生長(zhǎng)pH值為6.0，最適光照條件為24 h光照。該研究結(jié)果可為松樹(shù)赤枯病的防治提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：松樹(shù)赤枯?。环蛛x純化；病原鑒定；生物學(xué)特性

中圖分類(lèi)號(hào)：S763.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）06-0113-07

松樹(shù)為高大喬木，四季常青，能夠起到良好的防風(fēng)、固沙、吸塵的作用，是優(yōu)質(zhì)用材樹(shù)以及荒山綠化先鋒樹(shù)種。隨著松樹(shù)栽植面積的增加以及在人們生產(chǎn)、生活中應(yīng)用范圍的逐步擴(kuò)大，其觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值、工業(yè)價(jià)值日益突出。因受自然條件、栽培條件、病蟲(chóng)害等不良因素的影響，松樹(shù)連片枯萎現(xiàn)象嚴(yán)重，在國(guó)內(nèi)涉及10余個(gè)樹(shù)種，影響松樹(shù)的正常生長(zhǎng)。其中，松材線蟲(chóng)對(duì)我國(guó)松林造成危害及威脅重大。松材線蟲(chóng)病俗稱(chēng)“松樹(shù)癌癥”，在松樹(shù)枯萎癥狀研究中常作為主要研究方向。目前，對(duì)其相關(guān)病原菌的研究較少，當(dāng)非松材線蟲(chóng)病引起松樹(shù)枯萎現(xiàn)象發(fā)生時(shí)，若不能及時(shí)對(duì)癥下藥進(jìn)行病害防治，會(huì)明顯加大損失。

本試驗(yàn)對(duì)采自山東威海市雙島林場(chǎng)的松樹(shù)枯萎病害樣本進(jìn)行病原菌分離，并對(duì)病原菌進(jìn)行培養(yǎng)、純化、多基因系統(tǒng)發(fā)育分析及生物學(xué)特性測(cè)定，以便為松樹(shù)赤枯病的防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

干枯的松樹(shù)枝干、枝條及松針，采自山東省威海市雙島林場(chǎng)，松樹(shù)品種為黑松。

1.2病原菌分離及單孢培養(yǎng)

采用組織分離法。將采集的感病松針與枝干用流水沖洗、晾干，并將枝干剪成5cm左右小段；置于超凈工作臺(tái)上，用3%的NaClO溶液浸泡消毒60 s，無(wú)菌水漂洗3次，每次3～4 min，用無(wú)菌濾紙吸干水分，隨后將其剪成長(zhǎng)約5 mm的小段并接種到PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4～5 d。每培養(yǎng)皿中放入3個(gè)小段組織，每組織部位平行測(cè)定3次，采用稀釋法進(jìn)行單孢純化。挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至新的PDA平板上，28℃培養(yǎng)5d。培養(yǎng)結(jié)束后移至斜面試管中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3菌株致病性測(cè)定

選取山東省濟(jì)南市燕山林場(chǎng)黑松的健康松針，用流水清洗，晾干后置于超凈工作臺(tái)，用滅菌后的手術(shù)刀劃傷針葉制造微傷口。將單孢純化培養(yǎng)好的菌株用直徑5 mm的打孔器打出菌餅，接種在健康松針傷口處，以空白PDA為對(duì)照，重復(fù)6次，在28℃、12 h黑白交替的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；保濕48 h后撤掉菌餅和PDA圓餅，7d后觀察發(fā)病情況。

1.4菌株形態(tài)學(xué)鑒定

1.4.1菌落形態(tài)觀察 將純化后的菌株接種在PDA平板上培養(yǎng)5d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速率，記錄菌落正面和背面顏色、菌落邊緣形狀、均勻度、菌落質(zhì)地、氣生菌絲的有無(wú)及多少。

1.4.2菌株分生孢子及產(chǎn)孢特征顯微觀察 將純化后的菌株接種到PDA平板上，置于SPX智能型人工氣候箱內(nèi)25℃黑暗培養(yǎng)，待長(zhǎng)出子實(shí)體后，用挑針挑取少許，制作臨時(shí)玻片。利用Nikon 50i顯微鏡（Nikon Eclipse 50i，日本）觀察分生孢子和分生孢子盤(pán)的形態(tài)并測(cè)量其大小，利用Qim-aging相機(jī)（加拿大）拍照，利用cellSens軟件測(cè)量分生孢子和附著胞的大小。

1.5菌株多基因系統(tǒng)發(fā)育分析

用CTAB法提取純化培養(yǎng)菌體的DNA，加入20μL TE Buffer溶解，終濃度約為900 ng/μL。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增保守基因序列，引物序列見(jiàn)表1。委托上海派森諾生物科技有限公司對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)定。將ITS、TUB2、TEF1序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。運(yùn)行MEGA 7.0軟件中的Align建立DNA sequence alignment，使用Clust-al W對(duì)基因序列比對(duì)、校對(duì)。利用Fasta align-ment joiner軟件通過(guò)首尾相連的方法，將ITS、TUB2、TEF1等基因連接起來(lái)。利用PhyloSu-ite（1.2.2）及FigTree（1.4.3）軟件，構(gòu)建最大似然法和貝葉斯法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6菌株生物學(xué)特性測(cè)定

1.6.1不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 在無(wú)菌條件下，利用打孔器打出直徑為7 mm的菌餅，分別接種到PDA、PSA、PMA、OA、CMA、Martin 6種培養(yǎng)基平板中央，重復(fù)3次，25℃恒溫培養(yǎng)箱中分別黑暗培養(yǎng)3、5、7d，每天16：00采用十字交叉法測(cè)量并記錄菌落直徑。待有1個(gè)處理的3次重復(fù)中菌絲全部長(zhǎng)滿(mǎn)平板，停止觀察，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速率。菌絲生長(zhǎng)速率（mm/d）=（菌落直徑一菌餅直徑）／天數(shù)。

1.6.2不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在無(wú)菌條件下將直徑為7 mm的菌餅接種到PDA平板，在10、15、20、25、30、35℃6個(gè)溫度條件下恒溫、黑暗培養(yǎng)3、5、7d，每處理重復(fù)3次。測(cè)量記錄方法同1.6.1。

1.6.3不同pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 以PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用1 mol/L HCl溶液和1mol/L NaOH溶液分別將培養(yǎng)基pH值調(diào)制為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，共7個(gè)處理。無(wú)菌條件下取直徑7 mm的菌餅分別接種至不同pH值的PDA平板培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3、5、7d，每處理重復(fù)3次。測(cè)量記錄方法同1.6.1。

1.6.4不同光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 無(wú)菌條件下，取直徑7mm的單孢菌餅接種至PDA培養(yǎng)基，在其他培養(yǎng)條件一致的情況下，設(shè)置光照24 h、黑白交替12 h、黑夜24h 3個(gè)光照處理，28℃恒溫培養(yǎng)3、5、7d，每處理重復(fù)3次。測(cè)量記錄方法同1.6.1。

1.7數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，差異顯著性分析采用Duncan's法多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1菌株病原菌致病性測(cè)定

獲得的純化單孢菌株編號(hào)為RCBHL，將其對(duì)健康黑松松針進(jìn)行室內(nèi)離體接種，7d后出現(xiàn)癥狀。經(jīng)致病性測(cè)定，純化單孢菌株RCBHL可侵染黑松，發(fā)病率為100%。發(fā)病初期，松針出現(xiàn)黃褐色病斑，病斑中心發(fā)白，邊緣暗褐色，有輪紋層次感（圖1A、B）；后期，松針呈現(xiàn)干枯狀態(tài)，產(chǎn)生灰色霉層并附著大量的黑色小點(diǎn)（圖1C）。這與山東威海市雙島林場(chǎng)黑松植株發(fā)病癥狀一致（圖1D）。將接種后發(fā)病的松針再次進(jìn)行病原分離，分離物與接種菌株一致。

2.2菌株形態(tài)特征

將純化的RCBHL菌株接種至PDA培養(yǎng)基，25℃黑暗培養(yǎng)5d后觀察形態(tài)發(fā)現(xiàn)：菌落近圓形，正面白色、背面淡黃色，輪紋較明顯；培養(yǎng)15 d后，菌落表面形成黑色黏液，即為分生孢子堆，排列不規(guī)則（圖2）。

如圖3所示，分生孢子散生，黑褐色，紡錘形或長(zhǎng)棱形，數(shù)量較多。分生孢子平均大小為20.30×7.57μm（n=50），共有5個(gè)細(xì)胞、4個(gè)隔膜，分隔處不明顯，頂端與基部細(xì)胞顏色較淡、多數(shù)透明，中間的3個(gè)細(xì)胞顏色較深、大多黃褐色。孢子頂端有2～3根不分支的無(wú)色透明附著絲，平均長(zhǎng)度分別為14.66、14.01、15.38μm（n=50）。基部細(xì)胞具有小柄，平均長(zhǎng)度為2.92μm（n=50）。分生孢子梗平均長(zhǎng)度為2.97μm。根據(jù)以上形態(tài)學(xué)特征，將菌株RCBHL鑒定為擬盤(pán)多毛孢屬真菌（Pestalotiopsis sp.）。

2.3菌株多基因系統(tǒng)發(fā)育分析

以ITS、TUB2、TEF1三種基因序列為參比序列，以P.hawaiiensis（菌株編號(hào)為CBS 114491）作為外圍菌株，將獲得的RCBHL菌株與20株參考菌株的序列構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果（圖4）顯示，菌株RCBHL與P.rosea聚在同一分支上（BP=84，PP=0.99）。根據(jù)形態(tài)學(xué)與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，RCBHL鑒定為玫瑰擬盤(pán)多毛孢菌（Pesta-lotiopsis rosea）。

2.4菌株生物學(xué)特性

2.4.1培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由表2可知，RCBHL菌株在不同培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速率不同，但無(wú)極顯著差異。它在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，菌絲生長(zhǎng)速率為8.267 mm/d;Martin培養(yǎng)基最不適宜RCBHL菌株生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)速率僅為5.989mm/d，顯著低于PDA培養(yǎng)基。

2.4.2溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由表3可以看出，溫度對(duì)RCBHL菌絲生長(zhǎng)速率有極顯著差異，溫度在20、25℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速率最快，分別可達(dá)6.633、7.656mm/d；溫度為15℃和30℃時(shí)，菌株生長(zhǎng)速率極顯著降低：溫度低于15℃或高于30℃時(shí)，菌株生長(zhǎng)緩慢或停止生長(zhǎng)。

2.4.3 pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由表4可知，RCBHL菌絲適宜生長(zhǎng)pH值范圍較廣，在pH值5.0～10.0范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)。在pH值6.0條件下菌絲生長(zhǎng)速率最快，可達(dá)10.778 mm/d，顯著或極顯著高于其他pH值處理；在pH值4.0條件下，菌絲生長(zhǎng)受到抑制，生長(zhǎng)速率僅為0.878 mm/d;pH值在8.0～10.0之間時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速率為8.967～9.533mm/d，相互之間差異不顯著。

2.4.4光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由表5可知，RCBHL菌絲在24 h光照條件下生長(zhǎng)速率最高，與24h黑暗下無(wú)顯著差異，顯著高于12h光照黑暗交替的表現(xiàn)。

3討論與結(jié)論

松樹(shù)枯萎病是當(dāng)今全球性的病害，導(dǎo)致很多國(guó)家的松樹(shù)出現(xiàn)大面積枯萎死亡，森林覆蓋面積減少，土地荒漠化問(wèn)題突出，給人類(lèi)生存環(huán)境帶來(lái)極大威脅。引起松樹(shù)枯萎病的因子既有生物因子也有環(huán)境因子。環(huán)境因子主要包括土壤因素、大氣污染、極端天氣，生物因子有病原線蟲(chóng)、病原菌、害蟲(chóng)等，最主要的是松材線蟲(chóng)。松材線蟲(chóng)病可以引起松林大面積死亡，是松樹(shù)疫情，為目前松樹(shù)枯萎病的重點(diǎn)考慮因素。除此之外，鐮刀菌屬真菌中有多個(gè)種均可侵染松樹(shù)造成松樹(shù)死亡。

擬盤(pán)多毛孢屬（Pestalotiopsis spp.）是常見(jiàn)的真菌類(lèi)群，常以病原菌、內(nèi)生菌或腐生菌的形式存在，為人類(lèi)發(fā)現(xiàn)的重要植物病原菌之一，可侵染多種植物造成多種類(lèi)型的病害，嚴(yán)重影響作物或林木的品質(zhì)和產(chǎn)量，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)從山東省威海市雙島林場(chǎng)采集感病松樹(shù)，分離培養(yǎng)得到單孢菌株RCBHL.通過(guò)對(duì)菌株的ITS、TUB2、TEF1多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征，以及致病性測(cè)定，確定分離獲得的菌株為玫瑰擬盤(pán)多毛孢菌（P.rosea）。

由枯斑擬盤(pán)多毛孢（P.funerea）引起的赤枯病是松樹(shù)常見(jiàn)的病害，尤其是在幼齡林中常見(jiàn)，分布廣，危害重，在特定區(qū)域成為針葉林木主要病害。最近的研究表明，檸檬擬盤(pán)多毛孢（P.cit-rina）侵染樟子松，江蘇擬盤(pán)多毛孢（P.jiang-suensis）侵染馬尾松，引起赤枯病。本研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰擬盤(pán)多毛孢菌（P.rosea）可以侵染黑松引起赤枯病。明確致病因子是控制病害的重要前提，溫度、光照和pH值是影響菌株生長(zhǎng)的重要環(huán)境因子。本研究測(cè)定了溫度、光照以及pH值對(duì)玫瑰擬盤(pán)多毛孢菌RCBHL菌絲生長(zhǎng)速率的影響，表明菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為20～25℃，低于15℃或高于30℃菌絲生長(zhǎng)緩慢或停止生長(zhǎng)；對(duì)酸堿度具有廣泛的適應(yīng)性，在pH值為6.0條件下生長(zhǎng)速率最高，在pH值5.0～10.0范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)：在所有光照條件下均可生長(zhǎng)，24 h光照條件下生長(zhǎng)速率最高，與24 h黑暗下無(wú)顯著差異，顯著高于12 h光照黑暗交替的表現(xiàn)。

病害在林間的擴(kuò)展蔓延與致病菌自身的生物學(xué)特性緊密相關(guān)，摸清其生物學(xué)特性，對(duì)病害的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及有效防控具有重要意義。本研究結(jié)果為威海市松樹(shù)異?？菸∫蛟\斷分析及針對(duì)性防控提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，下一步，將通過(guò)室內(nèi)和田間試驗(yàn)，篩選出對(duì)玫瑰擬盤(pán)多毛孢菌有良好防治效果的藥劑，為黑松赤枯病的防治提供參考。