)期一致。

1.5多步生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將BSR/T7-9細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞板，測(cè)定重組突變體病毒滴度后，按0.01MOI接種于長(zhǎng)至70%～80%的BSR/T7-9細(xì)胞，置于二氧化碳培養(yǎng)箱37℃孵育2h后，換含2%FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48、72和96h收集細(xì)胞上清液置于1.5mL EP管中，-80℃保存?zhèn)溆?。采用IFA試驗(yàn)測(cè)定各培養(yǎng)時(shí)間的病毒滴度，繪制病毒多步生長(zhǎng)曲線。親本弱毒株rRC-HL、對(duì)照弱毒株rRC-HL（GX074PM1）、強(qiáng)毒株CVS-11和親本強(qiáng)毒株GX074的接種及測(cè)定方法同上。

1.6Western blotting檢測(cè)

以0.1MOI將重組突變體接種于長(zhǎng)至70%～80%的BSR/T7-9細(xì)胞，二氧化碳培養(yǎng)箱37℃孵育2h后，換含2%FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48h收集經(jīng)RIPA裂解細(xì)胞后的蛋白樣品，-80℃保存?zhèn)溆谩５鞍讟悠方?jīng)超聲破碎，4℃下12000r/min離心15min，每管樣品加入1/5體積5×Buffer和1/10體積DTT，輕微混勻后煮沸5min。12%SDS-PAGE凝膠電泳后，分離的蛋白通過(guò)半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)印至PVDF膜中。配置5%脫脂奶粉液，封閉2h;分別按1：20000、1：8000、1：2000、1：1000比例，以TBST稀釋RABVN蛋白單克隆抗體、P蛋白單克隆抗體、M蛋白單克隆抗體和鼠抗β-actin內(nèi)參抗體，將稀釋好的一抗加入PVDF膜中塑封，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃孵育1.5h。將塑封的PVDF膜取出，置于含有TBST的玻璃皿中，在水平搖床上洗滌3次，每次10min。按1：1000比例稀釋堿性磷酸酶標(biāo)記馬抗鼠IgG，將稀釋好的二抗加入PVDF膜中塑封，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃孵育1h，將PVDF膜置于含有TBST的玻璃皿中，水平搖床上洗滌3次，每次10min。按BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒說(shuō)明對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯色，檢測(cè)病毒N蛋白、P蛋白和M蛋白相對(duì)表達(dá)水平。親本弱毒株rRC-HL、對(duì)照弱毒株rRC-HL（GX074PM1）、強(qiáng)毒株CVS-11和親本強(qiáng)毒株GX074的接種及測(cè)定方法同上，以DMEM為空白對(duì)照。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

病毒接種方法同1.6，分別于24和48h收集細(xì)胞裂解樣品，使用總RNA提取試劑盒對(duì)病毒RNA進(jìn)行抽提及RNA濃度測(cè)定，經(jīng)RT-PCR后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，采用LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀記錄數(shù)據(jù)，通過(guò)2-440法計(jì)算病毒N基因、P基因和M基因的相對(duì)表達(dá)量。親本弱毒株rRC-HL、對(duì)照弱毒株rRC-HL（GX074PM1）、強(qiáng)毒株CVS-11和親本強(qiáng)毒株GX074的接種及測(cè)定方法同上。

1.8統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism8.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），比較重組突變體rRC-HL（GX074P-MS20F）與親本弱毒株rRC-HL的Western blotting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果，分析差異顯著性，并進(jìn)行作圖。

2結(jié)果與分析

2.1重組突變體感染性cDNA克隆構(gòu)建結(jié)果

2.1.1重組突變體片段擴(kuò)增及重疊PCR結(jié)果構(gòu)建策略如圖1-A所示，以質(zhì)粒pRC-HL（GX074P）為模板，用引物Age I-F和S20F-R擴(kuò)增出N蛋白Age I酶切位點(diǎn)至M蛋白第20位氨基酸的突變片段Age I～S20F，大小約2051bp（圖1-B）。用引物S20F-F和Sac II-R擴(kuò)增出M蛋白第20位突變位點(diǎn)至M蛋白間隔區(qū)SacⅡ酶切位點(diǎn)的突變片段S20F～Sac II，大小約606bp（圖1-C）。以突變片段Age I～S20F、S20F～Sac IⅡ?yàn)槟０?，Age I-F和Sac IⅡ-R為上、下游引物進(jìn)行重疊PCR，獲得包含M蛋白第20位氨基酸突變（S20F）的Age I酶切位點(diǎn)至Sac IⅡ酶切位點(diǎn)完整序列片段Age I～SacⅡ，大小約2624bp（圖1-D）。

2.1.2重組突變體片段的連接將質(zhì)粒pRC-HL（GX074P）進(jìn)行雙酶切，獲得pRC-HL（GX074P）線性化載體，大小為12033bp（圖1-E），將線性化載體與重疊后包含M蛋白第20位氨基酸突變（S20F）的Age I酶切位點(diǎn)至SacⅡ酶切位點(diǎn)完整序列片段進(jìn)行連接，以連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR鑒定為陽(yáng)性，成功構(gòu)建rRC-HL（GX074P-MS20F）突變體感染性cDNA克隆。

2.2重組突變體拯救結(jié)果

以突變體感染性cDNA克隆質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR/T7-9細(xì)胞，收集細(xì)胞樣品進(jìn)行IFA試驗(yàn)，結(jié)果如圖2-A所示，通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察到rRC-HL（GX074P-MS20F）感染BSR/T7-9細(xì)胞有特異性熒光，且形成熒光灶。經(jīng)IFA鑒定成功后，取盲傳第3代的突變體培養(yǎng)液及細(xì)胞進(jìn)行RNA抽提，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定合格后，進(jìn)行測(cè)序并通過(guò)Snap-Gene比對(duì)，拯救的重組突變體rRC-HL（GX074P-MS20F）M蛋白第20位Ser成功替換為Phe（圖2-B）。

2.3多步生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

病毒多步生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果如圖3所示，親本強(qiáng)毒株GX074在BSR/T7-9細(xì)胞上的生長(zhǎng)能力最弱，強(qiáng)毒株CVS-11適應(yīng)細(xì)胞，在BSR/T7-9細(xì)胞上的生長(zhǎng)能力與弱毒株rRC-HL相似。對(duì)照弱毒株rRC-HL（GX074PM1）與親本弱毒株rRC-HL的生長(zhǎng)趨勢(shì)相似，而重組突變體rRC-HL（GX074P-MS20F）在感染24、48、72和96h后，病毒滴度均高于親本弱毒株rRC-HL和對(duì)照弱毒株rRC-HL（GX074PM1），平均病毒滴度約為親本弱毒株rRC-HL的10倍，說(shuō)明與將GX074毒株M蛋白第1～22位氨基酸替換至rRC-

HL毒株構(gòu)建的rRC-HL（GX074PM1）相比，M蛋白第20位Phe替換提高了弱毒株rRC-HL的增殖能力。

2.4Western blotting檢測(cè)結(jié)果

如圖4所示，與親本弱毒株rRC-HL相比，突變體rRC-HL（GX074P-MS20F）在感染細(xì)胞24h后，N蛋白、P蛋白和M蛋白相對(duì)表達(dá)水平呈不同程度上調(diào)，分別是親本弱毒株rRC-HL的1.2、1.3和1.7倍。rRC-HL（GX074P-MS20F）毒株在感染48h后，N蛋白和M蛋白相對(duì)表達(dá)水平均極顯著高于親本弱毒株rRC-HL（Plt;0.01），分別是其1.8和2.2倍。說(shuō)明強(qiáng)毒株GX074的P蛋白聯(lián)合M蛋白第20位Phe突變?nèi)肴醵局阹RC-HL后，增加了突變體N蛋白和M蛋白表達(dá)。

2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

由圖5可知，構(gòu)建的突變體rRC-HL（GX074P-MS20F）感染BSR/T7-9細(xì)胞24h后，N基因、P基因、M基因的相對(duì)表達(dá)量均高于親本弱毒株rRC-HL、對(duì)照弱毒株rRC-HL（GX074PM1）、親本強(qiáng)毒株GX074和強(qiáng)毒株CVS-11，其中N基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于親本弱毒株rRC-HL（Plt;0.05），是其51.3倍；P基因和M基因的相對(duì)表達(dá)量分別是親本弱毒株rRC-HL的18.3和12.5倍。感染48h后，rRC-HL（GX074PM1）毒株的P基因和M基因的相對(duì)表達(dá)量與親本毒株rRC-HL相比呈不同程度上調(diào)，而rRC-HL（GX074P-MS20F）毒株N基因、P基因和M基因的相對(duì)表達(dá)量分別是親本弱毒株rRC-HL的12.8、12.1和5.7倍。說(shuō)明與將GX074毒株M蛋白第1～22位氨基酸替換至rRC-

HL構(gòu)建的rRC-HL（GX074PM1）相比，將GX074毒株M蛋白第20位Phe替換至rRC-HL可提高病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制水平，與病毒多步生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果一致。

3討論

狂犬病是一種神經(jīng)性、致死性的人畜共患病，通過(guò)患狂犬病的動(dòng)物咬傷傳播。中國(guó)至少95%人類狂犬病病例是由患狂犬病的犬咬傷引起（Zhou et al.，2016）。對(duì)犬進(jìn)行狂犬病疫苗接種是預(yù)防犬感染RABV，進(jìn)而降低被咬傷人類發(fā)病率的重要措施（韋顯凱等，2016），但中國(guó)的犬疫苗接種率較低，導(dǎo)致RABV傳播頻繁并具有遺傳多樣性。近年來(lái)，RABV反向遺傳學(xué)的發(fā)展推動(dòng)了對(duì)不同病毒和宿主細(xì)胞因子在病毒致病性中所起作用的研究（杜加亮和唐青，2008）。通過(guò)反向遺傳技術(shù)可對(duì)病毒基因進(jìn)行突變、缺失、插入、互補(bǔ)等操作，推動(dòng)了對(duì)RABV分子特征、基因復(fù)制和表達(dá)、致病機(jī)理及病毒與宿主間相互作用等方面的研究（齊瑛琳等，2010）。此外，反向遺傳學(xué)在RVBV疫苗研發(fā)方面也具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，為降低RABV病原性和增強(qiáng)免疫原性提供了有效途徑（譚業(yè)平等，2010）。RABV的M蛋白具有多種功能，參與病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，M蛋白和G蛋白與RNP的膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用，分別參與病毒出芽和RNA復(fù)制（Zhang et al.，2022）。M蛋白在復(fù)制的中晚期作為一種調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)，可使最初高水平mRNA的合成轉(zhuǎn)變?yōu)橛欣诓《玖Ｗ踊蚪MRNA的裝配，以此來(lái)調(diào)節(jié)病毒轉(zhuǎn)錄與復(fù)制間的平衡（Finke et al.，2003）。本研究通過(guò)反向遺傳技術(shù)將rRC-HL的P和M蛋白的第20位Ser替換為GX074的P蛋白和M蛋白第20位Phe，結(jié)果表明M蛋白第20位氨基酸突變對(duì)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力產(chǎn)生影響。

GX01和GX074均為前期分離獲得的廣西街毒株，陸專靈（2012）根據(jù)氨基酸的差異將GX01毒株M蛋白分成4個(gè)區(qū)域（1～27、43～47、137～139和57～202），并分別替換至弱毒株rRC-HL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組病毒rRC-HL（GX01M2）的復(fù)制和出芽能力顯著降低。鐘一治（2015）針對(duì)GX01毒株M蛋白位點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)，M蛋白F44L和S46G位點(diǎn)聯(lián)合突變能顯著影響病毒的復(fù)制能力，誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的干擾素，使細(xì)胞具有抗病毒作用。曾蘭（2007）、Wei等（2018a）對(duì)GX074毒株進(jìn)行全基因組測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，GX074屬于廣西流行RABVⅡ群毒株，Ⅱ群毒株的特異性變化位點(diǎn)為Q17H、S20F和P21S，且GX074毒株可100%致死成年小鼠。Wei等（2018c）將GX074的P基因和M基因分別替換至弱毒株rRC-HL相應(yīng)位置，發(fā)現(xiàn)不能引起小鼠死亡，而聯(lián)合突變P基因和M基因能引起成年小鼠死亡。陸麗瑩等（2022）研究GX074毒株M蛋白區(qū)域功能，利用反向遺傳技術(shù)將強(qiáng)毒株GX074的P基因和部分M基因替換至弱毒株rRC-HL相應(yīng)位置，發(fā)現(xiàn)重組病毒rRC-HL（GX074PM1）和rRC-HL（GX074PM12）的生長(zhǎng)趨勢(shì)與親本弱毒株rRC-HL相似，但復(fù)制和增殖能力略高，重組病毒的復(fù)制能力遠(yuǎn)高于親本強(qiáng)毒株GX074和強(qiáng)毒株CVS-11。周桂全等（2023）研究GX074毒株P(guān)蛋白不同區(qū)域功能，將GX074毒株P(guān)蛋白第48～78位氨基酸和GX074毒株M蛋白替換至弱毒株rRC-HL相應(yīng)位置，成功構(gòu)建突變體rRC-HL（GX074P48-78M），發(fā)現(xiàn)突變體病毒滴度略低于rRC-HL毒株，但略高于GX074毒株和CVS-11毒株，說(shuō)明突變體rRC-HL（GX074P48-78M）的復(fù)制能力比親本弱毒株rRC-HL減弱，但比親本強(qiáng)毒株GX074的復(fù)制能力稍強(qiáng)，推測(cè)是由于GX074毒株P(guān)蛋白第48～78位氨基酸與M蛋白協(xié)同作用，影響了突變體的復(fù)制能力。但RABV的P蛋白和M蛋白聯(lián)合突變后的致死性是否與M蛋白某個(gè)位點(diǎn)相關(guān)尚未明確。

本研究以前期研究為基礎(chǔ)，進(jìn)一步分析P蛋白和M蛋白聯(lián)合突變后的致死性是否與M蛋白某個(gè)位點(diǎn)有關(guān)，經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)rRC-HL和GX074毒株的M蛋白存在S20F特異性變化位點(diǎn)，推測(cè)將rRC-HL毒株M蛋白第20位中性氨基酸Ser轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷被酨he，會(huì)導(dǎo)致氨基酸的凈電荷發(fā)生變化，影響蛋白功能。因此，本研究利用反向遺傳技術(shù)將GX074毒株M蛋白第20位Phe替換至rRC-HL（GX074P）毒株相應(yīng)位置，結(jié)果表明與親本弱毒株rRC-HL和對(duì)照弱毒株rRC-HL（GX074PM1）相比，重組突變體的多步生長(zhǎng)曲線明顯上調(diào)，約為親本弱

毒株rRC-HL的10倍，N基因、P基因和M基因的相對(duì)表達(dá)量，N蛋白、P蛋白和M蛋白相對(duì)表達(dá)水平均呈不同程度上調(diào)，GX074毒株M蛋白第20位Phe可能是影響病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵位點(diǎn)，表明M蛋白的單位點(diǎn)氨基酸突變能對(duì)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響，與Finke和Conzelmann（2003）的研究結(jié)果相似。在傳統(tǒng)進(jìn)化分析中，單位點(diǎn)氨基酸突變易被忽略，但其在RABV傳染性和抗原進(jìn)化中起關(guān)鍵作用，RABV的P蛋白和M蛋白聯(lián)合突變后的致死

性與M蛋白第20位Phe有關(guān)，MS20F對(duì)病毒在BSR/T7-9細(xì)胞的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有重要影響，為后續(xù)針對(duì)P蛋白和M蛋白的轉(zhuǎn)錄復(fù)制機(jī)理研究提供了理論依據(jù)。

4結(jié)論

強(qiáng)毒株GX074的M蛋白第20位Phe替換可提高病毒的增殖能力，同時(shí)增強(qiáng)病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄能力，M蛋白第20位Phe可能是影響病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵位點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯 劉可丹）