摘 要： 為探究噬菌體作為治療肺炎克雷伯菌感染的新型潛在療法的可能性，本研究采用雙層平板法將醫(yī)院周邊污水中3 株肺炎克雷伯菌裂解性噬菌體進(jìn)行分離純化，透射電鏡觀察噬菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步分析噬菌體裂解譜、最佳感染復(fù)數(shù)、生長(zhǎng)曲線和酸堿耐受性等生物學(xué)特征，同時(shí)通過測(cè)序技術(shù)獲得噬菌體全基因組信息并注釋分析. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KP-ZS3 為肌尾科噬菌體，KP-ZS4 為短尾科噬菌體，KP-ZS6 為長(zhǎng)尾科噬菌體，且KP-ZS4 的感染潛伏期稍長(zhǎng)，KP-ZS3 耐酸堿能力較強(qiáng)，KP-ZS6 的裂解能力為3 株噬菌體中最強(qiáng)、裂解譜較寬. 3 株噬菌體的外殼蛋白組分大小均在33～55 kD 之間. 此外全基因組分析發(fā)現(xiàn)KP-ZS3、KP-ZS6 2 株噬菌體的基因組大小均在100 kb 以上，噬菌體KP-ZS4 的基因組相對(duì)較?。?0 608 bp）. 共線性分析顯示噬菌體KP-ZS3 與phiEap-3、Kp15 高度相似；KP-ZS6 與0507KN21、vB_EcoM_KWBSE43-6高度相似. KP-ZS4 與Tyrion、TL-2011b 相似度相對(duì)較低，序列一致性為76. 77%、76. 89%. 以上結(jié)果表明，這3 株噬菌體具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和基因組特征，它們?cè)诜窝卓死撞腥局委煼矫嬲宫F(xiàn)出不同的潛力和優(yōu)勢(shì)，特別是KP-ZS6 因其裂解能力強(qiáng)和廣泛的裂解譜，以及KPZS3因其強(qiáng)耐酸堿性，可能成為未來抗菌治療的備用資源，這些發(fā)現(xiàn)為開發(fā)新型抗菌策略和治療肺炎克雷伯菌感染提供了新的信息基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞： 肺炎克雷伯菌； 噬菌體； 生物學(xué)特征； 基因組分析； 耐藥菌治療

中圖分類號(hào)： R378. 99 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A DOI： 10. 19907/j. 0490-6756. 2024. 046004

1 引言

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是廣泛存在于自然界環(huán)境中的革蘭氏陰性致病桿菌，可在健康人群的呼吸道以及腸道中潛伏，引起住院患者發(fā)生肺炎、尿路感染以及肝膿腫等疾病［1，2］. 從1882 年Carl Friedlander 發(fā)現(xiàn)至今，多重耐藥肺炎克雷伯菌以及高毒力肺炎克雷伯菌等衍生菌株的出現(xiàn)，使得院內(nèi)感染傳播率、致病率（骨髓炎、肝膿腫、菌血癥等疾?。┎粩嘣黾樱鋵?duì)醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)的威脅日益上升［3，4］. 在治療肺炎克雷伯菌感染時(shí)，常使用粘菌素、磷霉素和氨基糖苷類等聯(lián)合用藥，但隨著抗生素普及，多重耐藥菌株（如碳青霉烯類抗生素耐藥、β-內(nèi)酰胺類耐藥、多粘菌素耐藥）使得抗生素治療周期、效果以及預(yù)后都面臨挑戰(zhàn)，常規(guī)抗生素已漸漸無法滿足治療需求［5-7］.

細(xì)菌病原體顯現(xiàn)的抗生素耐藥性對(duì)肺炎克雷伯菌的傳染性控制構(gòu)成了威脅，在此背景下，擱置已久的噬菌體及其制劑再次出現(xiàn)在人們的視野中［8］. 噬菌體是在自然界中廣泛存在可特異性裂解細(xì)菌、真菌等微生物的病毒，可通過吸附、注入、合成、組裝、釋放5 個(gè)步驟將自身核酸物質(zhì)注入宿主體內(nèi)復(fù)制進(jìn)而引起細(xì)菌裂解死亡［9，10］. 自1919 年Herelle 成功地使用噬菌體制劑治療患有細(xì)菌性痢疾的兒童之后，噬菌體療法就在20 世紀(jì)30 年代被廣泛用于治療人類和動(dòng)物的細(xì)菌感染中［11］. 與此同時(shí)，噬菌體及其相關(guān)制劑，如噬菌體編碼的酶，免疫調(diào)節(jié)劑和單克隆抗體逐漸運(yùn)用于多重耐藥菌感染［12］. 2011 年，Hung 等成功發(fā)現(xiàn)噬菌體可通過腹膜內(nèi)高效治療肺炎克雷伯菌介導(dǎo)的小鼠肝膿腫、菌血癥等疾?。?3］. 2020 年，Anand 等通過鼻腔給藥途徑，將噬菌體運(yùn)用于肺炎克雷伯菌感染小鼠治療，明顯減輕小鼠肺部病灶及細(xì)菌含量［14］. 之后，Cano 等使用單一噬菌體在治療髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后由肺炎克雷伯菌導(dǎo)致的假膝感染取得了良好的療效［15］. Qin 等［16］和Bao 等［17］均發(fā)現(xiàn)，在將噬菌體“ 雞尾酒療法”與抗生素療法相結(jié)合后，成功治愈耐藥性肺炎克雷伯菌引起的多灶性尿路感染病例. 基于上述肺炎克雷伯菌噬菌體臨床應(yīng)用研究結(jié)果，人們發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌噬菌體在針對(duì)耐藥性細(xì)菌時(shí)，可將病原菌裂解，但當(dāng)菌體總量過多時(shí)還需結(jié)合抗生素使用，或是采取“ 雞尾酒療法”將多種噬菌體混合使用進(jìn)而增強(qiáng)療效［18，19］. 因此本研究擬從醫(yī)院周邊環(huán)境水源中分離肺炎克雷伯菌裂解性噬菌體，以豐富具有臨床應(yīng)用潛力的肺炎克雷伯菌噬菌體庫(kù).

綜上，本文從貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院周邊環(huán)境水源中取樣，以貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院ICU（IntensiveCare Unit，ICU）病人糞便分離所得的耐藥肺炎克雷伯菌為宿主，分離裂解性肺炎克雷伯菌噬菌體，并研究其生理、生化及基因組特征，為治療多重耐藥及高毒力肺炎克雷伯菌感染提供備選噬菌體菌株.

2 材料與方法

2. 1 材料

2. 1. 1 菌株與培養(yǎng)條件

肺炎克雷伯菌菌株由課題組前期分離于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房（Intense Care Unite，ICU）病人糞便樣本（2019 倫審第076 號(hào)），且經(jīng)種屬鑒定、基礎(chǔ)生理生化特征研究［20］. 肺炎克雷伯菌菌株于Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng). LB 培養(yǎng)基配方：每升LB 培養(yǎng)基中含有10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、10 g 氯化鈉，固體培養(yǎng)基中瓊脂粉添加比例為1. 5%. 噬菌體分離水樣采自貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院周圍環(huán)境水源（ 坐標(biāo)：經(jīng)度106. 719 577，緯度26. 600 61）.

2. 1. 2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)儀器

氯化鈉（C111547）、酵母提取物（Y278663）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰蛋白胨（LP0042B）、瓊脂粉（A8190）、DNA 提取酚試劑（T0250）、DNA ExtractionReagen（t P1012）、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（P1200）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Proteinase K（RT403）、RNase A（RT405）購(gòu)自北京天根生化科技有限公司. 立式超低溫保存箱（DW-86L338J）購(gòu)自青島海爾特種電器有限公司，超速離心機(jī)（CP100NX）購(gòu)自日本HITACHI 有限公司，透射電子顯微鏡（JEM-2100F）購(gòu)自日本電子，高速冷凍離心機(jī)（Beckman DU640 冷凍高速離心機(jī)，Eppendorf centrifuge 5810R 冷凍高速離心機(jī)）.

2. 2 方法

2. 2. 1 噬菌體的分離與純化

每50 mL 污水水樣添加CaCl2、、MgCl2 各0. 01 g 過夜處理后，4 ℃ ，10 000 r/min，離心15 min，取上清多次重復(fù)離心后0. 22 μm 針式過濾器，4 ℃保存. 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺炎克雷伯菌菌液與水樣濾液混勻，37 ℃恒溫培養(yǎng)至液體澄清，4 ℃ ，10 000 r/min，離心5 min，過濾，即濃縮混合噬菌體粗制液. 利用雙層平板法［21］分離純化噬菌體，觀察噬菌斑形成情況.

2. 2. 2 噬菌體透射電鏡觀察

噬菌體富集擴(kuò)增后，吸取10 μL 效價(jià)為107～108 pfu/mL 的噬菌體純化液滴至復(fù)膜銅網(wǎng)上待噬菌體顆粒自然沉降晾干后，滴加10 μL 2% 磷鎢酸染色10 min，干燥后用透射電鏡觀察噬菌體形態(tài).

2. 2. 3 裂解譜測(cè)定

采用雙層平板法，將分離所得的噬菌體分別與實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存18 株肺炎克雷伯菌菌株混合，觀察噬菌斑形成情況，如產(chǎn)生噬菌斑則說明噬菌體對(duì)該菌株具有裂解作用.

2. 2. 4 最佳感染復(fù)數(shù)

當(dāng)宿主菌長(zhǎng)至OD600 值為0. 2 時(shí)（細(xì)菌總數(shù) ≈ 1×108 CFU/mL），將宿主菌與噬菌體液以102、101、100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 的比例混合，37 ℃ 恒溫?fù)u床孵育1 h，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min 后取上清過濾，觀察噬菌斑形成情況及計(jì)算效價(jià)，其中產(chǎn)生噬菌斑的效價(jià)最高比值即為最佳感染復(fù)數(shù).

2. 2. 5 一步生長(zhǎng)曲線

將噬菌體液與宿主菌液以最佳感染復(fù)數(shù)比例混合后，置于37 ℃ 恒溫孵育15 min， 10 000 r/min，瞬時(shí)離心，棄去上清. 用1mL LB 液體培養(yǎng)基清洗沉淀2 次，重懸于預(yù)熱過的LB 液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)，于0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min 時(shí)分別取樣200～300 μL，12 000 r/min，瞬時(shí)離心取上清，LB液體培養(yǎng)基梯度稀釋，觀察噬菌斑形成情況并計(jì)算其效價(jià)，繪制生長(zhǎng)曲線.

2. 2. 6 pH 耐受性試驗(yàn)

取不同pH（pH 為3、4、5、6、7、8、9、10、11）的LB 液體培養(yǎng)基各900 μL，加入100 μL 噬菌體原液，37 ℃恒溫孵育1 h，雙層平板法培養(yǎng)，觀察噬菌斑形成情況，分析噬菌體生長(zhǎng)狀況.

2. 2. 7 噬菌體蛋白組成成分分析

取純化噬菌體濃縮液，向其中加入10 倍蛋白上樣緩沖液，100 ℃金屬浴煮沸10 min，使蛋白質(zhì)變性充分. 使用SDS-PAGE （sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后利用考馬斯亮藍(lán)染液進(jìn)行染色，脫色液脫色至蛋白條帶清晰可見即可，分析蛋白條帶大小.

2. 2. 8 噬菌體基因組提取及全基因組測(cè)序分析

將噬菌體經(jīng)富集濃縮后，加入RNase-Free DNaseI，RNase A 至終濃度為1 μg/mL，37 ℃ 水浴30 min，4 ℃ ，40 000 r/min 離心90 min，1 mLddH2O 重懸沉淀， 12 000 r/min，離心15 min，取上清. 向上清中依次加入0. 5 mol/L EDTA（終濃度20 mmol/L），蛋白酶K（終濃度50 μg/mL），10%SDS（終濃度5%），混勻后56 ℃水浴3 h，以酚-氯仿法提取噬菌體DNA.

為了對(duì)噬菌體基因組組成有進(jìn)一步了解，將噬菌體基因組DNA 片段化后，基于全基因組鳥槍法（Whole Genome Shotgun，WGS）策略，構(gòu)建不同插入片段的文庫(kù)，同時(shí)利用第二代測(cè)序技術(shù)（Next-Generation Sequencing，NGS），基于 Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)，對(duì)這些文庫(kù)進(jìn)行雙末端（Pairedend，PE）測(cè)序. 使用RAST 在線軟件［22］（RASTServer - RAST Annotation Server（ nmpdr. org））對(duì)全基因組序列進(jìn)行注釋，同時(shí)利用tRNAscan-SE［23］軟件（tRNAscan-SE-2. 0. 12）分別查找3 株噬菌體基因組序列中的tRNA 編碼基因，使用tRNAdb（tRNAdb 2009）在線軟件對(duì)tRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化. 使用RAST 在線注釋軟件對(duì)全基因組進(jìn)行快速注釋后，使用Proksee［24］在線軟件（https：//proksee. ca）基因基因組圈圖繪制，使用Blastn 進(jìn)行比對(duì)后，利用Easyfig（Easyfig 2. 2. 3）軟件進(jìn)行基因組共線性圖譜繪制，使用ViPTree［25］（the viral proteomic tree，ViPTree 3. 7）軟件基于蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析.

3 結(jié)果與分析

3. 1 噬菌體的形態(tài)分析

共分離出KP-ZS3、KP-ZS4 以及KP-ZS6 3 株噬菌體（GSA： CRA014056）， KP-ZS6 噬菌體形成直徑2 mm 左右的圓形噬菌斑， KP-ZS3 以及KPZS42 株噬菌體的噬菌斑大小為3～4 mm（如圖1所示）. 3 株噬菌體純化后使用透射電鏡觀察、ImageJ 測(cè)量可見KP-ZS4 頭部長(zhǎng)約48 nm，尾長(zhǎng)92 nm；KP-ZS6 頭長(zhǎng)為83 nm，尾長(zhǎng)130 nm，KPZS3直徑約為39 nm（圖2）.

3. 2 裂解譜測(cè)定

將3 株噬菌體與分別與18 株肺炎克雷伯菌進(jìn)行裂解譜試驗(yàn)，其各自的裂解譜如圖3 所示. 結(jié)合噬菌體裂解譜范圍可以分析出、KP-ZS6 噬菌體的裂解能力在3 株噬菌體中最強(qiáng)（6/18，33. 33%），裂解譜較寬，而KP-ZS3 和KP-ZS4 裂解特異性較強(qiáng).

3. 3 最佳感染復(fù)數(shù)

結(jié)合圖4 可以得出3 株噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)分別為KP-ZS3 的MOI 為102、KP-ZS4 的MOI為101 以及KP-ZS6 的MOI 為100，在以上噬菌體與宿主菌的比例中所產(chǎn)生的噬菌體效價(jià)最高.

3. 4 一步生長(zhǎng)曲線

將噬菌體以最佳感染復(fù)數(shù)比例結(jié)合后，經(jīng)0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min取樣后，所得生長(zhǎng)曲線如圖5 所示，KP-ZS3 的潛伏期均為0 min，裂解期均為20 min，平緩期為40 min. KP-ZS4 的潛伏期為30 min，裂解期為10 min，平緩期為40 min. KP-ZS6 的潛伏期及裂解期為10 min，平緩期為40 min. 對(duì)比潛伏期、裂解期時(shí)長(zhǎng)可發(fā)現(xiàn)，KP-ZS3 和KP-ZS6 比KP-ZS4 潛伏期短.

3. 5 pH 值對(duì)噬菌體侵染活性的影響

將3 株噬菌體于不同pH 中37 ℃恒溫處理1 h，所得結(jié)果如圖6 所示. 當(dāng)pH 值為4～11 時(shí)，KPZS3到KP-ZS6 3 株噬菌體的滴度變化值不大. 3 株噬菌體皆在pH 為7～8 時(shí)滴度最大，但在pH 值為3時(shí)，噬菌體KP-ZS6 滴度明顯下降外，其余2 株噬菌體均在此pH 值影響不能生長(zhǎng)，可見KP-ZS6 在處于低pH 值環(huán)境時(shí)穩(wěn)定性稍強(qiáng).

3. 6 蛋白組成成分分析

SDS-PAGE 結(jié)果如圖7 所示，3 株噬菌體的蛋白條帶分子量皆處于33 ～55 kD 之間.

3. 7 噬菌體基因組分析

KP-ZS3、KP-ZS4、KP-ZS6 3 株噬菌體基因組均為雙鏈DNA，其中KP-ZS3 的基因組大小為176 565 bp，GC 含量為41. 90%，276 個(gè)ORF，其中最長(zhǎng)的ORF 編碼1400 aa，最短的ORF 編碼32 aa.在已知的數(shù)據(jù)庫(kù)中，有86 個(gè)ORF 與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知功能的序列高度相似，剩余190 個(gè)假定蛋白未知其功能，KP-ZS3 主要衣殼蛋白為ORF147. KP-ZS4的基因組大小為40 608 bp，GC 含量為54. 08%，54個(gè)ORF，其中最長(zhǎng)的ORF 編碼838 aa，最短的ORF 編碼44 aa，其中共有17 個(gè)假定蛋白未知其功能，KP-ZS4 主要衣殼蛋白為ORF39/ORF40. KPZS6的基因組大小為159 280 bp，GC 含量為45. 94%，215 個(gè)ORF，其中最長(zhǎng)的ORF 編碼1612 aa，最短的ORF 編碼36 aa，據(jù)功能預(yù)測(cè)其共有157 個(gè)假定蛋白，其主要衣殼蛋白為ORF34. 此外，噬菌體能裂解細(xì)菌細(xì)胞壁，主要依賴于穿孔素和內(nèi)溶素的作用. 基于ORF 預(yù)測(cè)我們可以發(fā)現(xiàn)KP-ZS3的ORF 196為穿孔素，ORF 81為內(nèi)溶素. 而KP-ZS4的穿孔素為ORF 3，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)溶素. KP-ZS6中穿孔素與內(nèi)溶素均未發(fā)現(xiàn). 基于CG Viewer在線軟件進(jìn)行將基因組進(jìn)行注釋拼接后得到基因組圈圖（圖8）.

噬菌體蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行KEGG（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和GO（Gene ontology，GO）分析. KEGG 富集分析表明，噬菌體KP-ZS3 在Brite Hierarchies 通路中有16個(gè)與遺傳信息處理系統(tǒng)相關(guān)基因、2 個(gè)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞過程相關(guān)基因，在遺傳信息處理中有10 個(gè)與復(fù)制與修復(fù)相關(guān)基因，有2 個(gè)單基因（抗腫瘤耐藥、癌癥）與人類疾病相關(guān). 8 個(gè)核苷酸代謝相關(guān)基因、3 個(gè)輔助因子與維生素代謝相關(guān)基因以及1 個(gè)外源生物降解及代謝相關(guān)基因以及1 個(gè)氨基酸代謝基因共同參與代謝機(jī)制調(diào)控. 在生物系統(tǒng)代謝中主要由免疫系統(tǒng)相關(guān)單基因組成，此外還有3 個(gè)單基因在KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中未被具體注釋（圖9a）.噬菌體KP-ZS4 在KEGG 通路注釋中主要由3 個(gè)單基因組成（遺傳信息處理、復(fù)制與修復(fù)以及單個(gè)特征不明確基因）（圖9b）. 噬菌體KP-ZS6 在BriteHierarchies 通路上主要由15 個(gè)遺傳信息處理相關(guān)基因、單個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞相關(guān)基因組成. 在遺傳信息處理中由8 個(gè)復(fù)制與修復(fù)相關(guān)基因參與，2 個(gè)抗腫瘤耐藥基因與人類疾病相關(guān)，由6 個(gè)核苷酸代謝基因、單個(gè)輔助因子與維生素代謝基因參與代謝機(jī)制，以及單個(gè)未被KEGG Pathway 明確注釋的與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞過程相關(guān)基因（圖9c）.

GO 分析表明，噬菌體KP-ZS3 由70 個(gè)基因參與生物學(xué)進(jìn)程，主要集中在細(xì)胞氮化合物分解代謝過程相關(guān)基因（18 個(gè)）、生物過程相關(guān)基因（14個(gè)）分解代謝過程相關(guān)基因（12 個(gè)）. 同時(shí)有14 個(gè)基因（8 個(gè)細(xì)胞成分基因、胞內(nèi)、細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)基因各2 個(gè)）參與KP-ZS3 細(xì)胞成分組成. 63 個(gè)分子功能相關(guān)基因（主要組成為16 個(gè)分子功能基因、13 個(gè)離子結(jié)合基因以及8 個(gè)DNA 結(jié)合基因）（圖9d）.噬菌體KP-ZS4 由5 個(gè)細(xì)胞氮化合物分解代謝過程相關(guān)基因、2 個(gè)分解代謝基因以及3 個(gè)單基因（生物過程、生物合成、細(xì)胞壁組織或生物形成）共同參與生物學(xué)進(jìn)程，以及8 個(gè)分子功能相關(guān)基因（5 個(gè)DNA 結(jié)合基因，分子功能、甲基轉(zhuǎn)移酶活性、水解酶活性基因各1 個(gè)）（圖9e）. 噬菌體KP-ZS6 由38個(gè)基因參與生物學(xué)進(jìn)程，主要集中在細(xì)胞氮化合物分解代謝過程相關(guān)基因（13 個(gè)）、生物過程相關(guān)基因（5 個(gè)）、分解代謝過程相關(guān)基因（5 個(gè)）、生物合成過程基因（5 個(gè)）、小分子代謝過程基因（5 個(gè)）等. 2 個(gè)細(xì)胞成分基因，39 個(gè)分子功能相關(guān)基因（11 個(gè)離子結(jié)合基因、8 個(gè)分子功能基因、8 個(gè)DNA 結(jié)合基因、3 個(gè)氧化還原酶活性基因、2 個(gè)螺旋蛋白酶活性基因、2 個(gè)異構(gòu)酶活性基因等）（圖9f）.

為了進(jìn)一步研究3 株噬菌體的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，使用ViPTree（the viral proteomic tree）構(gòu)建了環(huán)狀蛋白質(zhì)組樹. 結(jié)果顯示KP-ZS3 屬于肌病毒科、γ?變形菌綱. KP-ZS4 屬于短尾噬菌科、γ?變形菌綱噬菌體. KP-ZS6 在dsDNA 原核生物病毒數(shù)據(jù)庫(kù)中未比對(duì)到具體科屬，但結(jié)合ICTV 分類法，從形態(tài)上將噬菌體KP-ZS6 分為長(zhǎng)尾噬菌體科（圖10）.

結(jié)合NCBI（National Center for BiotechnologyInformation，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中Blastn 程序以及共線性分析對(duì)3 株噬菌體進(jìn)行比較基因組分析，發(fā)現(xiàn)噬菌體KP-ZS3 與噬菌體Enterobacter phagephiEap-3（NC_041980）、Klebsiella phage Kp15（NC_014036）的高度相似，其中與噬菌體NC_041980一致性為98. 28%，與噬菌體NC_014036 一致性為98. 74% 且同屬于肌病毒科. 噬菌體KP-ZS4 與已知噬菌體相似性相對(duì)較低，與Enterobacter phageTyrion（NC_031077）一致性為76. 77%、與Esch?erichia phage TL-2011b（NC_019445）一致性為76. 89%. 噬菌體KP-ZS6 與Klebsiella virus0507KN21 DNA（NC_022343）一致性為97. 24%、Escherichia phage vB_EcoM_KWBSE43-6（NC_048186）2 株噬菌體的基因部分相似一致性為96. 60%（圖11）.

tRNAscan-SE 軟件分別預(yù)測(cè)3 株噬菌體tRNA，發(fā)現(xiàn)噬菌體KP-ZS3 基因組上有1 個(gè)tRNA編碼序列，位于46～122 bp 之間，且tRNA 反密碼子為CTG，轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酰胺（Gln），二級(jí)結(jié)構(gòu)圖如圖12 所示. 噬菌體KP-ZS4、KP-ZS6 的基因組序列中未發(fā)現(xiàn)tRNA 編碼序列（表1）.

4 討論

裂解性噬菌體相較于溶源性噬菌體而言，是可以侵入宿主細(xì)菌體內(nèi)并進(jìn)行增殖復(fù)制導(dǎo)致宿主細(xì)菌死亡的病毒［26］. 本研究以貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院ICU 病人糞便樣品中分離所得的18 株臨床耐藥肺炎克雷伯菌為宿主菌，從貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院環(huán)境水源中分離得到3 株肺炎克雷伯菌裂解性噬菌體，分離率為16. 67%. 比較基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)KP-ZS3、KP-ZS6 與現(xiàn)有已知噬菌體基因組高度相似. 而KP-ZS4 與此與已知噬菌體基因組相似性不高，提示KP-ZS4 可能具有獨(dú)特的起源. 噬菌體KP-ZS6 比KP-ZS3、KP-ZS4 裂解譜較廣，耐強(qiáng)酸能力強(qiáng)，其裂解的6 株肺炎克雷伯菌對(duì)紅霉素、克拉霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、阿莫西林、甲砜霉素、甲硝唑和克林霉素均具有耐藥性［20］. 醫(yī)院周圍水源來源組成成分較為復(fù)雜，比其他水體中含有更多多重耐藥細(xì)菌［27］，可能是噬菌體分離率較高的原因.

肺炎克雷伯菌及其衍生菌株（高毒力肺炎克雷伯菌、多重耐藥肺炎克雷伯菌等）在全球醫(yī)療系統(tǒng)中引起的院內(nèi)肺炎中占比約達(dá)到11. 8%，相關(guān)性肺炎死亡率也在30%～50%［28］. 此外，Delle 等發(fā)現(xiàn)多重耐藥肺炎克雷伯菌導(dǎo)致的血流感染可在ICU 住院患者中引發(fā)高達(dá)46% 的死亡率（46%），給醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來了極大負(fù)擔(dān)［29］. 目前肺炎克雷伯菌感染常采用抗生素聯(lián)合治療，如高劑量美羅培南、粘菌素、磷霉素、替加環(huán)素和氨基糖苷類藥物，但其對(duì)多重耐藥肺炎克雷伯菌效果不佳. 如研究者們發(fā)現(xiàn)存在于ICU 患者中的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌菌株對(duì)除頭孢他啶-阿維巴坦、替加環(huán)素和米諾環(huán)素外的主要抗菌藥物表現(xiàn)出顯著的強(qiáng)耐藥性，且肺炎克雷伯碳青霉烯酶能水解臨床治療多藥耐藥菌感染的碳青霉烯類抗生素，嚴(yán)重削弱抗生素治療效果［30-32］. 此外噬菌體自100 a 前被發(fā)現(xiàn)以來，作為地球上豐度最高的生物，它可以通過裂解、整合進(jìn)基因組和水平基因轉(zhuǎn)移等方式影響宿主的生命周期和進(jìn)化，發(fā)揮重要的生態(tài)作用，在被用于治療痢疾感染后，其特異性和安全性使其臨床運(yùn)用潛力不斷顯現(xiàn)［9，33］.

噬菌體作為新的生物制劑，在未來的臨床治療中可廣泛應(yīng)用. 目前研究人員將噬菌體運(yùn)用在家畜類的細(xì)菌性疾病治療中并效果顯著［34］. 研究表明噬菌體可以特異性溶細(xì)胞性糞腸球菌［35］. 同時(shí)，2022 年Xu 等從污水中分離出2 株在體外混合使用后抑制了水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的有害細(xì)菌生長(zhǎng)的E. piscicida 噬菌體，且與本次測(cè)序所得的噬菌體KP-ZS3、KP-ZS4 同屬于肌病毒科與短尾病毒科［36］. 但單一噬菌體在治療時(shí)效果略差于噬菌體“ 雞尾酒”，故在本研究分離的噬菌體可潛在用于與其他噬菌體聯(lián)合，制成“雞尾酒”制劑，作為重要的殺傷多重耐藥菌株及高毒力菌株的噬菌體資源.

面對(duì)多重耐藥菌株及高毒力菌株等致病微生物威脅，本研究分離的3 株噬菌體可以特異性裂解臨床分離耐藥性肺炎克雷伯菌. KP-ZS6 裂解能力在3 株噬菌體中最強(qiáng)，裂解譜較寬，KP-ZS3 耐酸堿能力較強(qiáng). 噬菌體KP-ZS3 與phiEap-3、Kp15 高度相似；KP-ZS6 與0507KN21、vB_EcoM_KWBSE43-6 高度相似. KP-ZS4 與Tyrion、TL-2011b 相似度相對(duì)較低，序列一致性為76. 77%、76. 89%. KPZS3、KP-ZS4、KP-ZS6 具有一定的應(yīng)用潛力與價(jià)值.

參考文獻(xiàn)：

［1］ Shon A S， Bajwa R P S， Russo T A. Hypervirulent（hypermucoviscous） Klebsiella pneumoniae： A newand dangerous breed［ J］. Virulence， 2013， 4： 107.

［2］ Barr J G. Klebsiella： Taxonomy， nomenclature， andcommunication［ J］. J Clin Pathol， 1977， 30： 943.

［3］ Prokesch B C， Tekippe M， Kim J， et al. Primary osteomyelitiscaused by hypervirulent Klebsiella pneu?moniae［ J］. Lancet Infect Dis， 2016， 16： e190.

［4］ van Dorp L， Wang Q， Shaw L P， et al. Rapid phenotypicevolution in multidrug-resistant Klebsiellapneumoniae hospital outbreak strains［J］. Microb Genom，2019， 5： e000263.

［5］ Russo A， Fusco P， Morrone H L， et al. New advancesin management and treatment of multidrugresistantKlebsiella pneumoniae［J］. Expert Rev AntiInfect， 2023， 21： 41.

［6］ Ernst C M， Braxton J R， Rodriguez-osorio C A， etal. Adaptive evolution of virulence and persistence incarbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae［J］. NatMed， 2020， 26： 705.

［7］ Liu X， Wu Y， Zhu Y， et al. Emergence of colistinresistanthypervirulent Klebsiella pneumoniae（ CoRHvKp）in China［J］. Emerg Microbes Infect， 2022，11： 648.

［8］ Effah C Y， Sun T， Liu S， et al. Klebsiella pneu?moniae： an increasing threat to public health ［J］.Ann Clin Microbiol Antimicrob， 2020， 19： 1.

［9］ Salmond G P C， Fineran P C. A century of thephage： past， present and future［J］. Nat Rev Microbiol，2015， 13： 777.

［10］ Domingo-Calap P， Georgel P， Bahram S. Back tothe future： Bacteriophages as promising therapeutictools［ J］. HLA， 2016， 87： 133.

［11］ Kakasis A， Panitsa G. Bacteriophage therapy as analternative treatment for human infections. A comprehensivereview［J］. Int J Antimicrob Agents， 2019，53： 16.

［12］ Chang R Y K， Nang S C， Chan H K， et al. Novelantimicrobial agents for combating antibiotic-resistantbacteria［J］. Adv Drug Deliv Rev， 2022， 187：114378.

［13］ Hung C H， Kuo C F， Wang C H， et al. Experimentalphage therapy in treating Klebsiella pneumoniaemediatedliver abscesses and bacteremia in mice［J］.

Antimicrob Agents Chemother， 2011， 55： 1358.［14］ Anand T， Virmani N， Kumar S， et al. Phagetherapy for treatment of virulent Klebsiella pneu?moniae infection in a mouse model ［J］. J Glob AntimicrobResist， 2020， 21： 34.

［15］ Cano E J， Caflisch K M， Bollyky P L， et al. Phagetherapy for limb-threatening prosthetic knee Klebsi?ella pneumoniae infection： Case report and in vitrocharacterization of anti-biofilm activity［J］. Clin InfectDis， 2021， 73： e144.

［16］ Qin J， Wu N， Bao J， et al. Heterogeneous Klebsi?ella pneumoniae co-infections complicate personalizedbacteriophage therapy［J］. Front Cell Infect Microbiol，2020， 10： 608402.

［17］ Bao J， Wu N， Zeng Y， et al. Non-active antibioticand bacteriophage synergism to successfully treat recurrenturinary tract infection caused by extensivelydrug-resistant Klebsiella pneumoniae［J］. Emerg MicrobesInfect， 2020， 9： 771.

［18］ Gu L C， Green S I， Min L， et al. Phage-antibioticsynergy is driven by a unique combination of antibacterialmechanism of action and stoichiometry［J］.mBio， 2020， 11： e01462.

［19］ Krylov V N， Bourkaltseva M V， Pleteneva E A.Bacteriophage’s dualism in therapy［J］. Trends Microbiol，2019， 27： 566.

［20］ Hong W， Qian S Y， Wu C X， et al. Isolation ofKlebsiella Pneumoniae in human intestinal sourcesamples［J］. J Guizhou Med Univ， 2019， 44： 1377.［洪偉， 錢聲艷， 吳昌學(xué)， 等. 人腸道來源樣品中肺炎克雷伯菌的分離及特征研究［J］. 貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2019， 44： 1377.］

［21］ Cai R， Wang Z， Wang G， et al. Biological propertiesand genomics analysis of vB_KpnS_GH-K3， aKlebsiella phage with a putative depolymerase-likeprotein［ J］. Virus Genes， 2019， 55： 696.

［22］ Aziz R K， Bartels D， Best A A， et al. The RASTserver： Rapid annotations using subsystems technology［ J］. BMC genomics， 2008， 9： 75.

［23］ Lowe T M， Chan P P. tRNAscan-SE On-line： Integratingsearch and context for analysis of transferRNA genes ［J］. Nucleic Acids Res， 2016， 44：W54.

［24］ Grant J R， Enns E， Marinier E， et al. Proksee： Indepthcharacterization and visualization of bacterialgenomes［ J］. Nucleic Acids Res， 2023， 51： W484.

［25］ Nishimura Y， Yoshida T， Kuronishi M， et al. ViPTree：The viral proteomic tree server ［J］. Bioinformatics，2017， 33： 2379.

［26］ Wittebole X， De Roock S， Opal S M. A historicaloverview of bacteriophage therapy as an alternative toantibiotics for the treatment of bacterial pathogens［J］. Virulence， 2014， 5： 226.

［27］ Al-Shayeb B， Sachdeva R， Chen L X， et al. Cladesof huge phages from across earth’s ecosystems［J］.Nature， 2020， 578： 425.

［28］ Chen J， Li J， Huang F， et al. Clinical characteristics，risk factors and outcomes of Klebsiella pneu?moniae pneumonia developing secondary Klebsiellapneumoniae bloodstream infection［J］. BMC PulmMed， 2023， 23： 102.

［29］ Delle Rose D， Sordillo P， Gini S， et al. Microbiologiccharacteristics and predictors of mortality inbloodstream infections in intensive care unit patients：A 1-year， large， prospective surveillance study in 5Italian hospitals［J］. Am J Infect Control， 2015， 43：1178.

［30］ Bassetti M， Righi E， Carnelutti A， et al. MultidrugresistantKlebsiella pneumoniae： challenges for treatment，prevention and infection control［J］. ExpertRev Anti Infect Ther， 2018， 16： 749.

［31］ Lu F， Zhang L， Ji J， et al. Epidemiological and antimicrobialresistant patterns， and molecular mechanismsof carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniaeinfections in ICU patients［J］. Infect Drug Resist，2023， 16： 2813.

［32］ Zuo K， Du W Y， Dai T Y， et al. Motion pattern ofthe complex involved in klebsiella pneumoniae carbapenemasesand β -lactamase inhibitor protein ［J］. JSichuan Univ（Nat Sci Ed）， 2017， 54： 585.［左柯，杜文義， 代田洋， 等. 肺炎克雷伯碳青霉烯酶與β-內(nèi)酰胺酶抑制蛋白復(fù)合物的運(yùn)動(dòng)模式［J］. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2017， 54： 585.］

［33］ Herridge W P， Shibu P， O’shea J， et al. Bacteriophagesof Klebsiella spp. ， their diversity and potentialtherapeutic uses［J］. J Med Microbiol， 2020，69： 176.

［34］ Loponte R， Pagnini U， Iovane G， et al. Phagetherapy in veterinary medicine［J］. Antibiotics-Basel，2021， 10： 421.

［35］ Duan Y， Llorente C， Lang S， et al. Bacteriophagetargeting of gut bacterium attenuates alcoholic liverdisease［ J］. Nature， 2019， 575： 505.

［36］ Xu Z H， Shao S， Ding Z， et al. Therapeutic efficaciesof two newly isolated Edwardsiella phagesagainst Edwardsiella piscicida infection［J］. MicrobiolRes， 2022， 263： 127043.

（責(zé)任編輯： 白林含）

基金項(xiàng)目： 國(guó)家自然科學(xué)基金（32170134，U1812403）；貴州省自然科學(xué)基金（[2020]1Z067）；貴州醫(yī)科大學(xué)優(yōu)秀青年人才計(jì)劃（[2022]101）