摘要： 本研究旨在探究從四川傳統(tǒng)發(fā)酵米制品中分離出1 株植物乳桿菌（Lactiplantibacil?lus plantarum） BM-5 的菌體富硒功能. 通過正交實驗確定最佳富硒條件為pH 7. 0、添加亞硒酸鈉使硒添加濃度為30 μg/mL、硒添加時間為12 h、接種量為5%. 在這些條件下BM-5 菌的菌體生物量1. 12 g/L，菌體硒含量可達(dá)7362. 60 μg/g. 通過掃描電鏡觀察和能譜分析證實BM-5 能富集還原硒并可將部分單質(zhì)硒由菌體內(nèi)運輸?shù)骄w表面形成納米硒顆粒，納米硒顆粒的平均直徑為167. 16 nm. 該研究表明BM-5 在較低硒添加濃度時，可被制備成結(jié)合富硒和益生的多功能菌株，具備應(yīng)用于生產(chǎn)安全的人體硒補(bǔ)充劑的潛力.

關(guān)鍵詞： 富硒； 植物乳桿菌； 菌體硒含量； 納米硒顆粒； 生物還原

中圖分類號： Q93 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A DOI： 10. 19907/j. 0490-6756. 2024. 046001

1 引言

硒是人體必需的微量營養(yǎng)素，對生命至關(guān)重要［1，2］. 它是硒蛋白和一些抗氧化酶的組成成分，可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化過程中產(chǎn)生的自由基的破壞作用. 人體硒缺乏會導(dǎo)致硒蛋白表達(dá)減少，進(jìn)而引起器官和組織的退化［3］. 在人類和動物中發(fā)現(xiàn)的缺硒癥狀主要是與心肌和關(guān)節(jié)有關(guān)的疾病，如擴(kuò)張型心肌病和地方性骨關(guān)節(jié)病. 硒的缺乏還可能產(chǎn)生其他負(fù)面影響，例如增加男性不育、前列腺癌、腎病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的風(fēng)險［4］. 人體硒的主要來源為膳食中攝入的硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸，少部分來源于溶解于水中的硒酸鹽. 硒代蛋氨酸多來源于植物，特別是谷物、堅果等，硒代半胱氨酸則來自動物性食物中的硒蛋白［5］. 人體攝入硒的量很大程度上取決于當(dāng)?shù)赝寥牢?，已有報道我國部分地區(qū)和歐洲中部由于土壤中硒含量低，當(dāng)?shù)鼐用駸o法從食物中獲取足夠硒而導(dǎo)致硒缺乏癥［6，7］.

在硒缺乏地區(qū)就需要通過合理方法進(jìn)行硒的補(bǔ)充，但是硒酸鹽和亞硒酸鹽具有較高的毒性不能直接服用. 為了補(bǔ)充缺乏的硒元素，人們利用硒鹽浸泡種子或幼苗根部［8］、土壤施硒肥［9］和葉面噴施硒肥［10］等方式提高植物硒含量. 植物對硒酸鹽和硒代半胱氨酸吸收發(fā)生在根部，吸收的大多數(shù)硒被運送到枝條［9］. 雖然植物整體硒含量上升，但利用率較低. 總體上看植物富硒主要通過提高土壤或者培養(yǎng)物中硒濃度的方法來進(jìn)行，伴隨著硒污染風(fēng)險和植物利用率較低等問題. 動物富硒主要通過喂飼添加高濃度硒酸鹽或亞硒酸鹽的飼料，但存在對無機(jī)硒利用率低和無機(jī)硒通過動物糞便等形式排泄到周圍環(huán)境中造成污染等問題［11， 12］. 而通過添加有機(jī)硒飼喂動物雖然會提高轉(zhuǎn)化效率，但是有機(jī)硒飼養(yǎng)成本過高. 與動植物富硒相比，微生物進(jìn)行富硒時間短、富集效率高，但是其發(fā)酵過程中相關(guān)代謝產(chǎn)物安全性的驗證卻較少，通過具有高安全性保障的益生菌進(jìn)行富硒有望降低潛在的風(fēng)險.

植物乳桿菌具有歐洲食品安全局（EFSA）的安全推定（QPS）資格和美國食品和藥物管理局（US FDA）的公認(rèn)安全（GRAS）狀態(tài)［13］，具有更好的安全背景. 其富集還原產(chǎn)生的納米硒具有低毒性、抗菌功能、抗癌活性、抗炎癥活性［14-17］，可望同時實現(xiàn)富硒與益生菌之間的結(jié)合提高其安全性和綜合利用價值. 目前已有報道通過植物乳桿菌富硒后飼喂30 d 的虹鱒魚免疫能力和谷胱甘肽過氧化物酶活性等生產(chǎn)參數(shù)均有所改善［18］；飼養(yǎng)暴露于鎘的鯉魚可以減少組織中鎘的積累，增強(qiáng)抗氧化酶的活性，并逆轉(zhuǎn)暴露于鎘后腸道微生物組成的變化［19］，在小鼠喂養(yǎng)中具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用［20］. 本研究擬對本室篩選的植物乳桿菌BM-5 菌體富硒能力進(jìn)行評估和優(yōu)化，獲得將益生功能和富硒功能相結(jié)合的資源菌株應(yīng)用于生產(chǎn)安全的人體硒補(bǔ)充劑.

2 材料與方法

2. 1 實驗材料

2. 1. 1 實驗菌株

實驗室分離保藏的1 株植物乳桿菌BM-5.

2. 1. 2 培養(yǎng)基

使用MRS 培養(yǎng)基：葡萄糖，20. 0 g；牛肉膏，10. 0 g；蛋白胨，10. 0 g；酵母浸粉，5. 0 g；乙酸鈉，5. 0 g；檸檬酸銨，2. 0 g；磷酸氫二鉀，2. 0 g；硫酸鎂，0. 58 g；硫酸錳，0. 25 g；吐溫80， 1. 0 mL；瓊脂粉，18. 0 g；121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min.

2. 2 實驗方法

2. 2. 1 BM-5 生長曲線

以1% 接種量分別接入硒含量為0、5、10、15、20、40 μg /mL MRS 液體培養(yǎng)基. 37 ℃搖床培養(yǎng)24 h. 培養(yǎng)中每隔2 h 取菌液測定600 nm 吸光值.

2. 2. 2 菌體硒含量測定

在酸性條件下硒與3，3，-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）作用，生成黃色絡(luò)合物（Se-DAB），可用分光光度法對硒含量進(jìn)行測定.參照曾議霆等［21］的方法測定吸光值繪制硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線. 將發(fā)酵液6000 r/min 離心5 min，棄上清后用15 mL 生理鹽水重懸菌體6000 r/min 離心5 min，重復(fù)3 次. 取菌體培養(yǎng)物，50 ℃烘干置恒重，稱重后取0. 05 g 放入試管中，加入硝酸高氯酸混合液（V∶V=5∶1）1. 0 mL，放置過夜. 置于100 ℃水浴鍋中加熱4 h，取出冷卻，加入30% 過氧化氫溶液2 mL，繼續(xù)置于沸水浴中消化，至消化液呈現(xiàn)無色或淡黃色即達(dá)終點. 取出試管冷卻后，以超純水定容至35 mL，同時做空白對照（后續(xù)實驗方法相同）. 硒含量測定方法與標(biāo)準(zhǔn)曲線測定所用方法相同.

2. 2. 3 不同培養(yǎng)條件

不同濃度亞硒酸鈉液體培養(yǎng)基進(jìn)行富硒培養(yǎng)：以1% 接種量分別接入硒含量為10、15、20、30、40 μg/mL MRS 液體培養(yǎng)基. 37 ℃搖床培養(yǎng)24 h.

將連續(xù)活化2 次的BM-5 以1% 接種量接入50 mL MRS 液體培養(yǎng)基，并分別在0、2、4、6、8、10、12 h 添加亞硒酸鈉溶液，使硒濃度為15 μg/mL. 搖床發(fā)酵36 h. 離心收集菌體，測定富硒量.

將連續(xù)活化2 次的BM-5 分別以1%、2%、3%、4%、5%、6% 接種量接入50 mL MRS 液體培養(yǎng)基，添加亞硒酸鈉溶液，使硒濃度為15 μg/mL.搖床發(fā)酵36 h，添加硒時間不影響總時間. 培養(yǎng)后測定菌體硒含量并計算富硒產(chǎn)量.

將連續(xù)活化2 次的BM-5 以1% 接種量分別接入pH 為5. 0、6. 0、7. 0 的50 mL MRS 液體培養(yǎng)基，并分別在0 h、12 h 添加亞硒酸鈉溶液，使硒濃度為15 μg/mL. 共發(fā)酵36 h.

2. 2. 4 BM-5 最佳菌體富硒條件篩選

通過SPSS 軟件設(shè)計四因素五水平實驗對BM-5 最佳富硒條件進(jìn)行篩選，確定最佳條件后再進(jìn)行重復(fù)驗證實驗. 正交實驗見表1.

2. 2. 5 最佳富硒條件驗證實驗

對正交實驗篩選最佳富硒條件進(jìn)行重復(fù)驗證，并測定菌體硒含量和富硒產(chǎn)量.

2. 2. 6 掃描電鏡及能譜分析

離心收集最佳條件下富硒菌體后用PB 緩沖液進(jìn)行離心洗滌3 次后再進(jìn)行戊二醛固定、磷酸緩沖液漂洗、乙醇梯度脫水、臨界點干燥、噴金處理后上機(jī)觀察，對富硒后BM-5 菌體進(jìn)行觀察，并進(jìn)行掃描電鏡能譜（SEMEDS）.

3 結(jié)果與分析

3. 1 BM-5 在不同硒添加濃度下的生長曲線

菌株BM-5 在接種8 h 內(nèi)處于延遲期，8～14 h為對數(shù)生長期，在接種12 h 左右生長最為旺盛，14 h 后生長速度減慢，在20 h 時開始進(jìn)入生長穩(wěn)定期. 隨著硒添加濃度的上升，菌體生長逐漸減慢且到達(dá)穩(wěn)定期時吸光值降低，說明硒添加可抑制BM-5 的生長，但BM-5 仍可以在40 μg/mL 較高硒濃度下生長. BM-5 在不添加硒狀況下對數(shù)生長期約為4～12 h，在12 h 后生長速度降低. 隨著硒添加濃度的升高，BM-5 對數(shù)生長期逐漸后延且菌體生長速度逐漸減慢，在40 μg/mL 硒濃度時培養(yǎng)36 h 仍未到達(dá)穩(wěn)定期（圖1）.

3. 2 不同處理條件對BM-5 富硒效果影響

3. 2. 1 硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0. 0107x+0. 0044，R2 值為0. 9997 大于0. 99 表示該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于硒含量測定.

3. 2. 2 不同硒添加濃度

不同硒添加濃度下菌體富硒量如圖3（a，e）所示，在10～15 μg/mL 濃度下富硒產(chǎn)量在上升，但是變化較小. 可能原因是添加硒濃度較低，經(jīng)過BM-5 對培養(yǎng)基中硒的富集后在發(fā)酵后期菌體無法在進(jìn)行硒的有效富集. 在20 μg/mL 硒濃度下菌體含硒量明顯上升，但是硒濃度的提高抑制了BM-5 菌體的正常生長導(dǎo)致BM-5 的生物量有所下降，進(jìn)一步提高硒濃度發(fā)現(xiàn)在30 μg/mL 濃度下生物量與20 μg/mL 硒濃度培養(yǎng)條件下相差不大，菌體含硒量進(jìn)一步提高，40 μg/mL 硒濃度相較于30 μg/mL 硒濃度菌體量明顯下降，導(dǎo)致菌體富硒產(chǎn)量下降.

3. 2. 3 不同硒添加時間

在BM-5 搖床培養(yǎng)6 h后添加亞硒酸鈉，生物量基本穩(wěn)定在1. 2 g/L 左右（圖3b，3f）. 在15 μg/mL 硒濃度下BM-5 生長受到抑制，延后硒添加時間可以減輕這種抑制. 0～6 h菌體硒含量在1500 μg/g 左右存在波動，6 h 之后添加時菌體生物量達(dá)到正常水平. 隨著添加時間的延后BM-5 可以更好地進(jìn)行次生代謝活動，菌體硒含量逐漸增加. 在12 h 添加BM-5 菌體生物量為1. 29 g/L，菌體硒含量2371. 00 μg/g，均達(dá)到最高.

3. 2. 4 不同接種量

如圖3c、3g 所示，在菌體含硒量方面不同接種量菌體含硒量變化較小，各組菌體硒含量在2500～3000 μg/g. 不同處理下菌體量無明顯差異，說明不同接種量對于富硒影響較小.

3. 2. 5 不同pH

在接種后0 h 添加硒隨著pH 的升高BM-5 菌體富硒量變化如圖3d、3h，相對于培養(yǎng)12 h 細(xì)菌進(jìn)入遲滯期后添加硒，在0 h 添加硒菌體硒含量更高. 在培養(yǎng)12 h 進(jìn)入穩(wěn)定期后添加硒，pH 對菌體硒含量影響較小，但是菌體生物量隨pH上升而增加. 菌株BM-5 在pH 為7. 0，12 h 硒添加時菌體生物量達(dá)到1. 16 g/L，菌體硒含量為3256. 72 μg/g.

3. 3 最佳富硒條件

3. 3. 1 正交試驗結(jié)果

通過SPSS 軟件進(jìn)行方差分析表明：對于BM-5 富硒效果影響最大的為硒添加時間，影響效果依次為：硒添加時間、pH、硒添加濃度、接種量. 本次實驗中最佳條件為：pH 7. 0、硒添加濃度30 μg/mL、硒添加時間12 h、接種量5%.雖然在pH 5. 0、硒添加濃度10 μg/mL、硒添加時間6 h、接種量1% 培養(yǎng)條件菌體硒含量高達(dá)8467. 62 μg/g，但菌體生物量只有0. 40 g/L，總體富硒能力較差. 在最佳富硒條件下BM-5 菌體硒含量為7362. 60 μg/g，菌體生物量為1. 12 g/L.

3. 3. 2 最佳富硒條件驗證實驗

對正交實驗確定最佳富硒條件進(jìn)行重復(fù)驗證實驗，發(fā)現(xiàn)菌體硒含量、菌體富硒產(chǎn)量、菌體質(zhì)量均相差較小，無顯著性差異. 經(jīng)過驗證，正交實驗重復(fù)性良好. BM-5具有良好富硒能力且富硒后菌體硒含量遠(yuǎn)高于已報道乳桿菌.

3. 4 掃描電鏡觀察及能譜分析

3. 4. 1 掃描電鏡

將最佳條件下富硒BM-5 菌體制樣使用賽默飛Apreo S 型高分辨場發(fā)射掃描電鏡配雙探頭能譜及EBSD 分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描電鏡觀察和EDS 能譜分析，進(jìn)一步對BM-5 富集還原硒以后在菌體表面和內(nèi)部硒的分布進(jìn)行研究. 對富硒BM-5 菌體進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)在菌體表面形成單質(zhì)納米硒顆粒，平均直徑為167. 16 nm. 部分菌體表面具有硒單質(zhì)球狀顆粒物質(zhì)和球狀物質(zhì)未完全生長積累形成的斑塊，有少量硒單質(zhì)顆粒散布在菌體周圍. 此外在添加亞硒酸鈉培養(yǎng)下少量菌體存在明顯凹陷，菌體變短，由原來平均長度1. 72 μm變?yōu)?1. 26 μm，說明較高濃度的硒影響B(tài)M-5 生長，對細(xì)胞形態(tài)也有一定影響（圖4）.

3. 4. 2 能譜分析

對菌體整體進(jìn)行SEM-EDS 結(jié)果如圖5，而對富硒菌體整體掃描硒含量為1. 10%，原子百分比為0. 19%，與我們測定菌體硒含量相符.

4 討論

本研究測定了BM-5 不同硒濃度下生長曲線發(fā)現(xiàn)BM-5 可以在硒濃度小于40 μg/mL 時維持生長并且具有還原硒能力，可將亞硒酸鹽還原為紅色單質(zhì)硒. 通過單因素實驗發(fā)現(xiàn)硒添加濃度、添加時間、接種量、pH 條件對于BM-5 富硒效果有影響，并通過正交實驗確定最佳富硒條件為pH 7. 0、硒添加濃度30 μg/mL、硒添加時間12 h、接種量5%. 在最佳富硒條件下BM-5 菌的菌體生物量1. 12 g/L，菌體硒含量可達(dá)7362. 60 μg/g. 通過掃描電鏡觀察和能譜分析，發(fā)現(xiàn)BM-5 可以將富集還原的單質(zhì)硒運輸?shù)骄w表面形成單質(zhì)納米硒顆粒SeNPs（平均直徑為167. 16 nm），出現(xiàn)在細(xì)胞外或細(xì)胞壁結(jié)合處，與Wadhwani 等［22］的研究一致. 硒添加濃度30 μg/mL 時，少量菌體出現(xiàn)變短、表面凹陷、褶皺等形態(tài)變化. 這些變化可能與亞硒酸鈉對菌體的毒性和對細(xì)胞膜的破壞有關(guān)［23］.

從生長曲線和顯微觀察可知，在上述培養(yǎng)條件下，BM-5 既能保證菌體生長活性，又同時具備高富硒能力. Calomme 等［24］在添加亞硒酸鈉1 mg/L時，植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌和干酪乳桿菌凍干細(xì)胞中硒的濃度分別為375、253 和407 μg/g.Zhang 等［25］在培養(yǎng)基添加2. 5、5. 0、8. 0 和10 mg/L亞硒酸鈉時，雙歧桿菌Bifidobacterium animalis 01菌體中硒的積累濃度分別為528、641、898 和1017 μg/g. 這些文章還提到了在濃度等于或大于10 mg/L 亞硒酸鈉的存在下，與非富集培養(yǎng)物相比，菌株的生長有所下降. BM-5 在最佳富硒條件下菌體硒含量可達(dá)7362. 60 μg/g，顯著優(yōu)于上述富硒細(xì)菌. 李穎［26］對富硒酵母進(jìn)行誘變選育后酵母硒含量為3129. 40 μg/g，生物量6. 37 g/L. 酵母作為真核微生物，生物量占有顯著優(yōu)勢，但發(fā)酵的時間和成本遠(yuǎn)高于細(xì)菌. 而BM-5 不僅可以將硒酸鹽還原，還能形成具有多種生物活性的單質(zhì)納米硒顆粒（SeNPs）. 這些顯著優(yōu)勢使BM-5 的性能進(jìn)一步提高，可望在發(fā)酵食品中可以通過在益生菌生物質(zhì)中的積累制備富硒功能食品［27，28］，具備用作新型功能性食品和膳食補(bǔ)充劑的開發(fā)潛力.

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（責(zé)任編輯： 白林含）

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