摘" " 要：以蘆筍幼葉為材料，采用單因素與L16（43）正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，對影響蘆筍SSR-PCR反應(yīng)的3個(gè)因素（2×Taq Master Mix，模板DNA，引物）進(jìn)行優(yōu)化，并以此為基礎(chǔ)通過退火溫度和循環(huán)次數(shù)試驗(yàn)篩選引物最佳退火溫度和循環(huán)次數(shù)。結(jié)果表明，蘆筍基因組DNA的SSR-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系為：10 μL反應(yīng)體系中，50 ng·μL-1 DNA模板0.125 μL，10 μmol·L-1 上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 3 μL，滅菌ddH2O 5.875 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，循環(huán)25次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。經(jīng)5對引物組合和5個(gè)不同蘆筍品種DNA擴(kuò)增驗(yàn)證，該體系穩(wěn)定可靠，可用于蘆筍遺傳多樣性分析、種子純度鑒定、分子標(biāo)記輔助育種及重要農(nóng)藝性狀的圖位克隆等工作。

關(guān)鍵詞：蘆筍；SSR-PCR反應(yīng)體系；正交設(shè)計(jì)

中圖分類號：S644.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）07-100-07

Optimization and validation of SSR-PCR reaction system for Asparagus officinalis L.

BAI Yang， YI Zehui

（College of Horticulture， Shanxi Agricultual University， Taiyuan 030031， Shanxi， China）

Abstract： Based on DNA of asparagus young leaves， a single factor screening test combined with a L16（43） orthogonal design method was employed to optimize the factors of 2×Taq Master Mix， template DNA， and primer combination applied for SSR-PCR and followed by gradient annealing temperature test and gradient cycle times test to screening the optimum annealing temperature and cycle numbers. The results showed that the optimal SSR-PCR system for asparagus included 50 ng·μL-1 DNA template 0.125 μL， 10 μmol·L-1 primers 0.5 μL， 2×Taq PCR Mix 3 μL， sterilized ddH2O 5.875 μL， with a total reaction volume of 10 μL. The PCR amplification procedure for asparagus was： 94 ℃ pre-denaturation for 4 min， 94 ℃ denaturation for 30 s， 60 ℃ annealing 30 s， 72 ℃ renaturation for 35 s， 25 cycles， 72 ℃ extension for 10 min， 4 ℃ for storage. This reaction system was proved to be stable and reliable by PCR amplification with 5 pairs of primer combinations and DNA templates of five different asparagus cultivars. The optimized SSR-PCR reaction system could be satisfactorily used for genetic diversity analysis， seed purity identification， marker-assisted breeding and map-based cloning of important agronomic traits of asparagus.

Key words： Asparagus officinalis; SSR-PCR reaction system; Orthogonal design

蘆筍又名石刁柏，為天門冬科天門冬屬多年生草本植物，富含礦物質(zhì)、多糖、皂苷、氨基酸、維生素和蘆丁等多種營養(yǎng)成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂、提高免疫力等多種藥理功能，深受國內(nèi)外關(guān)注，被譽(yù)為“蔬菜之王”[1-4]。目前，我國已成為世界第一大蘆筍生產(chǎn)國和出口國，經(jīng)濟(jì)效益顯著。然而，我國蘆筍育種起步較晚，技術(shù)滯后，缺乏擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良品種，生產(chǎn)上仍以國外品種為主，如阿波羅、格蘭德、紫色激情等，已成為影響我國蘆筍產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一[5]。

分子標(biāo)記是對DNA進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)了對基因型的直接選擇，具有多態(tài)性豐富、鑒定方法簡捷、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于作物的分子生物學(xué)和遺傳育種研究[6-7]。簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）是由1～6個(gè)核苷酸組成的基序，經(jīng)多次重復(fù)形成的DNA片段[8]。與RAPD、SRAP等分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有分布廣泛、多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)[9]，已廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析[10]、分子標(biāo)記輔助育種[11-12]及重要農(nóng)藝性狀定位[13-14]等領(lǐng)域。SSR標(biāo)記屬于PCR標(biāo)記類型，檢測結(jié)果易受Taq聚合酶、引物、模板、Mg2+和dNTPs等諸多因素影響。因此，開展蘆筍SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化至關(guān)重要，可為SSR分子標(biāo)記應(yīng)用于蘆筍種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種和重要農(nóng)藝性狀的圖位克隆奠定基礎(chǔ)，對加速蘆筍新品種選育和優(yōu)異基因挖掘具有重要意義。目前，前人已經(jīng)對多個(gè)物種開展了SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化研究，如木麻黃[15]、云南草果[16]、白及[17]、短絲木犀[18]等，發(fā)現(xiàn)不同物種的最優(yōu)反應(yīng)體系各異，具有一定的物種特異性。然而，SSR分子標(biāo)記在蘆筍中的應(yīng)用研究進(jìn)展緩慢，僅有部分基于EST序列和基因組序列的SSR標(biāo)記開發(fā)的報(bào)道[1，19-20]，且彼此間反應(yīng)體系存在較大差異，尚未見關(guān)于蘆筍SSR反應(yīng)體系優(yōu)化的研究報(bào)道，尤其是現(xiàn)今廣為應(yīng)用的PCR Mix。

鑒于上述背景，筆者以PCR Mix為基礎(chǔ)，采用正交設(shè)計(jì)對SSR-PCR反應(yīng)體系中的PCR Mix、引物和模板進(jìn)行優(yōu)化，并以此為基礎(chǔ)對擴(kuò)增程序中的退火溫度和循環(huán)次數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以期獲得適用于蘆筍的穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的反應(yīng)體系，為SSR標(biāo)記應(yīng)用于蘆筍的遺傳育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以冠軍、TC、京綠蘆1號、特立龍和新科2030共5個(gè)蘆筍品種為試驗(yàn)材料，其中冠軍和TC來自山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，京綠蘆1號來自北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所，特利龍和新科2030來自美國沃克兄弟公司。試驗(yàn)于2020年6月30日開始，種子經(jīng)3% NaClO溶液消毒后，采用40 ℃溫水浸種48 h后催芽，待大部分種子露白時(shí)，采用32孔穴盤育苗，基質(zhì)配比為V椰糠∶V草炭∶V蛭石∶V珍珠巖=2∶1∶1∶1。幼苗期每個(gè)品種隨機(jī)選擇5株采集健康、新鮮幼葉，液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱備用。試驗(yàn)用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒和SanTaq Plus PCR Mix預(yù)混液均購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 蘆筍基因組提取與檢測

參照Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒說明提取蘆筍DNA，經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)檢測，其質(zhì)量濃度范圍為452.3～625.8 ng·μL-1，OD260/OD280比值在1.82～2.02；經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA條帶清晰明亮、無彌散，可用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。采用ddH2O將DNA質(zhì)量濃度稀釋至50 ng·μL-1，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 SSR引物來源及篩選

以3個(gè)蘆筍品種冠軍、TC、京綠蘆1號DNA為模板，隨機(jī)挑選馬振川[1]開發(fā)的蘆筍EST-SSR引物5對（表1），委托上海生工生物工程有限公司合成。參照胡一凡等[16]PCR反應(yīng)體系并略作修改，10 μL體系具體包括：50 ng·μL-1 DNA模板0.5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 4 μL，滅菌ddH2O 4.5 μL。PCR擴(kuò)增程序參照馬振川[1]的報(bào)道并略作修改，具體為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 蘆筍SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗(yàn) 在初篩試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以條帶明亮、雜帶較少的冠軍品種DNA為模板、LS6組合為引物，對影響PCR反應(yīng)的3個(gè)主要因素（2×Taq PCR Mix、引物和模板）進(jìn)行單因素優(yōu)化，其中引物濃度10 μmol·L-1，DNA質(zhì)量濃度50 ng·μL-1。以初篩試驗(yàn)的PCR體系為基礎(chǔ)組成，設(shè)置8個(gè)梯度的單因素試驗(yàn)（表2），用ddH2O補(bǔ)齊10 μL，分別篩選2×Taq PCR Mix、引物和模板的最適用量。擴(kuò)增程序同1.3，設(shè)3次重復(fù)。采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，分別用0.2% AgNO3和1.5% NaOH溶液進(jìn)行染色和顯色。

1.4.2 正交優(yōu)化試驗(yàn) 經(jīng)單因素試驗(yàn)，分別選取3個(gè)影響因素中擴(kuò)增效果較好的4個(gè)水平，即2×Taq PCR Mix為1.000、2.000、3.000和4.000 μL；50 ng·μL-1 DNA模板為0.125、0.250、0.500和0.625 μL；10 μmol·L-1引物為0.125、0.250、0.375和0.500 μL。采用L16（43）設(shè)計(jì)3因素4水平正交試驗(yàn)（表3），篩選最優(yōu)組合，每個(gè)組合3次重復(fù)。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法同1.4.1。

1.5 蘆筍SSR-PCR退火溫度和循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化

以最優(yōu)PCR體系為基礎(chǔ)，優(yōu)化LS6引物組合的PCR擴(kuò)增程序，設(shè)置退火溫度和循環(huán)次數(shù)的單因素試驗(yàn)，篩選最適退火溫度和循環(huán)次數(shù)。設(shè)置54、56、58、60和62 ℃共5個(gè)退火溫度，選取目標(biāo)條帶清晰、雜帶較少的為最適退火溫度。采用最適退火溫度，設(shè)置20、25、30、35和40次循環(huán)，選擇條帶清晰、雜帶較少的最少循環(huán)次數(shù)為最適循環(huán)次數(shù)。

1.6 蘆筍SSR-PCR最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證

基于優(yōu)化后的SSR-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，用5對SSR引物組合對5個(gè)蘆筍品種DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測最佳反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和通用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物及模板初步篩選

由圖1可知，引物組合LS23和LS20擴(kuò)增條帶亮度和清晰度較低，且存在部分模板未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶的現(xiàn)象；引物組合LS13和LS22擴(kuò)增條帶亮度和清晰度最高，但是均存在不同程度的雜帶；引物組合LS6條帶較為清晰，未發(fā)現(xiàn)明顯雜帶，且以冠軍DNA為模板的條帶亮度和清晰度明顯優(yōu)于京綠蘆1號和特立龍。因此，選擇冠軍DNA和LS6引物組合進(jìn)行后續(xù)PCR反應(yīng)體系優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 蘆筍SSR-PCR反應(yīng)體系的單因素試驗(yàn)

由圖2可知，2×Taq PCR Mix、引物和模板用量均會(huì)對蘆筍SSR-PCR擴(kuò)增效果產(chǎn)生明顯影響。在2×Taq PCR Mix單因素試驗(yàn)中，1～4水平初始用量的反應(yīng)體系均可明顯擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，其中，1/2倍用量條帶清晰且雜帶較3/4和1倍體系少。因此，10 μL PCR反應(yīng)體系中2×Taq PCR Mix最佳用量為2 μL；引物單因素試驗(yàn)中，8個(gè)引物用量的體系均可擴(kuò)增出目的條帶，其中2～4水平用量體系的目標(biāo)條帶最為清晰。考慮引物用量的經(jīng)濟(jì)適用性，以0.25 μL為引物最佳用量；模板DNA單因素試驗(yàn)中，8個(gè)用量的反應(yīng)體系均可清晰擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，1～3、5～6、8水平初始用量的反應(yīng)體系條帶清晰度基本一致，明顯優(yōu)于4和7水平用量，且1和2水平用量的雜帶較少?；诮?jīng)濟(jì)節(jié)約原則，10 μL PCR反應(yīng)體系中DNA最佳用量為0.125 μL。綜上可知，10 μL PCR反應(yīng)體系中2×Taq PCR Mix、10 μmol·L-1引物和50 ng·μL-1 模板的最適用量分別為2、0.25和0.125 μL。

2.3 蘆筍SSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)

由圖3可知，16個(gè)正交組合處理的擴(kuò)增結(jié)果具有較大差異。組合1～5沒有擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，組合6、7、8、11、13和15目標(biāo)條帶清晰度偏低，組合9、10、12、14和16目標(biāo)條帶較為清晰。就目標(biāo)條帶清晰度而言，組合9、14和16的清晰度相似，明顯高于組合10、12。同時(shí)，組合9的雜帶明顯弱于組合14和16。因此，選擇組合9為蘆筍SSR擴(kuò)增的最優(yōu)體系，即10 μL反應(yīng)體系組成為：50 ng·μL-1 DNA模板0.125 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 3 μL，滅菌ddH2O 5.875 μL。

2.4 蘆筍SSR-PCR退火溫度試驗(yàn)

由圖4可知，退火溫度對引物組合LS6的PCR擴(kuò)增結(jié)果具有一定影響。退火溫度為54～60 ℃時(shí)，PCR擴(kuò)增的目標(biāo)條帶較為清晰，且均具有一定雜帶，但不影響主帶識(shí)別；退火溫度為62 ℃時(shí)，目標(biāo)條帶清晰度大幅降低。因此，基于相同擴(kuò)增效果選擇較高退火溫度的原則，選擇60 ℃為LS6引物組合的最適退火溫度。

2.5 蘆筍SSR-PCR循環(huán)次數(shù)試驗(yàn)

由圖5可知，循環(huán)次數(shù)可明顯影響引物組合LS6的PCR擴(kuò)增結(jié)果。循環(huán)次數(shù)為30、35和40次時(shí)，PCR擴(kuò)增的目標(biāo)條帶較為清晰，但雜帶較多，影響擴(kuò)增結(jié)果識(shí)別；循環(huán)次數(shù)為20次時(shí)，雜帶明顯消失，但目標(biāo)條帶清晰度也隨之大幅下降；循環(huán)次數(shù)為25次時(shí)，PCR擴(kuò)增的目標(biāo)條帶較為清晰，同時(shí)雜帶清晰度也明顯低于30、35和40次循環(huán)。因此，選擇25次為引物組合LS6的最適循環(huán)次數(shù)。

2.6 蘆筍SSR-PCR最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證

依據(jù)優(yōu)化試驗(yàn)獲得的最適體系（50 ng·μL-1 DNA模板0.125 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 3 μL，滅菌ddH2O 5.875 μL）擴(kuò)增程序（94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，循環(huán)25次，72 ℃延伸10 min），采用LS6、LS13、LS20、LS22和LS23引物組合對5個(gè)蘆筍品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明（圖6），引物組合LS6、LS13、LS22和LS23均可在5個(gè)蘆筍品種中擴(kuò)增出相應(yīng)目標(biāo)條帶，且條帶清晰、易辨；引物組合LS20在5個(gè)模板中沒有擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，僅有部分非特異性條帶被擴(kuò)增，可能是由于引物特異性不高所致。綜上所述，篩選出的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序具有較高的穩(wěn)定性和較好的重現(xiàn)性，可用于蘆筍及近緣物種的SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

3 討論與結(jié)論

與RAPD、SRAP等傳統(tǒng)分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有操作簡便、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好、共顯性等優(yōu)勢，已在植物遺傳育種研究中發(fā)揮重要作用[6-7]。SSR標(biāo)記以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，鑒定結(jié)果易受PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序影響，且不同物種對PCR反應(yīng)體系的要求各異[15-18]。因此，通過優(yōu)化試驗(yàn)獲取蘆筍最優(yōu)反應(yīng)體系是利用SSR分子標(biāo)記開展分子育種研究的前提和基礎(chǔ)。

Taq聚合酶、引物、模板、Mg2+和dNTPs是影響PCR擴(kuò)增效果的主要因素[15]。2×Taq PCR Mix包含了PCR反應(yīng)體系所需的Taq聚合酶、Mg2+、dNTPs和Buffer緩沖液，極大簡化了試驗(yàn)程序，縮短試驗(yàn)操作時(shí)間，在大規(guī)模的分子標(biāo)記鑒定中具有廣闊的應(yīng)用前景[17]。因此，筆者選擇2×Taq PCR Mix、模板DNA和引物為3個(gè)設(shè)計(jì)因素。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，2×Taq PCR Mix對PCR反應(yīng)的影響最為明顯，其次為DNA和引物濃度，本試驗(yàn)結(jié)果與徐德林等[17]的研究結(jié)果一致，而與錢慧蓉等[18]和蔣小剛等[21]的研究結(jié)果不太一致。這說明不同物種對PCR因素的靈敏度不同，對不同物種進(jìn)行SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化至關(guān)重要。目前，SSR-PCR體系優(yōu)化的方法主要有完全組合、正交設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法。筆者在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，又通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)并利用直觀分析方法對影響蘆筍SSR-PCR反應(yīng)的3個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最優(yōu)反應(yīng)體系。而徐德林等[17]則利用響應(yīng)面法對白及SSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了擬合方程模型及最優(yōu)體系。正交設(shè)計(jì)法具有試驗(yàn)組數(shù)少、簡便高效、布點(diǎn)均衡等優(yōu)點(diǎn)，但精準(zhǔn)度不及響應(yīng)面法，較適用于對精度要求不太高的試驗(yàn)；響應(yīng)面法則需要通過更多試驗(yàn)組合的得分情況對方程模型進(jìn)行擬合及響應(yīng)值預(yù)測，工作量較大[22]。采用正交設(shè)計(jì)法即可完全滿足SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化試驗(yàn)需求。首先，對各試驗(yàn)組的評價(jià)以人工識(shí)別擴(kuò)增條帶為主，未涉及到具體數(shù)值測量；其次，優(yōu)化的反應(yīng)體系穩(wěn)定性好，條帶明亮，清晰易辨。

退火溫度和循環(huán)次數(shù)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均具有明顯影響，其中，退火溫度決定了PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量和特異性，循環(huán)次數(shù)決定了PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量和擴(kuò)增時(shí)間。退火溫度過高容易影響引物與模板DNA的緊密結(jié)合；溫度過低則易發(fā)生引物與模板DNA錯(cuò)配從而導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，影響目標(biāo)條帶識(shí)別[23]。在本研究中，退火溫度為54～60 ℃條件下，擴(kuò)增效果基本相同，選擇60 ℃為LS6引物組合的最佳退火溫度。因此，有必要對每條引物的最佳退火溫度進(jìn)行篩選，尤其是特異性低的引物組合。PCR擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)與產(chǎn)物產(chǎn)量和擴(kuò)增時(shí)間成正比。在本研究中，循環(huán)次數(shù)為25次時(shí)的擴(kuò)增條帶清晰易辨，且雜帶較少，在一定程度上節(jié)約了PCR擴(kuò)增時(shí)間。

筆者優(yōu)化獲得了適用于蘆筍基因組DNA的SSR-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系，10 μL反應(yīng)體系具體包括50 ng·μL-1 DNA模板0.125 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 3 μL，滅菌ddH2O 5.875 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，循環(huán)25次，72 ℃延伸10 min。該體系經(jīng)隨機(jī)選擇的不同引物和不同模板DNA驗(yàn)證，除LS20引物特異性不明顯外，其他均可擴(kuò)增出重復(fù)性好、清晰易辨的條帶，表明該體系穩(wěn)定、可靠?？蔀榻窈骃SR標(biāo)記應(yīng)用于蘆筍遺傳多樣性分析、種子純度鑒定、分子標(biāo)記輔助育種及重要農(nóng)藝性狀的圖位克隆等工作奠定基礎(chǔ)。

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收稿日期：2023-02-16；修回日期：2024-02-24

基金項(xiàng)目：山西省高?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目（2022L104）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新研究課題（YCX2020YQ07）

作者簡介：白" " 揚(yáng)，女，助理研究員，研究方向?yàn)槭卟擞N及生物技術(shù)。E-mail：baiy5502@163.com

通信作者：儀澤會(huì)，男，助理研究員，研究方向?yàn)槭卟擞N及生物技術(shù)。E-mail：yizehui2008bj@163.com