摘要：【目的】評(píng)價(jià)馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcus equi ssp.zooepidemicus，SEZ）表面蛋白FIPP（纖維蛋白原和Ig結(jié)合蛋白前體）的免疫效力，為預(yù)防SEZ感染提供新的候選疫苗抗原。【方法】根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的FIPP基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增片段克隆到原核表達(dá)載體pCold I，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，F(xiàn)IPP蛋白通過(guò)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌中表達(dá)及純化，以SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。純化后的重組蛋白FIPP（rFIPP）對(duì)

BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，二免14d后對(duì)小鼠進(jìn)行免疫保護(hù)試驗(yàn)并采集血清；解剖感染SEZ小鼠的肝臟、脾臟和肺臟進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法檢測(cè)小鼠血清中的特異性抗體IgG水平，以蛋白質(zhì)印跡（Wes-tern blotting）方法檢測(cè)重組蛋白的反應(yīng)原性，通過(guò)全血?dú)⒕囼?yàn)檢測(cè)血清的殺菌活性?！窘Y(jié)果】通過(guò)SDS-PAGE電泳可觀察到約96kD的蛋白片段，與FIPP蛋白的理論分子量相符。重組蛋白rFIPP免疫小鼠后對(duì)SEZ攻擊的保護(hù)率達(dá)70.0%。ELISA方法檢測(cè)結(jié)果表明，重組蛋白rFIPP免疫小鼠后可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體免疫球蛋白G（IgG），且極顯著高于陰性對(duì)照（Plt;0.01，下同），通過(guò)IgG亞型分析，發(fā)現(xiàn)IgG1的抗體水平顯著高于IgG2a（Plt;0.05），說(shuō)明重組蛋白rFIPP免疫后產(chǎn)生的抗體亞型以IgG1為主。全血?dú)⒕囼?yàn)結(jié)果表明，重組蛋白rFIPP超免血清對(duì)SEZ具有極顯著殺滅作用。組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，重組蛋白rFIPP免疫后能有效減弱小鼠各類器官的病理?yè)p傷?！窘Y(jié)論】經(jīng)表達(dá)純化的重組蛋白rFIPP在小鼠感染SEZ模型中具有良好的免疫保護(hù)效力，可用作制備SEZ亞單位疫苗的有效候選抗原。

關(guān)鍵詞：馬鏈球菌獸疫亞種；FIPP蛋白；免疫保護(hù)；評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào)：S852.43;S852.61文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）01-0263-09

Evaluation of immunogenicity of Streptococcus equi ssp. zooepidemicus surface protein FIPP

GUO Zheng'，LI Ya-juan12，LIN Yong-jin'，HUANG Jian-yi'，WU Zhao-ru1，HUANG Yun-fei12，LI Shun1-2，F(xiàn)U Qiang1，2

（'FoshanUniversity，F(xiàn)oshan，Guangdong528225，China;2Foshan University Veterinary Teaching Hospital， Foshan，Guangdong528225，China）

Abstract：[Objective]This study aimed to investigate the immune efficacy of the surface protein FIPP（fibrinogen-and Ig-binding protein precursor）of Streptococcns equi ssp.zooepidemicus（SEZ）and to provide anew candidate vaccine antigen for SEZ.【Method]According to the FIPP gene sequence published in the NCBI database，the primer was de-signed for PCR amplification，and the amplified fragmentwas cloned into the prokaryotic expression vector pCold I，and then transformed into Escherichia coli BL21（DE3）receptor cells.The FIPPprotein was expressed and purified in E.coli through IPTG induction.Identification by SDS-PAGE.BALB/c mice were immunized with purified recombinant FIPP（rFIPP）.14d later，the mice were immunologically protected and serum was collected.The liver，spleenand lungs of the mice infected with SEZ were dissected for histopathological observation.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to detect specific antibody IgG levels in serum of mice，the reactivity of recombinant protein was detected by Western blotting analysis，and the bactericidal activity of serum was detected by whole blood bactericidal test.【Result】The protein fragments of about96kDwere observed by SDS-PAGE electrophoresis，which was consistent with the theo-retical molecular weight of FIPP protein.The protection rate of rFIPP against SEZ attack was70.0%in mice immunized with RFIPP.ELISA assay results showed that rFIPP immunized mice with hightiter specific antibody immunoglobulinG（IgG），which was extremely significantly higher than that of negative control（Plt;0.01，the same below）.By IgG sub-type analysis，the antibody level of IgG1was significantly higher than that of IgG2a（Plt;0.05）.These results indicated that IgG1was the main antibody subtype produced after rFIPP immunization.The results of whole blood bactericidal test showed that rFIPP superimmune serum had an extremely significant killing effect on SEZ.The histopathological observa-tion showed that rFIPP immunization could effectively reduce the pathological damage of various organs in mice.【Conclu-sion]In this study，recombinant protein rFIPP obtained by expression purification has good immunoprotectiveefficacy in amouse infecting SEZ model and can be used as avalid candidate antigen for SEZ subunit vaccine.

Key words：Streptococcus equisp.zooepidemicus;FIPP protein;immune protection;evaluation

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31872443）;Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation（2022A1515140052）;Guangdong Key Construction Discipline Scientific Research Capacity En-hancementProject（2022ZDJS036）;Guangdong Postgraduate Education Innovation Plan Project（2022JGXM128）

0引言

【研究意義】馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcus equi ssp.zooepidemicus，SEZ）屬于蘭氏分群的C群鏈球菌，可引起豬、馬和牛等多種哺乳動(dòng)物呼吸道感染、敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎（Gruszynski et al.，2015;Mad?ar et al.，2015;Lin et al.，2022）。SEZ是豬鏈球菌?。⊿treptococcus suis diseases）的主要病原體之一，具有高傳染性和高致死率，已導(dǎo)致我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)巨大經(jīng)濟(jì)損失（Liang et al.，2018）。SEZ感染人類（人類接觸感染SEZ的動(dòng)物或污染SEZ的食物）則嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生健康（耿建新等，2007;Kerdsin et al.，2022）?？股丿煼ㄊ侵委熦i鏈球菌病的主要方法，但抗生素濫用會(huì)產(chǎn)生耐藥性和增加抗生素在動(dòng)物產(chǎn)品中殘留（Hulting et al.，2009;Tang et al.，2015;Baracco，2019）。使用滅活疫苗或弱毒疫苗預(yù)防豬鏈球菌病可減少使用抗生素治療的頻率，但現(xiàn)有的弱毒疫苗和滅活疫苗安全性低、免疫效力弱（Boyle et al.，2018;Lee et al.，2021;Hau et al.，2022）。纖維蛋白原和Ig結(jié)合蛋白前體（FIPP）是SEZ的重要表面蛋白，與化膿性鏈球菌的Spa蛋白具有一定同源性，理論上可作為預(yù)防SEZ的候選疫苗抗原，而重組蛋白Spa可引起機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)并產(chǎn)生保護(hù)性抗體，是一種重要的候選疫苗抗原（Ahmed et al.，2010），但目前對(duì)FIPP蛋白在SEZ感染中的作用及引起機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)的了解甚少。因此，評(píng)價(jià)FIPP蛋白的免疫原性和抗原性，對(duì)制備安全有效的新型疫苗抵御SEZ感染具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】細(xì)菌在機(jī)體內(nèi)存活通常與其表面蛋白有關(guān)，典型的細(xì)菌表面蛋白具有參與細(xì)菌黏附、免疫逃避或維持細(xì)胞生長(zhǎng)等重要功能（Mitchell and Mitchell，2010）。纖連蛋白結(jié)合蛋白通過(guò)機(jī)體纖連蛋白與彈性蛋白結(jié)合產(chǎn)生黏附作用，有助于菌體侵襲并擴(kuò)散（Keane et al.，2007;徐全圓等，2015）。Valentin等（1990）、Godehardt等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，a?巨球蛋白與鏈球菌表面的IgG結(jié)合蛋白（EAG）結(jié)合，通過(guò)抑制IgG的調(diào)理和吞噬作用引起免疫逃避。內(nèi)肽酶O通過(guò)與補(bǔ)體蛋白結(jié)合可進(jìn)行免疫逃避，且能促進(jìn)對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附侵襲，增強(qiáng)穿透血腦屏障能力（Agarwal et al.，2014;Zhou etal.，2021;尚天甜等，2022）。SEZ具有許多分泌因子和細(xì)胞表面相關(guān)因子，在宿主—病原體的相互作用間發(fā)揮關(guān)鍵作用，可作為重要的免疫靶點(diǎn)。毒力因子M蛋白（Hulting et al.，2009;Lin et al.，2011）、纖維蛋白原結(jié)合蛋白（Mechan et al.，2009;Yi et al.，2013）和內(nèi)肽酶O（尚天甜等，2022）等已被證實(shí)在SEZ侵入宿主過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中M蛋白和纖維蛋白原結(jié)合蛋白還可為誘導(dǎo)高水平特異性抗體提供保護(hù)作用，能作為亞單位疫苗用于抵御SEZ感染（Lann-ergard et al.，2005;Lin et al.，2011）。Xie等（2018）研究證實(shí)，SeseC_01411蛋白位于SEZ表面且在免疫小鼠后可引起高滴度免疫應(yīng)答，針對(duì)SeseC_01411蛋白的超免血清能有效降低細(xì)菌存活率。此外，邵俊高等（2016）通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)馬鏈球菌馬亞種EAG重組蛋白，證實(shí)表達(dá)的EAG蛋白具有良好抗原性，可有效提高體液免疫水平及保護(hù)力?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】迄今，已證實(shí)有少數(shù)SEZ表面蛋白能制備具有保護(hù)作用的亞單位疫苗，但以FIPP蛋白作為預(yù)防SEZ候選疫苗抗原的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)原核表達(dá)并純化重組蛋白FIPP（rFIPP），評(píng)估其免疫原性和抗原性，為鑒定FIPP蛋白在小鼠模型中對(duì)SEZ感染的潛在保護(hù)效果及制備安全有效的新型疫苗抵御SEZ感染提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡雌性無(wú)特定病原體（SPF）BALB/c小鼠（體質(zhì)量18.0～20.0g）購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。試驗(yàn)前觀察1周，自由采食SPF級(jí)維持鼠料（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。動(dòng)物試驗(yàn)由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：SYXK〔粵〕2019-0136）。

1.1.2引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBI已公布的FIPP基因序列，使用Primer5.0設(shè)計(jì)引物，并在引物兩端添加BamH I、SalI酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，引物序列：FIPP-F：5'-CGCGGATCCGAGGAAAATTTCG A-3'，F(xiàn)IPP-R：5'-ACGC GTCGACATCTTTTTGACGT TT-3'。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。1.1.3細(xì)菌培養(yǎng)及主要試劑SEZ C55138菌株和表達(dá)質(zhì)粒pColdI均由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院432實(shí)驗(yàn)室保存提供，使用胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）或胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）在37℃恒溫培養(yǎng)箱培育。大腸桿菌菌株DH5α和BL21（DE3）在含有氨芐青霉素（100.0mg/L）的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自艾科瑞生物工程有限公司，質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司，Ampicillin和IPTG購(gòu)自Genview公司，溶菌酶（Lysozyme）和His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（耐變性劑型）均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，10×酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）包被液、ELISA終止液和Goat Anti-Mouse IgG/HRP均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，水性疫苗佐劑Montanide Gel01PR購(gòu)自Seppic公司，DNA Marker、Premix Taq酶、Sal I和BamH I限制性內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit Ver.2.1（Solution I）及10×QuickCut Green Buffer均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，Protein Marker購(gòu)自Vazyme公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1重組質(zhì)粒pCold I-FIPP原核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取SEZ C55138菌株基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增FIPP基因的DNA片段。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，切取目的條帶所在位置的膠條，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒獲得目的片段。表達(dá)載體pCold I經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切后連接PCR產(chǎn)物構(gòu)建重組質(zhì)粒pCold I-FIPP，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在LBAmp+固體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種于LBAm+液體培養(yǎng)基培養(yǎng)8h。使用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，通過(guò)雙酶切進(jìn)行重組質(zhì)粒鑒定，將攜帶FIPP基因的質(zhì)粒命名為pFIPP。

1.2.2FIPP重組蛋白表達(dá)及純化將重組質(zhì)粒

pFIPP轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)LBAmp+液體培養(yǎng)基在37℃、220r/min條件下振蕩培養(yǎng)至D60為0.6～0.8，添加1.0mmol/L IPTG，在18℃、180r/min條件下低溫誘導(dǎo)18h。使用4℃預(yù)冷的離心機(jī)5000r/min離心15min，棄上清液，1.0g菌體加入4.0mL非變性裂解液，加入溶菌酶使其終濃度為1.0g/L。使用超聲破碎儀裂解后，對(duì)細(xì)菌裂解物以10000r/min離心20min，收集上清液和沉淀，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)可溶性蛋白和包涵體蛋白的表達(dá)情況，通過(guò)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化可溶性蛋白，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌體及純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。純化后的重組蛋白FIPP命名為rFIPP。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）分析重組蛋白

反應(yīng)原性對(duì)純化后的重組蛋白rFIPP和BL21全菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜，在含5%脫脂奶粉的TBST中封閉1h。分別用滅活SEZ免疫后的小鼠血清和陰性血清為第一抗體，以山羊抗小鼠IgG HRP為第二抗體，于37℃培養(yǎng)箱孵育1h，使用ECL超敏發(fā)光顯影液進(jìn)行顯影分析。

1.2.4小鼠免疫和攻毒將30只SPF級(jí)BALB/c小鼠（6周齡雌性）隨機(jī)平均分成3組，第1組用50.0μg純化的重組蛋白rFIPP與Montanide Gel01PR佐劑乳化進(jìn)行免疫（簡(jiǎn)稱重組蛋白rFIPP免疫），第2組小鼠接種經(jīng)Montanide Gel01PR佐劑乳化的等體積滅活SEZ C55138菌株（2×10?CFU/mL）作為陽(yáng)性對(duì)照，第3組接種經(jīng)MontanideGel01PR佐劑乳化的等體積PBS作為陰性對(duì)照。所有小鼠均采用腹腔注射進(jìn)行免疫，14d后進(jìn)行二次免疫，二免后14d通過(guò)尾靜脈采血分離血清。參考SEZ攻毒條件（Xu et al.，2022），每組小鼠均通過(guò)腹腔注射1×10?CFU SEZ C55138菌株0.5mL，連續(xù)觀察記錄14d，計(jì)算各組小鼠的存活率。當(dāng)小鼠出現(xiàn)毛發(fā)皺褶、反應(yīng)遲緩和極度嗜睡等臨床癥狀時(shí)，視作死亡。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試驗(yàn)使用純化的重組蛋白rFIPP（4.0mg/L）包被ELISA滴定板。重組蛋白rFIPP用ELISA包被液稀釋后4℃過(guò)夜，用含0.05%吐溫-20的PBS（PBST）洗滌3次后，每孔加入300.0μL含5%牛血清白蛋白的PBS（PBS-BSA）37℃封閉2h，然后用PBST洗滌3次。添加100.0μL小鼠抗重組蛋白rFIPP血清（1：400）為一抗，在37℃下孵育1h。添加1：250山羊抗小鼠IgG HRP抗體為二抗。為了測(cè)量IgG亞型，添加1：100稀釋度的IgG1HRP和IgG2a HRP。洗滌3次后，添加TMB底物顯色，添加50.0μL ELISA終止液停止反應(yīng)，隨后使用酶標(biāo)儀在450nm處讀板。

1.2.6全血?dú)⒕囼?yàn)通過(guò)體外殺菌試驗(yàn)評(píng)估小鼠抗重組蛋白rFIPP血清的殺菌活性（Voyich et al.，2009）。無(wú)菌抗凝采集3只健康BALB/c小鼠全血，將SEZ培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，菌液濃度調(diào)整為10'CFU/mL。

800.0μL健康小鼠抗凝全血與100.0μL抗重組蛋白rFIPP血清混合，以免疫前血清與抗凝全血混合為陰性對(duì)照。向混合物中加入100.0μL細(xì)菌懸液，在37℃下孵育90min，隨后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)以計(jì)算各組細(xì)菌的存活率，評(píng)估抗重組蛋白rFIPP血清的殺菌活性。

1.2.7病理組織學(xué)觀察在加強(qiáng)免疫14d后，通過(guò)腹腔注射1×10?CFU SEZ至小鼠體內(nèi)。在感染24h后對(duì)小鼠進(jìn)行剖檢，在無(wú)菌條件下切除每組小鼠（n=3）的肝臟、脾臟和肺臟，用多聚甲醛固定液固定，制作石蠟切片并進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，Adobe Photoshop CC2018制圖，以t檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒pCold I-FIPP的構(gòu)建與鑒定

以SEZ C55138菌株基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增的FIPP基因產(chǎn)物經(jīng)電泳后大小約1000bp，與理論值大?。?110bp）相符（圖1-A）。經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切連接到pCold I載體中，提取重組質(zhì)粒pCold I-FIPP通過(guò)雙酶切進(jìn)行鑒定。與對(duì)照組質(zhì)粒相比，重組質(zhì)粒中可看到大小約1000bp的片段，與預(yù)期結(jié)果（1110bp）一致，說(shuō)明已將目的基因成功連接到表達(dá)載體pCold I（圖1-B）。

2.2重組蛋白FIPP的表達(dá)及純化

將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCold I-FIPP轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)IPTG18℃誘導(dǎo)18h表達(dá)，以SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白FIPP的表達(dá)情況。與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后菌體出現(xiàn)的蛋白分子量約96kD，與預(yù)期相符，說(shuō)明蛋白成功表達(dá)（圖2-A）。誘導(dǎo)后的蛋白在沉淀和上清液中均能表達(dá)，使用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化可溶性蛋白，并以SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)，可看到純化后條帶單一的目的蛋白（圖2-B）。

2.3重組蛋白反應(yīng)原性的Western blotting分析

對(duì)重組蛋白和BL21全菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以滅活SEZ免疫后小鼠血清（陽(yáng)性血清）和PBS免疫小鼠血清（陰性血清）為一抗，以山羊抗鼠IgG HRP為二抗，進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。從圖3可看出，在陽(yáng)性血清孵育下重組蛋白rFIPP有一條清晰條帶，而陰性血清孵育下無(wú)條帶，說(shuō)明純化后的重組蛋白rFIPP在陽(yáng)性血清孵育下可發(fā)生特異性反應(yīng)，而BL21全菌蛋白因不含特異性抗原不能與陽(yáng)性血清和陰性血清相結(jié)合。

2.4重組蛋白rFIPP免疫保護(hù)試驗(yàn)及小鼠組織病理學(xué)評(píng)估

對(duì)二免14d后的小鼠腹腔注射1×10°CFU SEZ，評(píng)估各組小鼠的生存情況。其中，陰性對(duì)照的小鼠表現(xiàn)毛發(fā)皺褶、反應(yīng)遲緩，并在5d內(nèi)相繼死亡；陽(yáng)性對(duì)照的小鼠在感染3d時(shí)有1只死亡，其余小鼠表現(xiàn)輕微的臨床癥狀并存活；重組蛋白rFIPP免疫的小鼠在4d內(nèi)有3只死亡，其余小鼠表現(xiàn)輕微臨床癥狀，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)70.0%小鼠存活（圖4-A）。接種SEZ后24h，解剖重組蛋白rFIPP免疫小鼠和陰性對(duì)照小鼠的肝臟、脾臟和肺臟，進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)估，從圖4-B可看出，陰性對(duì)照的小鼠在使用SEZ C55138菌株攻擊后，其脾臟充血出血，大量巨噬細(xì)胞募集；肺臟呈肺間質(zhì)增厚、明顯出血；肝臟出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹。相比于陰性對(duì)照小鼠，重組蛋白rFIPP免疫的小鼠在組織病理學(xué)檢查中未發(fā)現(xiàn)明顯病變。說(shuō)明SEZ引起的器官損傷程度在重組蛋白rFIPP免疫后有所減輕。

2.5FIPP抗體水平檢測(cè)

在加強(qiáng)免疫后的第14d，采用間接ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中的FIPP抗體水平。從圖5-A可看出，與陰性對(duì)照相比，重組蛋白rFIPP免疫小鼠的特異性IgG抗體水平極顯著提高（Plt;0.01，下同）;進(jìn)一步檢測(cè)IgG1和IgG2a亞型，發(fā)現(xiàn)小鼠的IgG1應(yīng)答顯著高于IgG2a應(yīng)答（Plt;0.05）（圖5-B）。說(shuō)明免疫應(yīng)答的類型主要為體液免疫。

2.6全血?dú)⒕囼?yàn)結(jié)果

為驗(yàn)證rFIPP抗體是否具有殺菌活性，通過(guò)體外殺菌試驗(yàn)測(cè)試SEZ在抗rFIPP或陰性對(duì)照血清孵育的肝素化抗凝小鼠血液中的存活率。從圖6可看出，在無(wú)特異性抗體的情況下，約有91.4%的SEZ存活，在重組蛋白rFIPP的超免疫血清中，僅有48.9%的SEZ存活，說(shuō)明rFIPP抗體殺滅SEZ的能力極顯著提高。

3討論

目前，SEZ仍是我國(guó)豬鏈球菌病的主要病原體之一，隨著養(yǎng)殖企業(yè)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，該病造成的危害日益嚴(yán)重（徐宇萌等，2023）。臨床上常用青霉素、四環(huán)素和磺胺類藥物等治療馬鏈球菌病，但大多數(shù)馬鏈球菌菌株已對(duì)至少1種抗生素產(chǎn)生耐藥性，其中，對(duì)青霉素的耐藥性有所增加（張澤華等，2021;Lord et al.，2022;孫瓊飛等，2023）。傳統(tǒng)的預(yù)防豬鏈球菌病滅活疫苗和弱毒疫苗均存在明顯缺陷，其中，滅活疫苗存在大量無(wú)效成分，會(huì)引起過(guò)多非特異性免疫應(yīng)答，常需高劑量多次免疫；弱毒疫苗雖有較高的免疫原性，但可能存在毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)。因此，篩選出更多保護(hù)性抗原是有效防控SEZ的重要手段。亞單位疫苗是通過(guò)成熟DNA重組技術(shù)將抗原基因?qū)胩囟ㄊ荏w、合成和提純具有免疫原性蛋白所制成的一種新型疫苗（Liet al.，2020），因含有明顯的抗原識(shí)別成分，可避免過(guò)多無(wú)關(guān)抗原對(duì)機(jī)體的免疫刺激，提高機(jī)體免疫潛力，降低疫苗產(chǎn)生不良反應(yīng)的可能性，適合免疫功能弱的個(gè)體使用。汪夢(mèng)竹等（2022）研究表明，亞單位疫苗具有安全、不易引發(fā)感染及適合大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。此外，Timoney等（2007）、Mitchell和Mitchell（2010）、Wei等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌表面蛋白功能極多，且參與細(xì)菌黏附或抵抗宿主吞噬，隨著對(duì)毒力因子研究的不斷深入，許多表面蛋白被確認(rèn)為潛在毒力因子，可作為有潛力的疫苗候選抗原利用。為開(kāi)發(fā)更有效的亞單位疫苗，國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者對(duì)潛在的毒力蛋白進(jìn)行了研究。Hulting等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，馬鏈球菌的IgG內(nèi)肽酶IdeE和IdeE2在小鼠模型中均能產(chǎn)生抗體，可有效防止感染馬鏈球菌導(dǎo)致的體重下降。Guss等（2009）、Chen等（2021）利用多組分蛋白分別對(duì)健康威爾士山地矮種馬和健康BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，使得其對(duì)預(yù)防馬鏈球菌感染的能力顯著提高。Lin等（2011）將SEZ的類M蛋白（SZP）插入豬瘟病毒中進(jìn)行共表達(dá)，證實(shí)SZP對(duì)SEZ感染具有顯著保護(hù)作用。Yi等（2016）鑒定一種參與SEZ生物膜形成的蛋白GroEL，可有效刺激免疫反應(yīng)，防止SEZ感染。本研究中，F(xiàn)IPP蛋白具有典型的LPXTG樣基序信號(hào)，定位于細(xì)胞表面，可能是SEZ潛在的毒力因子，而Ahmed等（2010）研究表明，F(xiàn)IPP蛋白與化膿性鏈球菌的Spa蛋白具有76.0%的同源性，Spa蛋白能誘發(fā)產(chǎn)生保護(hù)性抗體抵御化膿性鏈球菌感染，對(duì)進(jìn)一步探究FIPP蛋白作為疫苗候選抗原的潛力意義重大。

本研究中，將FIPP基因插入原核表達(dá)載體pCold I，通過(guò)原核表達(dá)技術(shù)成功純化重組蛋白rFIPP，經(jīng)Montanide Gel01PR佐劑乳化的重組蛋白rFIPP抗原對(duì)SEZ的攻毒具有保護(hù)作用，重組蛋白rFIPP免疫的小鼠對(duì)SEZ C55138菌株感染具有70.0%的保護(hù)作用，而陰性對(duì)照的小鼠全部死亡；與SEZ滅活疫苗相比，重組蛋白rFIPP抗原的保護(hù)作用相對(duì)較弱，但仍表明FIPP蛋白可作為一種良好的保護(hù)抗原；采集小鼠的器官進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)重組蛋白rFIPP免疫可減輕小鼠各臟器受SEZ感染引起的損傷；ELISA檢驗(yàn)結(jié)果顯示，重組蛋白rFIPP免疫小鼠的特異性抗體水平極顯著高于陰性對(duì)照；進(jìn)一步檢測(cè)IgG1和IgG2a亞型發(fā)現(xiàn)小鼠的IgG1應(yīng)答顯著高于IgG2a應(yīng)答，而IgG2a與Th1-反應(yīng)相關(guān)，IgG1與Th2-反應(yīng)相關(guān)，表明重組蛋白rFIPP可誘導(dǎo)Th1-/Th2-免疫顯著應(yīng)答；重組蛋白rFIPP能與SEZ陽(yáng)性血清結(jié)合，說(shuō)明其具有良好的反應(yīng)原性；體外全血?dú)⒕囼?yàn)結(jié)果證實(shí)，與陰性血清相比，F(xiàn)IPP抗體在全血環(huán)境中可明顯殺滅SEZ。由此可見(jiàn)，F(xiàn)IPP蛋白可能在SEZ感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在小鼠的主動(dòng)免疫中，對(duì)SEZ感染具有顯著保護(hù)作用。因此，重組蛋白rFIPP可作為一種有效的SEZ亞單位疫苗候選抗原使用。

4結(jié)論

利用通過(guò)原核表達(dá)技術(shù)成功表達(dá)純化的重組蛋白rFIPP免疫BALB/c小鼠，對(duì)預(yù)防SEZ感染具有顯著保護(hù)作用，可減輕BALB/c小鼠各臟器病理?yè)p傷，并誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性IgG抗體，針對(duì)重組蛋白rFIPP的血清能有效降低SEZ存活率。因此，重組蛋白rFIPP可作為制備有效SEZ亞單位疫苗的候選抗原應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯 思利華）