摘要：【目的】從三七葉際分離篩選對(duì)三七葉部黑斑病病原菌具有較強(qiáng)抑制效果的生防菌株，為開(kāi)發(fā)安全高效的 生防菌劑提供菌種資源，也為中藥材病害的生態(tài)防控提供新思路?！痉椒ā坎捎眠B續(xù)稀釋法從1年生健康三七葉片中分 離可培養(yǎng)葉際微生物，通過(guò)平板對(duì)峙法測(cè)定分離菌株對(duì)三七葉部黑斑病菌人參鏈格孢菌（Alternaria panax）菌株SL17的拮抗效果，篩選對(duì)人參鏈格孢菌具有生防作用的葉際微生物菌株，結(jié)合ITS和16S rDNA測(cè)序?qū)钚跃赀M(jìn)行 分類(lèi)鑒定，挑選抑菌效果最佳的菌株進(jìn)一步進(jìn)行廣譜抑菌能力測(cè)定?！窘Y(jié)果】從健康三七葉際共分離純化得到125株分 離物，通過(guò)平板對(duì)峙法從中篩選獲得50株對(duì)人參鏈格孢菌具有明顯抑制效果的拮抗菌株，其中26株為真菌，24株為細(xì) 菌。26株拮抗真菌中，2株三七葉內(nèi)生真菌菌株NZ-14和NZ-23的抑菌效果最佳，其中康氏木霉菌（Trichoderma konin- gi）菌株NZ-14可完全抑制人參鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)，抑制率達(dá)100.00%；24株拮抗細(xì)菌中，2株三七葉內(nèi)生細(xì)菌菌株 NX-20和NX-23的抑菌效果最佳，其中枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株NX-20對(duì)人參鏈格孢菌的抑制率達(dá) 71.13%。葉際拮抗菌對(duì)三七主要病原菌抑制活性測(cè)定結(jié)果顯示，菌株NZ-14、NZ-23、NX-20和NX-23對(duì)槭菌刺孢菌（Mycocentrospora acerina）菌株DMS5、茄腐鐮刀菌（Fusarium solani）菌株F3、銹腐菌（Cylindrocarpon destructans）菌株RS006均具有良好的抑制能力，抑制率為39.26%～78.97%?！窘Y(jié)論】三七葉際存在大量具有潛在抑菌能力的微生物，其中2株木霉菌菌株NZ-14、NZ-23和2株芽孢桿菌菌株NX-20、NX-23的抑制效果最好，對(duì)三七葉部和根部主要病害病 原菌均有較強(qiáng)的抑制作用，可作為三七病害生物防控的微生物資源。

關(guān)鍵詞：三七；葉際微生物；黑斑??；拮抗菌；木霉菌；芽孢桿菌；生物功能

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.672

文章編號(hào)：2095-1191（2024）04-1035-11

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Isolation and identification of phyllosphere microbiome of Panax notoginseng （Burk.） F.H.Chen and its biocontrol functions

LU Rong， ZHANG Xiu， TIAN Guang-xiang， CHEN Chao-cang， ZHAO Yun-si，ZHU Shu-sheng， YANG Min*

（Plant Protection college， Yunnan Agricultural University/Key Laboratory of Agrobiodiversity and Pest Management， Ministry of Education/State Key Laboratory for Conservation and Utilization Bio-resources in Yunnan，Kunming， Yunnan 650201， China）

Abstract：[Objective]The purpose of the study was to isolate and screen biocontrol strains from Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen phyllosphere with strong inhibition effect against black spot disease of P. notoginseng leaves， in order to provide microbial resources for the development of safe and efficient biocontrol fungicides， as well as to provide reference for the ecological management of diseases affecting Chinese medicinal materials. 【Method ]Cultivable phyllosphere micro- biomes were isolated from healthy one-year-old P. notoginseng leaves using serial dilution method. The antagonistic effects of the isolated strains against Alternaria panax strain SL17， a pathogen causing black spot disease on P. notogin- seng leaves， were evaluated using plate confrontation method. Phyllosphere microbiome strains with biocontrol effectsagainst A. panax were screened. The active strains were classified and identified by ITS and 16S rDNA sequencing， and the strains with the best inhibition effects were further selected for the determination of broad-spectrum inhibition ability.【Result]A total of 125 isolates were isolated and purified from healthy P. notoginseng phyllosphere， from which 50 an- tagonistic strains with obvious inhibition effects against A. panax were obtained using plate confrontation method， inclu- ding 26 fungal strains and 24 bacterial strains. Among the 26 antagonistic fungi， two P. notoginseng leaf endophytic fungal strains NZ-14 and NZ-23 showed the best inhibitory effects， of which Trichoderma koningii NZ-14 could completely in- hibit the mycelial growth of A. panax with an inhibition rate of 100.00%. Among the 24 antagonistic bacterial isolates， two strains of P. notoginseng leaf endophytic bacteria NX-20 and NX-23 had the best inhibition effect， with Bacillus subti- lis NX-20 having an inhibition rate of 71.13% against A. panax. The results of the inhibitory activity assays of the phyllo- sphere antagonists against the main fungal pathogens of P. notoginseng showed that the strains NZ-14， NZ-23， NX-20 and NX-23 had good inhibition activity against Mycocentrospora acerina strain DMS5， Fusarium solani strain F3， and Cylindrocarpon destructans strain RS006， with inhibition rates ranging from 39.26% to 78.97%. 【Conclusion】There are many microbiomes in the phyllosphere of P. notoginseng with potential inhibition activity， among which the two Tricho- derma strains NZ-14 and NZ-23 and the two Bacillus strains NX-20 and NX-23 have the best inhibition effects and strong inhibitory activity against the main fungal pathogens of P. notoginseng leaves and roots， and can be used as microbial re- sources for biological control of P. notoginseng diseases.

Key words： Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen; phyllosphere microbiome; black spot; antagonistic bacteria;Trichoderma; Bacillus; biological function

Foundation items： National Natural Science Foundation of China （32060719） ; Yunnan Agriculture and Forestry Joint Key Project（202101BD070001-003）; Yunnan Young and Middle-aged Reserve Talent Project（202005AC160045）

0 引言

【研究意義】三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]為五加科人參屬多年生草本植物，由于在 止血散瘀、腫瘤抑制和心腦血管系統(tǒng)治療中具有較 強(qiáng)的藥理活性，成為我國(guó)獨(dú)具特色的大宗名貴中藥 材（黃依丹等，2022）。云南省文山州是三七道地產(chǎn) 地，三七的種植和加工已成為地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要 支柱產(chǎn)業(yè)（薄淑文等，2023）。三七屬于典型的陰生 植物，常生長(zhǎng)于溫暖潮濕的環(huán)境下，這種獨(dú)特的生長(zhǎng) 環(huán)境為許多病原微生物提供了理想的生長(zhǎng)繁殖空 間，易誘發(fā)多種病害（闕祖亮等，2020）。近年來(lái)，黑 斑病成為三七的主要葉部病害之一，在各產(chǎn)區(qū)均有 發(fā)生，葉片被侵染后會(huì)產(chǎn)生近圓形或不規(guī)則水浸狀 病斑，導(dǎo)致成株落葉、幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)及莖稈頂端腐爛枯 死，常年發(fā)病率在25%～35%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)90%以上 （湯紅等，2020），給三七產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了毀滅性災(zāi)難。經(jīng) 過(guò)多年研究，已基本明確了三七黑斑病的病原菌種 類(lèi)及其發(fā)生流行規(guī)律，并探索出系列以化學(xué)農(nóng)藥為 主的防治措施（楊婷等，2018；湯紅等，2020）。但生 產(chǎn)實(shí)踐表明，化學(xué)殺菌劑的長(zhǎng)期大量使用易造成病 原菌快速進(jìn)化產(chǎn)生抗藥性、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等 一系列問(wèn)題，不僅不能有效控制病害，反而破壞了植 株的生態(tài)平衡，加重葉部病害的發(fā)生和危害。因此， 探索開(kāi)發(fā)安全高效的生物防治方法已成為三七葉部 病害防治中亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。【前人研究進(jìn)展】 自L(fǎng)indow和Leveau（2002）提出“葉際微生物學(xué)”概 念后，葉際逐漸成為植物領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)。葉際 是植物重要的生態(tài)位，主要包括葉、莖、花和果實(shí)等，為許多微生物提供了廣闊的棲息地（Zhan et al.，2022）。其中，一些微生物以附生的形式存在于植物表面，另一些微生物作為內(nèi)生菌定殖于組織內(nèi)部，這些與葉際生境相關(guān)的微生物群落稱(chēng)為葉際微生物（Leveau，2019;Chen et al.，2020）。由于葉際是一個(gè)非常苛刻且不穩(wěn)定的生境，經(jīng)過(guò)層層篩選，能適應(yīng)葉際環(huán)境的微生物才能最終定殖下來(lái)，并在與植物長(zhǎng)期的互作交流過(guò)程中逐漸形成互相促進(jìn)、拮抗或共生的關(guān)系（Zhu et al.，2022）。研究證明，葉際是一個(gè)尚未開(kāi)發(fā)的功能微生物組庫(kù)，葉際微生物組具有潛在抵御病原菌的能力（Zhan et al.，2022）。周春元等（2021a）從林下人參葉片中分離獲得的蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）對(duì)人參灰霉病菌有較強(qiáng)的抑制效果；Li等（2022）從柑橘葉片中分離到的甲基桿菌（Methylobacterium）、泛菌（Pantoea）和鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas spp.）等細(xì)菌對(duì)柑橘黑點(diǎn)病菌柑橘間座殼菌（Diaporthe citri）具有較強(qiáng)的拮抗作用；張玉仙等（2023）從野生黃花倒水蓮中分離到的內(nèi)生真菌對(duì)三七根腐病菌（Fusarium solani）、葉點(diǎn)霉（Phyl-losticta zingiberi）、苦玄參葉斑病菌（Scrophularianingpocnsis）、水稻惡苗病菌（F.moniliforme Sheld.）、煙草灰霉病菌（Botrytis cinerea Pevs.）和黑曲霉（Aspergillus niger）6種植物病原菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，說(shuō)明在植物的葉際定殖著一些能參與植株抗病和維持植株健康的有益微生物。此外，Gopane等（2021）研究證明大多數(shù)藥用植物中寄生著大量微生物，可用于抵御病原體入侵，但不會(huì)引起寄主植物產(chǎn)生病害癥狀。目前，從健康中藥材自身分離對(duì)病原菌具有拮抗作用的生防菌已成為中藥材病害綠色防控的研究熱點(diǎn)（王占斌等，2022），并在鐵皮石斛莖腐?。ㄆ菥辗?，2021）、人參根腐?。ㄖ艽涸?，2021b）、刺五加黑斑?。ǘ∑G哲等，2023）和枸杞根腐?。ê虿氏嫉?，2023）等中藥材病害防治中得到廣泛運(yùn)用。已有研究表明，三七根際環(huán)境存在較豐富的生防菌資源，董姚君（2022）在三七根際土壤中分離獲得的貝萊斯芽孢桿菌和產(chǎn)酶溶桿菌可有效降低三七根腐病發(fā)病率；李玥等（2023）從健康三七根際土壤中獲得的2株木霉菌對(duì)三七主要根腐病菌均具有較強(qiáng)的拮抗作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】從根際環(huán)境中分離篩選抑菌微生物防治三七根部病害的策略已得到大量研究證實(shí)，但三七葉際是否存在對(duì)葉部主要病害具有抑制效果的生防菌株目前尚未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用連續(xù)稀釋法從1年生健康三七葉際分離可培養(yǎng)微生物，利用對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定分離菌株對(duì)三七葉部黑斑病菌人參鏈格孢菌（Alternaria panax）的拮抗活性，在此基礎(chǔ)上結(jié)合ITS和16SrDNA對(duì)拮抗菌株進(jìn)行分類(lèi)鑒定，并挑選抑制效果最佳的菌株進(jìn)一步測(cè)定評(píng)價(jià)其廣譜抑菌能力，以期獲得對(duì)三七主要病害黑斑病和根腐病具有較強(qiáng)抑制活性的生防 菌株，為開(kāi)發(fā)安全高效的生防菌劑提供菌種資源，也 為中藥材病害的生態(tài)防控提供新思路。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試三七葉片

供試三七葉片于2022年4月 采集自云南省尋甸縣云南農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代教育科研基 地（25°31'8.0\"N，103°16'41.6\"E，海拔1980m）種植 的1年生健康三七。

1.1.2供試病原菌

三七黑斑病菌人參鏈格孢菌 （A.panax）菌株SL17、圓斑病菌槭菌刺孢菌（Myco- centrospora acerina）菌株DMS5、根腐病菌茄腐鐮 刀菌（F.solani）菌株F3和銹腐菌（Cylindrocarpon destructans）菌株RS006均來(lái)自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生 物多樣性與病害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，其中菌株 SL17和菌株DMS5為葉部病害病原菌，菌株F3和菌株RS006為根部病害病原菌。

1.1.3供試培養(yǎng)基

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂15g/L；LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaC15g/L、瓊脂15g/L；LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaC15g/L。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1三七葉表微生物分離純化

參考Li等（2022）的方法并略作修改。佩戴無(wú)菌手套采集新鮮三七葉片并置于4℃冰盒運(yùn)輸至無(wú)菌操作間。在超凈工作臺(tái)上稱(chēng)取2g健康三七葉片至250mL錐形瓶中，加入100mL0.1mol/L無(wú)菌磷酸鉀緩沖液，用無(wú)菌封口膜封口后于20℃、25kHz條件下超聲處理15min，然后置于20℃、200r/min的搖床上振蕩1h后獲得葉表微生物洗脫液，隨后將葉表洗脫液依次稀釋10、100、1000和10000倍后，分別取200μL稀釋液均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上，以涂布等體積滅菌水為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)，25℃黑暗條件下培養(yǎng)3d后，挑取形態(tài)不同的菌落至新的培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，真菌菌落使用PDA培養(yǎng)基，細(xì)菌菌落使用LB培養(yǎng)基，純化培養(yǎng)后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2三七葉內(nèi)微生物的分離純化

參考Li等（2022）的方法并略作修改。在超凈工作臺(tái)上將1.2.1 洗脫后的三七葉片置于75%乙醇中浸泡1min， 1%次氯酸鈉溶液（含0.1%Tween）浸泡3min，75% 乙醇浸泡30s，無(wú)菌水沖洗3次，即視為對(duì)葉片表面 進(jìn)行無(wú)菌化處理，用無(wú)菌剪刀將葉片剪碎，置于無(wú)菌 研缽中，加入5mL0.1mol/L無(wú)菌磷酸鉀緩沖液研磨 至勻漿狀。將葉片勻漿依次稀釋10、100、1000和 10000倍后，分別取200μL稀釋液均勻涂布在PDA 培養(yǎng)基上，以最后一次沖洗完葉片的滅菌水涂布在 PDA培養(yǎng)基上作為空白對(duì)照，驗(yàn)證葉片表面的消毒 情況。每處理3個(gè)重復(fù)，25℃黑暗條件下培養(yǎng)3d 后，挑取形態(tài)不同的菌落至新的培養(yǎng)基上進(jìn)行純化， 真菌菌落使用PDA培養(yǎng)基，細(xì)菌菌落使用LB培養(yǎng) 基，純化培養(yǎng)后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3三七葉際拮抗菌株篩選

采用平板對(duì)峙法篩選拮抗菌株。真菌拮抗菌株篩選：取PDA培養(yǎng)基上活化的菌株SL17，用打孔器制成直徑為5mm的菌餅，在距平板中心1.5cm的對(duì)稱(chēng)位置分別接種已純化的三七葉際真菌菌株和菌株SL17，每處理3個(gè)重復(fù)，以接種空白PDA培養(yǎng)基和菌株SL17為對(duì)照，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)4d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌落生長(zhǎng)抑制率。細(xì)菌拮抗菌株篩選：將純化好的細(xì)菌在培養(yǎng)基上劃線(xiàn)后培養(yǎng)2d，挑取單菌落放入2mLLB液體培養(yǎng)基中，置于37℃、150r/min搖床上振蕩培養(yǎng)24h后，利用酶標(biāo)儀將細(xì)菌濃度OD600調(diào)整為0.6備用。取PDA培養(yǎng)基上活化的菌株SL17，用打孔器制成直徑為5mm的菌餅，置于平板中心，用移液槍吸取5μuL細(xì)菌菌液，置于

1.2.4三七葉際拮抗菌株鑒定

根據(jù)觀察到的菌落形態(tài)特征，將與菌株SL17有拮抗作用且形態(tài)特征不同的葉際微生物進(jìn)行初步分類(lèi)。隨后進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定：使用Trelief?Hi-Pure Plant Genomic DNAKit高效植物基因組DNA提取試劑盒提取待測(cè)菌株基因組DNA。采用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對(duì)真菌ITS片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系50 μL：1×TSE102 Tag PCR Mix 45 μL，上、下游引物（10pmol/uL）各2μL，DNA模板1puL。擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性2min；98℃10s，56℃10s，72℃10s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。使用36F（5'-TCTGGCTCAGGATGAACGC-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對(duì)細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系50μL：1×TSE102 Tag PCR Mix 45 uL，上、下游引|物（10 pmol/uL）各2μL，DNA模板1μL。擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性2min；98℃10s，56℃10s，72℃20s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°℃延伸5min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后送至北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序所得的堿基序列經(jīng)DNAMAN拼接后與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，對(duì)分離自三七葉片表面和內(nèi)生真菌菌株與來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已登錄菌株的ITS序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，對(duì)分離自三七葉片表面和內(nèi)生細(xì)菌菌株與來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已登錄菌株的16SrDNA序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，以相似性達(dá)97%以上的標(biāo)準(zhǔn)選擇參考菌株，明確拮抗菌株的分類(lèi)地位。

1.2.5三七葉際拮抗菌對(duì)三七主要病原菌抑制活性測(cè)定

將抑制效果明顯的三七葉際拮抗菌株與三七植株主要病原菌菌株SL17、DMS5、F3和RS006進(jìn)行平板對(duì)峙培養(yǎng)，測(cè)定葉際拮抗菌對(duì)三七主要病原菌的抑制活性，方法同

1.2.3。1.3統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2016和SPSS 24.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；使用DNAMAN進(jìn)行序列拼接。

2結(jié)果與分析

2.1三七葉際微生物分離結(jié)果

采集的1年生健康三七葉片經(jīng)葉表面緩沖液洗脫、葉片研磨勻漿、平板涂布培養(yǎng)及分離純化，共分離得到125株分離物，其中葉表真菌55株，編號(hào)為Z;葉表細(xì)菌19株，編號(hào)為X;葉內(nèi)生真菌26株，編號(hào)為NZ，葉內(nèi)生細(xì)菌25株，編號(hào)為NX。

2.2三七葉際拮抗菌株篩選結(jié)果

通過(guò)平板對(duì)峙法獲得50株對(duì)菌株SL17具有抑制作用的菌株。從三七葉片表面共分離獲得 18 株對(duì)菌株SL17具有拮抗作用的真菌，其中菌株Z-32 的抑制效果最好，抑制率達(dá)61.90%，菌株Z-9的抑制活性最低，抑制率僅為22.62%;從三七葉片表面共分離獲得9 株對(duì)菌株SL17具有拮抗作用的細(xì)菌，其中菌株 X-17 的抑制效果最好，抑制率達(dá) 64.67%，菌株X-7 的抑制活性最低，抑制率僅為26.43%（表1）。從三七葉片內(nèi)部共分離獲得8 株對(duì)菌株 SL17具有拮抗作用的真菌，其中菌株NZ-14的抑制作用最強(qiáng)，能在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量絮狀菌絲，并迅速擴(kuò)散至整個(gè)平皿，完全覆蓋菌株SL17菌餅，抑制率達(dá)100.00%，而菌株NZ-1 的抑制活性最低，抑制率僅為 10.71%;在三七葉片內(nèi)部共分離獲得15株對(duì)菌株SL17具有拮抗作用的細(xì)菌，絕大多數(shù)葉內(nèi)生細(xì)菌的抑制率在60.00%以上，其中菌株NX-20的抑制效果最好，抑制率達(dá)72.29%，菌株NX-3 的抑制活性最低，抑制率僅為48.27%（表2）。

2.3三七葉際拮抗菌株鑒定結(jié)果

2.3.1三七葉際拮抗真菌菌株鑒定結(jié)果

三七葉表分離真菌菌株在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果（表3）顯示，18株菌株分屬于10個(gè)不同的屬，其中，4株菌與Penicillium的參考菌株相似性較高，約占總分離菌株的22.2%，說(shuō)明三七葉片表面附著大量的青霉菌，是優(yōu)勢(shì)菌群；1株菌與Aspergillus terreus（MT558939.1）的相似性最高；2株菌與Paraconio-thyrium brasiliense的相似性最高;1株菌與Botrytiscaroliniana（MT548671.1）的相似性最高；1株菌與Sydowia polyspora（MN538352.1）的相似性最高；1株菌與Cytospora sp.QY-2019e（MK432630.1）的相似性最高；3株菌與Diaporthe的參考菌株相似性最高；2株菌與Pestalotiopsis的參考菌株相似性最高；1株菌與Mucor phayaoensis MFLUCC 21-0044（NR178159.1）的相似性最高；2株菌與Irpex的參考菌株相似性最高。

從葉片勻漿中分離得到的內(nèi)生真菌菌株在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果（表4）顯示，8株菌株分屬于6個(gè)不同的屬，其中，3株菌與Trichoderma的相 似性最高，占總分離菌株的37.5%，說(shuō)明木霉屬真菌 是三七葉片內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌群；1株菌與Chaeto- miaceae sp. strain KUNCC22-10767（ON520769.1）的 相似性最高；1株菌與Clonostachys sp.strain MSX 75296（MH421858.1）的相似性最高；1株菌與Para-coniothyrium brasiliense（MK762584.1）的相似性最 高;1株菌與Cytospora eucalypticola strain P7_G2_ 740（KU325390.1）的相似性最高；1株菌與Ceratoba- sidium sp.strain SI11（MT077151.1）的相似性最高。

綜上所述，三七葉際共分離得到26株對(duì)人參鏈 格孢菌菌株SL17具有拮抗作用的真菌，分別歸屬于 14屬，其中殼囊孢屬和擬盾殼霉屬在三七葉片表面 和內(nèi)生菌中均有定殖，葉表中的優(yōu)勢(shì)種群為青霉菌， 而葉內(nèi)生菌的優(yōu)勢(shì)種群為木霉菌。

2.3.2三七葉際拮抗細(xì)菌菌株鑒定結(jié)果

三七葉 表分離細(xì)菌菌株在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果 （表5）顯示，9株菌株分屬于5個(gè)不同的屬，其中5株 菌與Bacillus的參考菌株相似性較高，約占葉表總 分離細(xì)菌菌株的55.6%，說(shuō)明三七葉片表面存在大 量的芽孢桿菌，是細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)種群；1株菌與Pandoraea sputorum strain yy301（MN177229.1）的相似性最高；1株菌與Peribacillus frigoritolerans strainHBG2（MG516137.1）的相似性最高；1株菌與Brevi-bacterium linens strain B1（MG757546.1）的相似性最高；1株菌與Rhodococcus rhodochrous strain SNP2R（MZ389925.1）的相似性最高。

從葉片勻漿中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌菌株在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果（表6）顯示，15株菌株分屬于3個(gè)不同的屬。13株菌與Bacillus的參考菌株相似性較高，約占葉內(nèi)生總分離細(xì)菌菌株的86.7%，說(shuō)明三七葉片中也存在大量的芽孢桿菌，是葉內(nèi)生細(xì)菌群落中的優(yōu)勢(shì)種群，其中，6株菌與Bacillus subti-lis的參考菌株相似性較高，2株菌與Bacillus amylo-liquefaciens的參考菌株相似性較高；2株菌與Bacil-lus velezensis的參考菌株相似性較高；1株菌與Bacil-lus zanthoxyli strain 1910ICU241（MT225770.1）的相似性最高；1株菌與Bacillus vallismortis strain S1-5-1（MT509950.1）的相似性最高；1株菌與Bacillus sia-mensis strain cqsM9（MN826567.1）的相似性最高。此外，1株菌與Paenibacillus terrae HPL-003（CP003107.1）的相似性最高；1株菌與Streptomyces sp.strainBC1004（MK134629.1）的相似性最高。

綜上所述，三七葉際共分離得到24株對(duì)人參鏈格孢菌菌株SL17具有拮抗作用的細(xì)菌，分屬于7個(gè)屬，其中芽孢桿菌屬細(xì)菌約占葉際拮抗細(xì)菌總數(shù)的75.0%，說(shuō)明三七葉片表面和內(nèi)部均存在大量具有拮抗功能的芽孢桿菌。

2.4三七葉際拮抗菌株抑菌譜測(cè)定結(jié)果

2.4.1三七葉際拮抗真菌抑菌譜測(cè)定結(jié)果

根據(jù)鑒定結(jié)果，分離得到的26株三七葉際真菌中，菌株NZ-14和NZ-23對(duì)菌株SL17的抑制作用較強(qiáng)，明顯高于其他菌株，因此，進(jìn)一步對(duì)康氏木霉菌（T.konin-gii）菌株NZ-14和T.scalesiae菌株NZ-23對(duì)三七主要病原菌菌株SL17、DMS5、F3和RS006的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果（圖1）顯示，菌株NZ-14對(duì)供試三七主要病原菌的抑制作用差異顯著（Plt;0.05，下同），對(duì)三七葉部病原菌菌株SL17和DMS5的抑制效果（78.97%～100.00%）顯著高于對(duì)根部病原菌菌株F3和RS006的抑制效果（54.72%～74.15%），其中對(duì)菌株SL17的抑制率最高，達(dá)100.00%；菌株NZ-23對(duì)供試三七主要病原菌的抑制作用差異顯著，對(duì)三七葉部病原菌菌株SL17和DMS5的抑制效果（75.40%～87.10%）顯著高于對(duì)根部病原菌菌株F3和RS006的抑制效果（50.47%～70.34%），其中對(duì)菌株SL17的抑制率最高，達(dá)87.10%。

總體而言，菌株NZ-14和NZ-23均能顯著抑制三七主要病害病原菌，對(duì)供試病原菌的抑制率均大于50.0%，但對(duì)不同致病菌株的抑制效果存在差異，對(duì)人參鏈格孢菌的抑制效果最佳，對(duì)茄腐鐮刀菌的抑制率最低。

2.4.2三七葉際拮抗細(xì)菌抑菌譜測(cè)定結(jié)果

根據(jù)鑒定結(jié)果，分離得到的24株三七葉際細(xì)菌中，三七葉內(nèi)生細(xì)菌菌株NX-20和NX-23對(duì)菌株SL17的抑制作用較強(qiáng)，抑制率均高于69.00%。因此，進(jìn)一步對(duì)枯草芽孢桿菌（B.subtilis）NZ-20和暹羅芽孢桿菌（B.siamensis）NZ-23對(duì)三七主要病原菌菌株SL17、DMS5、F3和RS006的抑菌譜進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果（圖2）顯示，菌株 NX-20對(duì)供試三七主要病原菌的抑制作用差異顯著，其中對(duì)菌株SL17 的抑制效果最佳，抑制率達(dá) 71.13%，顯著高于對(duì)其他 3 株病原菌菌株的抑制率，其次為菌株F3 和RS006，抑制率分別為68.33%和 52.60%，對(duì)菌株 DMS5 的抑制效果最差，抑制率僅為 43.91%;菌株NX-23 對(duì)供試三七主要病原菌的抑制作用差異顯著，其中對(duì)菌株SL17 的抑制率最高，為68.59%，顯著高于對(duì)其他3 株病原菌菌株的抑制率，其次為菌株RS006和F3，對(duì)菌株DMS5 的抑制率最低，為39.26%。

總體而言，菌株NX-20和NX-23 均能顯著抑制三七主要病原菌，但2株細(xì)菌對(duì)葉部病原菌人參鏈格孢菌和槭菌刺孢菌的抑制效果存在明顯差異，而對(duì)根部病原菌茄腐鐮刀菌和銹腐菌的抑制效果相似。

3討論

本研究分別采用葉表洗脫和葉片勻漿的方式提取健康1年生三七葉際微生物，經(jīng)分離共得到125株分離物，其中50株對(duì)三七黑斑病菌具有明顯的抑制活性。進(jìn)一步測(cè)定抑制效果顯著的木霉菌NZ-14和NZ-23和芽孢桿菌NX-20和NX-23對(duì)三七主要病原菌的抑制活性，結(jié)果顯示木霉菌NZ-14和NZ-23及芽孢桿菌NX-20和NX-23不僅能明顯抑制三七葉部主要病原菌菌絲生長(zhǎng)，還能明顯拮抗三七根腐病主要病原菌菌絲生長(zhǎng)，對(duì)三七病害防治具有良好的應(yīng)用前景。

本研究從三七葉表洗脫液中分離獲得了大量真菌菌株，從葉片勻漿中則獲得了大量細(xì)菌菌株，初步說(shuō)明三七葉際真菌大量附著在三七葉片表面，而葉際細(xì)菌則大部分定殖于三七葉片內(nèi)部，其原因?yàn)槿~際是一個(gè)開(kāi)放的系統(tǒng)，定殖于葉際的微生物組受寄主基因型、生長(zhǎng)發(fā)育階段及生長(zhǎng)環(huán)境等因素共同影響（Bodenhausen et al.，2014; Gong and Xin，2021;Zhu et al.，2022），致使葉際微生物的分布在不同生態(tài)位表現(xiàn)出明顯差異。本研究在三七葉際共分離得到26株對(duì)人參鏈格孢菌具有拮抗作用的真菌，分別歸屬于14屬，其中殼囊孢屬和擬盾殼霉屬在三七葉表面和葉內(nèi)均有定殖；在三七葉際共分離得到24株對(duì)人參鏈格孢菌有拮抗作用的細(xì)菌，分別歸屬于7個(gè)屬，其中芽孢桿菌屬在葉表和葉內(nèi)均有定殖，與Mullens和Jamann（2021）通過(guò)熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn)葉內(nèi)生菌和葉表附生菌可通過(guò)葉片氣孔和傷口進(jìn)行遷移和轉(zhuǎn)化的研究結(jié)果一致，說(shuō)明葉表和葉內(nèi)微生物存在“互作交流”現(xiàn)象，也證明了葉際微生物與環(huán)境聯(lián)系密切。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，葉表拮抗真菌中的優(yōu)勢(shì)菌群是青霉菌屬，而葉內(nèi)生拮抗真菌中的優(yōu)勢(shì)種群是木霉菌屬，說(shuō)明在葉際的不同生態(tài)位點(diǎn)存在著不同種類(lèi)的真菌菌群。而三七葉表和葉內(nèi)生細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群均為芽孢桿菌，說(shuō)明芽孢桿菌可作為三七潛在生防功能菌進(jìn)行后續(xù)開(kāi)發(fā)利用。

已有研究表明，生活在葉際的微生物可通過(guò)產(chǎn)生抑菌物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)及位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)、激活植物防御系統(tǒng)等方式增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗性（Vogel et al.，2016；Preininger et al.，2018）。本研究通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)三七葉際存在大量對(duì)人參鏈格孢菌具有直接拮抗作用的微生物，與Ritpitakphong等（2016）從擬南芥葉片表面分離獲得可直接拮抗病原真菌的葉際微生物，進(jìn)而保護(hù)擬南芥免受真菌病原體侵染的研究結(jié)果一致。但從抑制效果看，分離自葉表和葉內(nèi)的葉際真菌和細(xì)菌，對(duì)人參鏈格孢菌的抑制率存在明顯差異，對(duì)于真菌，分離自葉表的真菌對(duì)人參鏈格孢菌的抑制率最高為61.90%，而三七葉內(nèi)生真菌對(duì)人參鏈格孢菌的抑制率最高達(dá)100.00%，說(shuō)明葉際真菌菌株的抑菌效果還與葉際微生物的來(lái)源有關(guān)，因此，在三七葉際真菌生防菌株的開(kāi)發(fā)中應(yīng)更多地關(guān)注內(nèi)生真菌類(lèi)群，以期尋找到更多具有高效抑菌功能的菌株。對(duì)于細(xì)菌，分離自葉表的細(xì)菌對(duì)人參鏈格孢菌的抑制率最高為64.67%，而三七葉內(nèi)生細(xì)菌對(duì)人參鏈格孢菌的抑制率最高為72.29%，抑菌活性差異不大，因此均可作為生防菌資源。

本研究篩選出的葉際真菌中2株木霉菌屬真菌NZ-23和NZ-14對(duì)人參鏈格孢菌的抑制效果最佳，經(jīng)鑒定菌株NZ-23為T(mén).scalesiae，菌株NZ-14為康氏木霉菌，在室溫下均可迅速產(chǎn)生大量菌絲，從而顯著抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)，尤其是菌株NZ-14可在3～4d內(nèi)長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿，能完全覆蓋人參鏈格孢菌菌餅并抑制其菌絲生長(zhǎng)，抑制率達(dá)100.00%，與王天君（2021）報(bào)道木霉具有較強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和空間占位能力，可加強(qiáng)其對(duì)病原菌的抑制和防控的研究結(jié)果一致，表明三七葉際分離到的木霉菌可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)的方式直接拮抗病原菌，從而增強(qiáng)三七葉片對(duì)病原菌的抗性。與此同時(shí)，2株木霉菌對(duì)三七主要病原菌均有較強(qiáng)的抑制作用，故均可作為生防菌資源進(jìn)行后續(xù)探索，但2 株木霉菌對(duì)三七黑斑病菌人參鏈格孢菌和圓斑病槭菌刺孢菌等葉部病害病原菌的抑制效果優(yōu)于對(duì)根部病害病原菌茄腐鐮刀菌和銹腐菌的抑制效果，原因可能是葉際分離得到的微生物與葉部病原菌所處的生態(tài)位點(diǎn)較接近，故對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生存空間的競(jìng)爭(zhēng)更占優(yōu)勢(shì)。

本研究篩選出的葉際細(xì)菌中，2株芽孢桿菌屬細(xì)菌NX-20和NX-23 經(jīng)鑒定分別為枯草芽孢桿菌和暹羅芽孢桿菌，對(duì)葉部病原菌人參鏈格孢菌的抑制效果最佳，抑菌率均大于 68.00%，對(duì)根部病原菌茄腐鐮刀菌和銹腐菌的抑制效果相似，抑菌率均大于50.00%，與李審微等（2020）研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌M-23能有效防治柑橘砂皮病、鐘雙鳳等（2021）發(fā)現(xiàn)暹羅芽孢桿菌可有效抑制番茄青枯病菌的研究結(jié)果一致，說(shuō)明葉際芽孢桿菌屬細(xì)菌可作為三七病害生防菌資源進(jìn)行生物菌劑開(kāi)發(fā)。但本研究發(fā)現(xiàn)，2 株芽孢桿菌對(duì)葉部圓斑病病原菌槭菌刺孢菌的抑制率顯著低于對(duì)人參鏈格孢菌的抑制率，其原因是三七圓斑病菌槭菌刺孢菌需在 20 ℃下全光照培養(yǎng)才可正常生長(zhǎng)（戴蕾等，2017），而枯草芽孢桿菌和暹羅芽孢桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為36～38°℃（王晴等，2021；湯永玉等，2023），低溫條件下2株芽孢桿菌的抑菌活性受到限制，導(dǎo)致其對(duì)槭菌刺孢菌的抑制作用減弱，因此，在后續(xù)生防制劑的開(kāi)發(fā)中還需進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)方案，從而提高其抑菌效率。此外，劉天波等（2021）研究表明從健康煙葉中分離到的拮抗菌群對(duì)煙草野火病的防治效果更佳，說(shuō)明與單一靶向生防菌相比，生防菌群的適應(yīng)性更強(qiáng)。因此，在未來(lái)的研究中，還需從葉際生防菌群角度出發(fā)，進(jìn)一步探索開(kāi)發(fā)三七葉際微生物拮抗菌群，以提高葉際微生物在生物防治中的綜合應(yīng)用潛力。

4結(jié)論

三七葉際存在大量具有潛在抑菌能力的微生物，其中從葉片勻漿中分離獲的2株木霉菌康氏木霉菌NZ-14、T.scalesiae NZ-23和2株芽孢桿菌枯草芽孢桿菌NX-20、暹羅芽孢桿菌NX-23的抑制效果最好，對(duì)三七葉部和根部主要病害病原菌均具有較強(qiáng)的抑制作用，可作為三七病害生物防控的微生物資源。

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（責(zé)任編輯麻小燕）