摘要：[目的】克隆蜻蜓鳳梨成花素基因AFT3，并鑒定其生物學(xué)功能，為深入解析鳳梨科植物開花分子機制提供理論依據(jù)?！痉椒ā靠寺/FT3基因，利用生物信息學(xué)軟件進行序列分析，并通過實時熒光定量PCR探究其在低溫（18℃）、常溫（25℃）和高溫（35℃）及外源乙烯處理下的表達情況，采用農(nóng)桿菌浸花法將AFT3基因轉(zhuǎn)入擬南芥，觀察轉(zhuǎn)基因植株表型，通過異源表達預(yù)測其生物學(xué)功能。通過酵母單雜交試驗初步鑒定其啟動子與AfEIN3蛋白的互作關(guān)系?！窘Y(jié)果】從蜻蜓鳳梨中克隆獲得AfFT3基因全長570 bp，編碼區(qū)（CDS）序列為465 bp，編碼154個氨基酸殘基，蛋白分子量為17.3 kD，為穩(wěn)定的親水性蛋白，無跨膜螺旋區(qū)，含有PKC、PKA、cde2、INSR和GSK3等多個蛋白激酶磷酸化位點。同源序列比對發(fā)現(xiàn)，AfFT3蛋白中有2個氨基酸殘基138Trp和140GIn突變?yōu)?38Met和140Glu。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，該蛋白屬于PEBP家族的FT-like蛋白亞家族，與TFL-like亞家族的親緣關(guān)系較近。與對照（大棚正常條件下栽培植株）相比，高溫和低溫處理下AfFT3基因在蜻蜓鳳梨中的相對表達量顯著（Plt;0.05，下同）或極顯著（Plt;0.01，下同）升高。在高溫、常溫和低溫條件下，使用外源乙烯處理后，A/FT3基因在蜻蜓鳳梨中的相對表達量均較對照顯著或極顯著升高，在常溫處理下其相對表達量最高。共獲得6個轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（L₁～L?），其中轉(zhuǎn)基因株系L₃和L₆較轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥延遲抽墓8 d。通過分段擴增獲得AfFT3基因啟動子3段序列（AfFT3-P1、AfFT3-P2和AFT3-P3），長度分別為390、1077和552 bp，通過酵母單雜試驗推測啟動子序列AfFT3-P1和AFT3-P3可與AEIN3蛋白發(fā)生互作?！窘Y(jié)論】高溫、低溫脅迫和乙烯均不同程度誘導(dǎo)A/FT3基因的高效表達，但在高溫和低溫條件下乙烯對AfFT3基因的表達誘導(dǎo)效果較常溫有所降低，其轉(zhuǎn)基因株系延遲抽薹，說明AfFT3基因參與調(diào)控蜻蜓鳳梨開花過程，且響應(yīng)溫度和乙烯信號。

關(guān)鍵詞：蜻蜓鳳梨；A/FT3基因；開花；溫度；乙烯；功能鑒定；啟動子

中圖分類號：S668.303.6文獻標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）02-0411-11

Gene cloning and functional identification of AfFT3 gene in

Aechmea fasciata（Lindl.）Baker

JING Yong-lin1，2，3，WANG Xiao-bin1，2，3，LI Jun-guo1.2，3，CHEN Lang-xin1，2，3，

YANG Qing-quan1·2.3，XU Li1.2.3*

（'Institute of Tropical Crop Genetic Resources，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou，Hainan 571101，China;2Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Haikou，Hainan 571101，China;3Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm Resources Genetic Improvement and Innovationof Hainan Province，Haikou，Hainan 571101，China）

Abstract：[Objective]The flowering-related gene AfFT3 in Aechmea fasciata（Lindl.）Baker was cloned and its bio-logical function was identified，which provided atheoretical basis for further analysis of the molecular mechanism of floweringof Bromeliaceae plants.【Method]4A/FT3 gene was cloned and its sequence was analyzed by bioinformatics soft-ware.The expression levels of AFT3 at low temperature（18℃），normal temperature（25℃）and high temperature（35℃）and exogenous ethylene treatment were detected by real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）.AFT3 gene was transferred intoArabidopsis thaliana（L.）Heynh by Agrobacterium flower dipping.The phenotype oftransgenic plants was observed，and its biological function was predicted by heterologous expression.The interaction between the promoter and A/EIN3 protein was preliminarily identified by yeast one-hybrid assay.[Result]The full length of A/FT3 gene cloned from A.fasciata was 570 bp，and the coding sequence（CDS）was 465 bp，encoding 154 amino acid resi-dues.AfFT3 protein had amolecular weight of 17.3 kD，was astable hydrophilic protein without atransmembrane helical region and contained several phosphorylation sites of protein kinases including PKC，PKA，cdc2，INSR and GSK3.The homologous sequence alignment revealed that two amino acid residues of AfFT3 protein130 Trp and 148GIn mutated to 138Met and1+Glu.Phylogenetic analysis indicated that AfFT3 protein belonged to the FT-like protein subfamily of the PEBP family，and was close to the TFL-like subfamily.Compared with thecontrol（plants cultivated in normal conditions in greenhouse），the relative expression of AfFT3 gene in A.fasciata was increased significantly（Plt;0.05，the same below）or extremely significantly（Plt;0.01，the same below）under the treatment of high temperature and low temperature.Under the conditions of high temperature，normal temperature and low temperature，after exogenous ethylene treatment，therela-tive expression of AfFT3 gene in A.fasciata was increased significantly or extremely significantly compared with the con-trol，with the highest relative expression at normal temperature.A total of six transgenic A.thaliana plants（L?to L?）were obtained，in which the transgenic plants L;and L?were about 8 d delayed than the empty vector and wild-type A.thaliana The AFT3 gene promoter sequences（AfFT3-P1，AfFT3-P2 and AfFT3-P3）were obtained by segmented amplification with the lengths of 390，1077and 552 bp respectively.The results of yeast one-hybrid experiment preliminarily suggested that promoter sequence AfFT3-P1 and A/FT3-P3 might interact with AfEIN3 protein.【Conclusion]The effective expres-sion of AfFT3 gene is induced by high temperature，low temperature stress and ethylene in different degrees，but the in-duction effect of ethylene on the expression of AfFT3 gene under high temperature and low temperature conditions is lower than that of normal temperature.The genetically modified plants delay bolting，indicating that AfFT3 gene is in volved in the regulation of floweringprocess of A.fasciata，and respond to temperature and ethylene signals Key words：Aechmea fasciata（Lindl.）Baker;AFT3 gene;flowering;temperature;ethylene;functional identifica-tion;promoter Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31372106）;Hainan Natural Science Foundation （809195749021）

0引言

【研究意義】蜻蜓鳳梨[Aechmea fasciata（Lindl.）Baker]是鳳梨科（Beomeliae）附生鳳梨屬（Aechmea）的多年生常綠草本植物，其葉片具有虎紋狀銀白色橫紋，淡粉色苞片中間開藍紫色小花，色澤鮮艷，花形奇特，花期持久，故深受大眾喜愛，市場需求量日益增加，成為重要的熱帶花卉之一。自然狀態(tài)下，蜻蜓鳳梨生長周期較長，花期存在較大不確定性，開花率低，花的形色特征參差不齊。蜻蜓鳳梨開花會受到品種、年齡、植株重量、個體營養(yǎng)等內(nèi)部因素及溫度、水分、栽培條件等外部因素的制約，其催花成功率會嚴(yán)重影響商業(yè)化生產(chǎn)。生產(chǎn)上常人工施加外源乙烯及其衍生物進行催花，以滿足市場需求。目前，對于蜻蜓鳳梨各種成花因素之間的相互作用機制研究尚處于初始階段，且乙烯促進鳳梨開花的機理尚不清楚，使得人工催花效果不佳，同時溫度對蜻蜓鳳梨開花影響也較大。成花素基因（FLOWERING

LOCUS T，F(xiàn)T）作為植物開花途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因，具有重要的研究價值（Nakamura et al.，2011）。因此，本研究開展蜻蜓鳳梨FT基因克隆及功能鑒定，為深入研究乙烯和溫度誘導(dǎo)蜻蜓鳳梨開花的分子機制提供一定的參考依據(jù)，對克服其生長周期長及花期不一致的缺點具有重要的研究意義。【前人研究進展】植物成花誘導(dǎo)途徑主要有5條途徑：光周期途徑、春化途徑、溫度途徑、赤霉素途徑和自主途徑（Peng et al.，2016;陳錫等，2017;Kinoshita and Rich-ter，2020）。FT是調(diào)控植物開花的重要基因，對成花轉(zhuǎn)變具有重要作用，是典型的促花因子，本身受光周期途徑中的鋅指蛋白誘導(dǎo)，其蛋白由葉片經(jīng)維管束移動到莖頂端組織。FT編碼磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（PEBP），不同物種的PEBP系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，PEBP蛋白可分為3個功能不同的亞類，F(xiàn)T-like蛋白、TFL?-like蛋白和MFT-like蛋白亞家族（Kobayashi et al.，1999;Luo et al.，2019）。FT是光周期途徑生理鐘基因（CO）、春化途徑和開花阻抑物基因（FLC）等調(diào)控開花時間相關(guān)基因的直接靶基因，幾乎可將所有的開花信號傳導(dǎo)途徑進行整合。擬南芥FT蛋白合成于葉片韌皮部特定的伴胞細(xì)胞，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白（FTIP）的協(xié)助下，經(jīng)過維管束轉(zhuǎn)運至頂端分生組織（SAM），并與鋅指轉(zhuǎn)錄因子FD相互作用，激活下游花分生組織特性基因的表達，從而啟動植物開花（Schiessl et al.，2017;Kralemann et al.，2018;Abe et al.，2019;Shim and Jang，2020）。在接受合適的光周期誘導(dǎo)后，擬南芥FT基因在葉中被誘導(dǎo)表達，在頂端分生組織中FT蛋白與FD和14-3-3蛋白互作并形成復(fù)合體，共同促進下游開花基因的表達，從而促進開花（Abe et al.，2005;Taoka et al.，2011;Luo et al.，2019）。在單子葉模式植物水稻中也發(fā)現(xiàn)，水稻FT同源蛋白Hd3a同樣能與14-3-3蛋白作用形成復(fù)合體，并結(jié)合水稻OsFD1基因的啟動子調(diào)控該基因表達（Taoka et al.，2011）。FT基因除調(diào)控植物開花之外，還參與調(diào)控種子萌發(fā)與植物形態(tài)的建成等（蔣甲福等，2021）。乙烯是最早發(fā)現(xiàn)的種具有生物活性的植物激素，可調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育和各種生理活動（Iqbal etal.，2017）。根據(jù)乙烯特有的“三重反應(yīng)”，已有研究對植物乙烯信號通路中的關(guān)鍵組分進行篩選、分離及鑒定，最終構(gòu)建了乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基本模型（Guo and Ecker，2003）。乙烯信號是被膜結(jié)合蛋白（乙烯受體）所感知。在擬南芥中，乙烯共有5個受體：乙烯受體1（ETR1）、乙烯受體2（ETR2）、乙烯不敏感因子4（EIN4）、乙烯響應(yīng)傳感器1（ERS1）和乙烯響應(yīng)傳感器2（ERS2）。在未與乙烯結(jié)合之前，受體和負(fù)調(diào)節(jié)因子（CTR1）的N端結(jié)合，CTR1對EIN2的C端進行磷酸化修飾，從而被EIN1靶向蛋白1/2（ETP1/ETP2）識別，并進入蛋白酶體降解，抑制信號向下傳遞。同時，在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄因子EIN3/EIL1由乙烯不敏感因子3（EIN3）結(jié)合蛋白1/2（EBF1/EBF2）介導(dǎo)，被泛素化蛋白酶體降解，乙烯信號通路處于沉默或失活狀態(tài)。當(dāng)這些乙烯受體與乙烯結(jié)合后，使CTR1失活，并失去使EIN2磷酸化的能力，這種去磷酸化的EIN2 C端就會斷裂，并由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核中，抑制二聚體EBF1/EBF2的泛素化活性，穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子EIN3/EIL1并使其累積，進而調(diào)控乙烯響應(yīng)基因的表達，以幫助植物應(yīng)對環(huán)境變化（李文陽等，2013;趙赫等，2016）?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組前期根據(jù)蜻蜓鳳梨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出與其開花相關(guān)的3個FT基因，分別命名為AfFT1、AfFT2和AfFT3，其中，AfFT1基因?qū)﹂_花并無顯著作用，A/FT2基因可促進蜻蜓鳳梨提前開花（Li et al.，2022）。但目前未見對蜻蜓鳳梨AfFT3基因進行克隆及功能鑒定的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題]對AfFT3基因進行克隆及生物信息學(xué)分析，檢測其在不同溫度及外源乙烯處理下的表達模式，并通過在擬南芥中異源表達預(yù)測其功能，為深入解析鳳梨科植物開花分子機制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為蜻蜓鳳梨幼株（6～8個月）和成株（11～14個月），擬南芥種子為Clumbia-0型，均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家種質(zhì)資源熱帶作物中期保存庫提供。2×Taq Master Mix（DyePlus）、ChamQIMUni-versal SYBRqPCR Master Mix和ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。PrimeSTAR°Max DNA Polymerase購于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。pEASY-Blunt克隆載體和TransScript Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。DNA測序及各類引物合成均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。限制性內(nèi)切酶KpnI和Xba I購于美國NEB公司。主要儀器設(shè)備：ZHJH-C2109C超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）、高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）、PCR儀（德國Biometra公司）、熒光定量PCR儀（美國ABI公司）和凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2高、低溫及外源乙烯處理

為了研究AfFT3基因?qū)囟燃巴庠匆蚁┑捻憫?yīng)，對蜻蜓鳳梨進行不同溫度和外源乙烯處理。溫度處理：采用18℃（低溫，LT）、25℃（常溫，NT）和35℃（高溫，HT）處理24 h，以大棚正常條件[晝夜溫度分別為（29±4）℃和（20±3）℃]下栽培植株為對照（CK）。在不同溫度下外源乙烯處理：分別在18、25和35℃條件下取0.06%外源乙烯20 mL進行灌心處理（ET）24 h，以清水灌心的心葉材料為對照（CK）。處理后取心葉材料在液氮中迅速冷凍，再轉(zhuǎn)移至-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3目的基因克隆及生物信息學(xué)分析

采用CTAB法提取蜻蜓鳳梨心葉總RNA（叢漢卿等，2013），再利用TransScript Uni One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得AfFT3和AfEIN3基因的參考序列，利用Primer 5.0設(shè)計其特異引物（AfFT3-F/R和AfEIN3-F/R）（表1），通過PCR擴增獲得AfFT3和AfEIN3基因全長。反應(yīng)體系20.0μL：2×PrimerSTAR Max Premix 10.0μL，0.5μg/μL cDNA模板1.0μL，10μmol/L上、下游引物各0.5μL，ddH?O補充至20.0μL。擴增程序：98℃預(yù)變性5s，98℃10s，55℃5s，72℃3s，進行35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存?？寺≈羛EASY-Blunt載體并經(jīng)測序驗證后保種。對AfFT3基因進行生物信息學(xué)分析，分別利用NCBI數(shù)據(jù)庫的ORFfinder、BLASTp和Conserved domains預(yù)測開放閱讀框（ORF）、查找同源氨基酸序列及分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，利用ProtParam預(yù)測蛋白的理化性質(zhì)，采用TMHMM 2.0預(yù)測蛋白的跨膜螺旋區(qū)，采用NetPhos 3.1預(yù)測蛋白的激酶磷酸化位點，使用MEME預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)基序，采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（Leiet al.，2019）。

1.4 AfFT3基因啟動子克隆

將AfFT3基因起始密碼子上游2000 bp啟動子序列（AfFT3promoter）分3段（AfFT3-P1、AfFT3-P2和AfFT3-P3）進行擴增，利用Primer 5.0設(shè)計這3段啟動子序列引物（AfFT3-pl*F/R、AfFT3-p2'F/R和AfFT3-p3'F/R）（表1）。反應(yīng)體系20.0μL：2×PrimerSTAR Max Premix 10.0μL，0.5μg/μL DNA模板1.0μL，10μmolL上、下游引物各0.5 pμL，ddH?O補充至20.0μL。擴增程序：98℃預(yù)變性5 s;98℃10 s，55℃10s，72℃10 s，進行35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。分別將目的片段連接至pEASY-Blunt載體，經(jīng)測序驗證后即為AfFT3基因起始密碼子上游2000 bp的3段啟動子序列（AfFT3-P1、AfFT3-P2和AfFT3-P3）（圖1），其引物序列見表1。

1.5實時熒光定量PCR檢測

分別提取處理后的各樣品總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，方法同1.3。以SYBR Green I作為熒光染料，利用實時熒光定量PCR檢測不同處理樣品中的相對表達量，采用2-A^0法（Livak and Schmitt-gen，2001）計算AFT3基因在外源乙烯處理下及其在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的相對表達量，分別以蜻蜓鳳梨和擬南芥的β-actin為內(nèi)參基因。所用熒光定量引物如表1所示。

1.6 AfFT3基因表達載體構(gòu)建

以測序驗證正確的含目的基因克隆載體菌液為模板，以添加同源重組接頭的引物（AfFT3*F/R）進行擴增，并利用KpnI和Xba I限制性內(nèi)切酶對CAMV35S載體進行雙酶切。采用ClonExpressTMIⅡOne Step Cloning Kit試劑盒構(gòu)建重組表達載體，經(jīng)過菌液PCR和雙酶切檢測驗證后將其命名為CAMV35S：A/FT3，將構(gòu)建成功的CAMV35S：A/FT3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并獲得陽性菌液。

1.7擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)基因株系鑒定及表型觀察

采用農(nóng)桿菌花序侵染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0（Clough and Bent，1998），利用含潮霉素培養(yǎng)基進行抗性篩選，獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株，并篩選至T?代。提取野生型擬南芥、轉(zhuǎn)空載體擬南芥和轉(zhuǎn)CAMV35S：：AfFT3擬南芥植株葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以其為模板，使用基因特異引物進行RT-PCR鑒定。將野生型擬南芥、轉(zhuǎn)空載體擬南芥和轉(zhuǎn)CAMV35S：AfFT3擬南芥株系同時播種，觀察各株系的生長開花情況，記錄抽墓時間和蓮座葉數(shù)目，分析該基因的功能。

1.8 AfFT3基因啟動子與AfEIN3互作的酵母單雜交試驗

以測序驗證正確的含目的基因克隆載體菌液為模板，以添加同源重組接頭的引物（AFT3-pl*F/R、AfFT3-p2+F/R、AfFT3-p3*F/R和AfEIN3'F/R）擴增AfFT3基因啟動子片段和A/EIN3基因片段，將上述目的片段純化回收，利用ClonExpressTMII One Step Cloning Kit試劑盒將AfFT3基因啟動子片段和AfEIN3片段分別連接至pHIS2和pGADT7-Rec2-53載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR后挑取陽性菌液進行測序。提取陽性克隆質(zhì)粒，將pHIS2+AfFT3promoter轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布在SD/-Trp-His固體培養(yǎng)基上，待長出菌落后，挑取單菌落稀釋后涂布到SD/-Trp-His不同濃度梯度的3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）培養(yǎng)基，篩選出能抑制組氨酸滲漏的最低3-AT濃度。再將pHIS2-AfFT3promoter+pGADT7-Rec2-53-AfEIN3、pGADT7-Rec2-53+p53HIS2（陽性對照）和pGADT7-Rec2-53+pHIS2（陰性對照）分別共轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于SD/-Trp-Leu固體培養(yǎng)基上，待長出單菌落后，取單菌落稀釋10、100和1000倍后點涂在三缺固體培養(yǎng)基（-Trp/-Leu/-His，含有適宜濃度的3-AT）上，觀察各組菌落的生長情況，確定其互作關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1 AfFT3基因及其啟動子克隆結(jié)果

提取蜻蜓鳳梨心葉總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA第一鏈，以其為模板進行PCR擴增，結(jié)果如圖2-A。獲得的AfFT3基因全長570 bp，編碼區(qū)（CDS）序列為465 bp，測序結(jié)果與參考序列完全一致，克隆載體菌液保存于-80℃。以蜻蜓鳳梨DNA為模板分段擴增獲得A/FT3基因啟動子3段序列（A/FT3-P1、A/FT3-P2和A/FT3-P3），序列長度分別為390、1077和552 bp（圖2-B），測序驗證正確后菌液保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 AfFT3基因生物信息學(xué)分析結(jié)果

AfFT3基因編碼154個氨基酸殘基，含精氨酸（Arg）最多，不含吡咯賴氨酸（Pyrrolysine）和硒代半胱氨酸（Selenium cysteine），該蛋白分子量為17.3 kD理論等電點（pI）為9.35，不穩(wěn)定指數(shù)和平均親水性指數(shù)（GRAVY）分別為39.89和-0.330，說明該蛋白較穩(wěn)定，為親水性蛋白。為進一步了解該蛋白是否有其他膜結(jié)合相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，利用TMHMM 2.0預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白無跨膜螺旋區(qū)（圖3），說明該蛋白不是跨膜蛋白。通過SOPMA預(yù)測發(fā)現(xiàn)，AfFT3蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋（11.61%）、延伸鏈（27.74%）和無

規(guī)則卷曲（56.77%）構(gòu)成。通過NetPhos 3.1預(yù)測發(fā)現(xiàn)，AfFT3蛋白有PKC、PKA、cdc2、INSR和GSK3等多個蛋白激酶磷酸化位點，為后續(xù)探究該基因功能調(diào)控機制提供參考。

選取擬南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、煙草（Nicotiana tabacum）、陸地棉（Gossypium hirsutumL.）和菠蘿（Ananas como-sus）6個物種的FT蛋白與AfFT3蛋白進行多重比對及結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示，AfFT3蛋白與其他FT蛋白具有高度相似性，且均包含保守的PEBP結(jié)構(gòu)域（圖4），說明AfFT3屬于PEBP家族，且其中2個氨基酸殘基138Trp和140GIn突變?yōu)?3?Met和14Glu。MEME分析結(jié)果顯示，AfFT3蛋白與其他FT蛋白具有基本一致的保守基序，進一步驗證了以上結(jié)果（圖5）。從系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖6）可看出，PEBP家族可分為FT-like、TFL1-like和MFT-like蛋白亞家族，AfFT3屬于FT-like蛋白亞家族，與TFL-like亞家族親緣關(guān)系較近，與MTFL-like亞家族的親緣關(guān)系較遠，說明AfFT3蛋白具有與FT-like或TFL-like蛋白家族相似的功能。

2.3 AfFT3基因在不同溫度及外源乙烯處理下的表達分析結(jié)果

對蜻蜓鳳梨進行不同溫度和外源乙烯處理，通過實時熒光定量PCR檢測AfFT3基因在不同溫度及外源乙烯處理下表達水平變化，結(jié)果（圖7）顯示，與CK相比，高溫處理下A/FT3基因在蜻蜓鳳梨中的相對表達量均顯著升高（Plt;0.05，下同），而低溫處理下相對表達量差異極顯著升高（Plt;0.01，下同），常溫處理與CK的相對表達量差異不顯著（Pgt;0.05，下同），可排除大棚與氣候培養(yǎng)箱不同環(huán)境引起的基因表達差異，表明高溫和低溫脅迫均誘導(dǎo)AfF73基因的高效表達，但誘導(dǎo)程度不同。在高溫、常溫和低溫條件下，使用外源乙烯處理后，AfFT3基因在蜻蜓鳳梨中的相對表達量均較CK顯著或極顯著升高，在常溫處理下其相對表達量最高，推測高溫和低溫環(huán)境下，乙烯對AFT3基因的表達誘導(dǎo)效果較常溫有所降低，尤其在高溫環(huán)境下下調(diào)更顯著。

2.4 AfFT3基因表達載體構(gòu)建及擬南芥轉(zhuǎn)基因株系鑒定結(jié)果

將AfFT3基因連接至CAMV35S表達載體后，挑取單克隆進行菌液PCR檢測，結(jié)果顯示4個單克隆均與陽性對照條帶大小一致，且陰性對照無擴增條帶。測序結(jié)果顯示，表達載體CAMV35S：：AfFT3構(gòu)建成功，將其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞后進行培養(yǎng)，菌液PCR檢測結(jié)果均為陽性單克隆，表明CAMV35S：：AfFT3質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌（圖8-A）。對野生型、轉(zhuǎn)空載體株系及轉(zhuǎn)CAMV35S：：AfFT3擬南芥株系進行PCR鑒定，電泳檢測結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)CAMV35S：：AfFT3株系中擴增出目的基因條帶（圖8-B），表明AfFT3基因已成功轉(zhuǎn)入擬南芥，共獲得6個轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，命名為L₁～L?

2.5 AfFT3基因表達對擬南芥開花的影響

對轉(zhuǎn)基因擬南芥株系進行抗性篩選，獲得超表達轉(zhuǎn)基因純合體L?和L?，而其他株系超表達不明顯。將轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥種子同時播種于基質(zhì)中，對其生長狀況進行觀察，分別統(tǒng)計其抽墓時間，并觀察開花情況。由圖9-A可看出，轉(zhuǎn)基因純合體L?和L?較轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥明顯延遲抽墓。通過記錄擬南芥抽墓時間，得出轉(zhuǎn)基因株系與野生型擬南芥抽墓時間存在顯著差異，平均晚8 d（圖9-B），說明AfFT3基因在擬南芥中發(fā)揮延遲開花的調(diào)控功能。

2.6 AfFT3基因啟動子與AfEIN3互作關(guān)系驗證

通過酵母單雜交試驗對AfFT3基因啟動子片段和AfEIN3轉(zhuǎn)錄因子進行互作驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30℃倒置培養(yǎng)3～5 d后，含陽性對照質(zhì)粒的菌落及含pHIS2-AfFT3-P1+pGADT7-Rec2-53-AfEIN3和pHIS2-AfFT3-P3+pGADT7-Rec2-53-AfEIN3的轉(zhuǎn)化菌落均能在SD/-Trp-His-Leu固體培養(yǎng)基上正常生長，且在SD/-Trp-His-Leu+X-a-gal固體培養(yǎng)基中變藍；含陰性對照質(zhì)粒的菌落及含pHIS2-AfFT3-P2+pGADT7-Rec2-53-AfEIN3在三缺固體培養(yǎng)基上未長出菌落，也未變藍（圖10），表明AfFT3-P 1和AfFT3-P3可與AfEIN3發(fā)生互作。

3討論

本研究從蜻蜓鳳梨中克隆出FT-like亞家族中的AfFT3基因全長，探究其在蜻蜓鳳梨生長發(fā)育過程中所發(fā)揮的作用。AfFT3基因編碼的氨基酸序列含有FT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，屬于FT-like亞家族，且與TFL-like亞家族親緣關(guān)系較近，且同源序列比對結(jié)果顯示，AfFT3蛋白的138Trp和1?0GIn分別突變?yōu)?38Met和140Glu。FT-like亞家族最早在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物中FT-like具有促進開花的功能，F(xiàn)T蛋白功能相對保守，大多數(shù)殘基的改變不會影響其功能。但隨著研究植物種類的增加，發(fā)現(xiàn)FT的同源基因也會呈現(xiàn)抑制開花的功能，其中5個關(guān)鍵氨基酸位點（8STyr、0Glu、13?Trp、14GIn和1?Asn）的任意突變均導(dǎo)致功能的完全改變，由促進開花功能轉(zhuǎn)變成其同源基因（TFL1）的抑制開花功能。如TFL1與FT氨基酸序列相似性較高，構(gòu)象上存在微小差異，但功能截然相反，會抑制莖尖分生組織形成花原基，從而延遲植物開花（Fan et al.，2014;Ho and Weigel，2014;Schiessl et al.，2017）。擬南芥TFL1蛋白中氨基酸發(fā)生改變，會使其轉(zhuǎn)變?yōu)殚_花素基因，導(dǎo)致植物提前開花（Xi et al.，2010）。菊花CmFTL3蛋白中氨基酸發(fā)生改變也會使其喪失促進開花的功能（Sun et al.，2018）。從煙草中分離出4個FT-like基因，其中NtFTI-3具有延遲開花的調(diào)控功能，NtFT4具有促進開花的調(diào)控功能（Harig et al.，2012）。在其他作物中也鑒定出具有相同功能的FT同源基因，如甘蔗ScFTI（Coelho et al.，2014）、大豆GmFT4（Hong et al.，2014）及矮牽牛PhFTI（Wu et al.，2019）等。結(jié)合上述研究結(jié)果，推測AfFT3基因具有延遲開花的功能，且這種功能的改變是由于殘基的突變造成。

研究表明，溫度對植物開花的影響不僅體現(xiàn)在低溫誘導(dǎo)植物開花的春化途徑中，還直接影響開花行為。當(dāng)溫度從20℃開始逐漸升高時，一些植物的花期會提前或延遲，一般情況下高環(huán)境溫度促進開花，而低環(huán)境溫度延遲開花（Jagadish et al.，2016）。擬南芥在短日照條件下開花會顯著延遲，但溫度較高時能克服短日照對開花延遲的影響（Halliday et al.，2003）。不同溫度下FLC家族基因FLM和開花抑制因子基因SVP的表達穩(wěn)定性影響了開花行為，同時發(fā)現(xiàn)光敏色素互作因子4基因（PIF4）、microRNA399和microRNA172等在高溫下調(diào)控植物開花，而microRNA156在低溫環(huán)境下表達上升，是低溫下抑制開花的負(fù)調(diào)節(jié)因子（Verhage et al.，2014）。Hemming等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，小麥和大麥可在25℃長日照下進行生殖發(fā)育，而在短日照下FT-like基因不表達。在中國水仙中，NFT1作為FT的同源基因，在溫度升高時表達上調(diào)，從而促進了開花（Liet al.，2013）。Leeggangers等（2018）克隆獲得郁金香TgFT2基因和麝香百合LIFT基因，分別在高溫和低溫下調(diào)控花的轉(zhuǎn)變，而郁金香TgFTI和TgFT3基因卻抑制開花。春蘭CgSVP基因作用于花器官決定基因CgAP1和開花整合子基因CgSOCI，在低溫誘導(dǎo)開花途徑中可能發(fā)揮重要作用（Yang et al.，2019）。本研究中AfFT3基因具有抑制擬南芥開花的調(diào)控功能，通過不同溫度處理后，相對表達量均呈上升趨勢，但上升幅度不同，推測其表達受溫度影響，從而抑制蜻蜓鳳梨開花，今后應(yīng)深入研究其對溫度響應(yīng)及開花調(diào)控機制。

乙烯是一種小分子氣體植物激素，可調(diào)控植物生長發(fā)育的多個方面（Müller and Munné-Bosch 2015）。目前已研究發(fā)現(xiàn)，部分響應(yīng)乙烯及其信號通路調(diào)控鳳梨科植物開花的基因，如花器官決定基因（AfAPI）、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶2基因（AfACO2）（Lei et al.，2016;Liet al.，2016a，2016b）。利用外源乙烯可促進成花的方法很早就被應(yīng)用，如乙烯熏蒸結(jié)合高溫處理能提高水仙的成花率（姜琳等，2021）。申艷紅等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，外源乙烯處理提高了中國水仙鱗莖盤中NtFT基因的表達量，與本研究結(jié)果一致，推測AfFT3基因參與調(diào)控乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，同時受到溫度途徑誘導(dǎo)，從而影響蜻蜓鳳梨開花。本研究酵母單雜交試驗結(jié)果顯示，AfEIN3基因可直接結(jié)合AFT3基因啟動子，初步推測AfEIN3基因通過調(diào)控AfFT3基因表達從而影響蜻蜓鳳梨開花，而酵母單雜交實驗存在假陽性的情況，因此后續(xù)還需通過凝膠遷移等試驗進行驗證，其調(diào)控機制也尚待探究。

4結(jié)論

高溫、低溫脅迫和乙烯均不同程度誘導(dǎo)AfFT3基因的高效表達，但在高溫和低溫條件下乙烯對AfFT3基因的表達誘導(dǎo)效果較常溫有所降低，其轉(zhuǎn)基因株系延遲抽墓，說明AFT3基因參與調(diào)控蜻蜓鳳梨開花過程，且響應(yīng)溫度和乙烯信號。

參考文獻（References）：

陳錫，趙德剛，陳瑩，李小冬，吳佳海，王小利.2017.高羊茅FaFT2基因克隆及表達分析[J].植物生理學(xué)報，53（8）：1523-1531.[Chen X，Zhao DG，Chen Y，LiXD，WuJH，Wang XL.2017.Cloning and expression analysis of FaFT2 gene in tall fescue[J].Plant Physiology Journal，53（8）：1523-1531.]doi：10.13592/j.cnki.ppj.2017.0223.

叢漢卿，信彩云，張銀東，李志英，徐立.2013.‘阿蒂擎天’鳳梨谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與乙烯誘導(dǎo)表達特性的初步分析[J].分子植物育種，11（3）：365-370.[Cong HQ，XinCY，ZhangYD，LiZY，Xu L.2013.Cloning of glutathione-s-transferase gene and primary expression"analysis in Guzmania witmackii‘Attila’induced by ethy-lene[J].Molecular Plant Breeding，11（3）：365-370.]doi：10.3969/mpb.011.000365.

姜琳，孫興，羅可欣，郭志雄，陳桂信，佘文琴，潘東明，潘騰飛.2021.多花水仙種球膨大期對乙烯的響應(yīng)研究[J].核農(nóng)學(xué)報，35（6）：1300-1306.[Jiang L，Sun X，Luo KX，Guo ZX，Chen GX，She WQ，Pan DM，Pan TF.2021.Response of Narcissws tazetta to ehtylene during bulb swelling phase[J].Jourmal of Nuclear Agricultural Scien-ces，35（6）：1300-1306.]doi：10.11869/j.issn.100-8551.2021.06.1300.

蔣甲福，楊一曼，王琦，陳素梅，陳發(fā)棣.2021.植物開花素FT的功能及其表觀調(diào)控機制的研究進展[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，44（5）：805-811.[Jiang JF，Yang YM，Wang Q，Chen SM，Chen FD.2021.Progress in mechanism of the function of florigen FT and its epigenetic regulation[J].Journal of Nanjing Agricultural University，44（5）：805-811.]doi：10.7685/jnau.202012016.

李文陽，馬夢迪，郭紅衛(wèi).2013.植物激素乙烯作用機制的最新進展[J].中國科學(xué)：生命科學(xué)，43（10）：854-863.[LiW Y，Ma MD，Guo HW.2013.Advances in the action of plant hormone ethylene[J].Scientia Sinica（Vitae），43（10）：854-863.]doi：10.1360/052013-284.

申艷紅，姜濤，趙灣灣，阮蔚華，張寒，周斌，陳紅梅，陳曉靜.2019.乙烯處理水仙催多花技術(shù)和機理的研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，27（6）：1003-1015.[Shen YH，Jiang T，Zhao WW，Ruan WH，Zhang H，Zhou B，Chen HM，Chen XJ.2019.Study on technology and mechanism of ethylene treatment promotes the formation of more flowers"of Narcissws tazetta var.chinensis[J].Journal of Agricul-tural Biotechnology，27（6）：1003-1015.]doi：10.3969/j.issn.1674-7968.2019.06.006.

趙赫，陳受宜，張勁松.2016.乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與植物非生物脅迫反應(yīng)調(diào)控研究進展[J].生物技術(shù)通報，32（10）：1-10[Zhao H，Chen SY，Zhang JS.2016.Ethylene signaling pathway in regulating plant response to abiotic stress[J]Biotechnology Bulletin，32（10）：1-10.]doi：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.001.

Abe M，Kobayashi Y，Yamamoto S，Daimon Y，Yamaguchi A，Ikeda Y，IchinokiH，Notaguchi M，GotoK，Araki T.2005 FD，a bZIP protein mediating signalsfrom the floral path-way integrator FTat the shoot apex[J].Science，309（5737）：1052-1056.doi：10.1126/science.1115983.

Abe M，Kosaka S，Shibuta M，Nagata K，Uemura T，Nakano A，Kaya H.2019.Transient activity of the florigen complex"during the floral transition in Arabidopsis thaliana[J].De-velopment，146（7）：dev171504.doi：10.1242/dev.171504.

CloughSJ，Bent AF.1998.Floral dip：Asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis"thaliana[J].The Plant Journal，16（6）：735-743.doi：10.1046/j.1365-313x.1998.00343.x.

Coelho CP，Minow MA A，Chalfun-Júnior A，Colasanti J.2014.Putative sugarcane FT/TFL1 genes delay flowering time and alter reproductive architecture in Arabidopsis[J].Frontiers in Plant Science，5：221.doi：10.3389/fpls.2014.00221.

Fan CM，Hu RB，Zhang XM，Wang X，Zhang WJ，Zhang QH，Ma JH，F(xiàn)uYF.2014.Conserved CO-FT regulons con-tribute tothe photoperiod flowering control in soybean[J].BMC Plant Biology，14：9.doi：10.1186/1471-2229-14-9.

Guo HW，Ecker JR.2003.Plant responses to ethylene gas are mediatedby SCF（EBF1/EBF2）-dependent proteolysis of EIN3 transcription factor[J].Cell，115（6）：667-677.doi：10.1016/s0092-8674（03）00969-3.

Halliday KJ，Salter MG，Thingnaes E，Whitelam GC.2003.Phytochrome control of flowering is temperature sensitive and correlates with expression of the floral integrator FT[J].The Plant Journal，33：875-885.doi：10.1046j.1365-313X.2003.01674.x.

Harig L，Beinecke FA，OltmannsJ，Muth J，Müller O，Riüping B，Twyman RM，F(xiàn)ischer R，PrüferD，Noll GA.2012.Pro-teins from the FLOWERING LOCUS T-like subclade of the PEBP family act antagonistically to regulate floral ini-tiation in tobaco[J].Plant Journal，72（6）：908-921.doi：10.1111/j.1365-313X.2012.05125.x.

Hemming MN，Walford SA，F(xiàn)ieg S，Dennis ES，Trevaskis B."2012.Identification of high-temperature-responsive genes in cereals[J].Plant Physiology，158（3）：1439-1450.doi：10.2307/41435338.

Ho WW，Weigel D.2014.Structural features determining flower-promoting activity of Arabidopsis FLOWERING LOCUS T[J].The Plant Cell，26（3）：552-564.doi：10.1105/tpc.113.115220

Hong Z，Lv SX，Shuang L，Wu H，Xia Z.2014.GmFT4，a homolog of FLOWERING LOCUS T，is positively regu-lated by EI and functions as aflowering repressor in soy-bean[J].PLoS One，9（2）：e89030.doi：10.1371/journal pone.0089030

Iqbal N，Khan NA，F(xiàn)errante A，Trivellini A，F(xiàn)rancini A，Khan MIR.2017.Ethylene role in plant growth，development and senescence：Interaction with other phytohormones[J].Frontiers inPlant Science，8：475.doi：10.3389/fpls.2017.00475.

Jagadish SVK，Bahuguna RN，Djanaguiraman M，Gamuyao"R，Prasad PVV，Craufurd PQ.2016.Implications of high temperature and elevated CO?on flowering time in plants[J].Frontiers in Plant Science，7：913.doi：10.3389/fpls 2016.00913.

Kinoshita A，Richter R.2020.Genetic and molecular basis"of floral induction in Arabidopsis thaliana[J].Journal of"Experimental Botany，71（9）：2490-2504.doi：10.1093/jxb/eraa057.

Kobayashi Y，Kaya H，Goto K，Iwabuchi M，Araki T.1999.A pair of related genes with antagonistic roles in mediating flowering signals[J].Science，286（5446）：1960-1962.doi：10.1126/science.286.5446.1960.

Kralemann LE M，Scalone R，Andersson L，Hennig L.2018.North European invasion by common ragweed is associa-ted with early flowering and dominant changes in FT/TFLI expression[J].Journal of Experimental Botany，69（10）：2647-2658.doi：10.1093/jxb/ery100.

Leeggangers HACF，Rosilio-Brami T，Bigas-Nadal J，Rubin N，van Djk ADJ，Nunez de Caceres Gonzalez FF N，Saadon-Shitrit S，Nijveen H，Hilhorst HWM，Immink R

G H，Zaccai M.2018.Tulipagesneriana and Lilimm longi-florum PEBP genes and their putative roles in flowering time control[J].Plant and Cell Physiology，59（1）：90-106.doi：10.1093/pcp/pcx164.

Lei M，LiZY，WangJB，F(xiàn)u YL，AoMF，Xu L.2016.4fAP2-1，an age-dependent gene of aechmea fasciata，responds to exogenous ethylene treatment[J].International Journal of Molecular Sciences，17（3）：303.doi：10.3390/ijms17030303.

Lei M，Li ZY，Wang JB，F(xiàn)uYL，Xu L.2019.Ectopic expres-sion of the Aechmea fasciata APETALA2 gene AfAP2-2reduces seed size and delays flowering in Arabidopsis[J].Plant Physiology and Biochemistry，139：642-650.doi：10.1016/j.plaphy.2019.03.034.

LiM Z，An FY，LiWY，Ma MD，F(xiàn)eng Y，Zhang X，Guo HW.2016a.DELLA proteins interact with FLC to repress flowering transition[J].Journal of Integrative Plant Bio-logy，58（7）：642-655.doi：10.1111/jipb.12451.

LiYH，WuQS，Huang X，LiuS H，Zhang HN，Zhang Z，Sun GM.2016b.Molecular cloning and characterization of four genes encoding ethylene receptors associated with"pineapple（Ananas comosus L.）flowering[J].Frontiers"Plant Science，7：710.doi：10.3389/fpls.2016.00710.

Li ZY，Wang JB，Zhang XB，Zhu GP，F(xiàn)uY L，Jing YL，"Huang BL，Wang XB，Meng CY，YangQQ，Xu L.2022.The genome ofAechmea fasciataprovides insights into the evolution of tank epiphytic habits and ethylene-induced flowering[J].Communications Biology，5（1）：920.doi：10.1038/s42003-022-03918-4.

Livak KJ，Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the"2-A^0method[J].Methods，25（4）：402-408.doi：10.1006/meth.2001.1262.

Luo X，Chen T，Zeng XL，He DW，He YH.2019.Feedback"regulation of FLC by FLOWERING LOCUS Tand FD"through a 5FLC promoter region[J].Molecular Plant，12（3）：285-288.doi：10.1016/j.molp.2019.01.013.

Müller M，Munné-Bosch S.2015.Ethylene response factors：A key regulatory hub in hormone and stress signaling[J] Plant physiology，169（1）：32-41.doi：10.1104/pp.15.00677.Nakamura S，Abe F，Kawahigashi H，Nakazono K，Tagiri A， Matsumoto T，Utsugi S，Ogawa T，Handa H，Ishida H， Mori M，Kawaura K，OgiharaY，Miura H.2011.A wheat homolog of MOTHER OF FTAND TFL1 acts in the regu-lationof germination[J].The Plant Cell，23（9）：3215-3229.doi：10.1105/tpc.111.088492.

Peng FY，Hu ZQ，Yang RC.2016.Bioinformatic prediction of transcription factor binding sitesat promoter regions of"genes for photoperiod and vernalization responses in model and temperate cereal plants[J].BMC Genomics，17：573.doi：10.1186/s12864-016-2916-7.

Schiessl SV，Huettel B，Kuehn D，Reinhardt R，Snowdon RJ.2017.Flowering time gene variation in Brassica species showsevolutionary principles[J].Frontiers in Plant Scien-ce，8：1742.doi：10.3389/fpls.2017.01742.

Shim JS，Jang G.2020.Environmental signal-dependent regu-lation of flowering time in rice[J].International Journal of Molecular Sciences，21（17）：6155.doi：10.3390/ijms21176155.

Sun J，Cao PP，Wang LJ，Chen SM，Chen FD，Jiang JF.2018.The loss of asingle residue from CmFTL3 leads to the failure offlorigen to flower[J].Plant Science，276：99-104.doi：10.1016/j.plantsci.2018.08.005

Taoka K，Ohki I，Tsuji H，F(xiàn)uruita K，Hayashi K，Yanase T，Yamaguchi M，Nakashima C，Purwestri YA，Tamaki S，Ogaki Y，Shimada C，NakagawaA，Kojima C，Shimamoto K.2011.14-3-3 proteins act as intracellular receptors for-rice Hd3a florigen[J].Nature，476：332-335.doi：10.1038/nature10272.

Verhage L，Angenent GC，Immink RGH.2014.Research on floral timing by ambient temperature comes into blossom[J].Trends in Plant Science，19（9）：583-591.doi：10.1016/j.tplants.2014.03.009.

Wu L，Li F，Den QH，Zhang SS，Zhou Q，Chen F，Liu BJ，Bao MZ，Liu GF.2019.Identification and characteriza-tion of the FLOWERING LOCUS T/TERMINAL FLOWER 1 gene family in Petumia[J].DNA and Cell Bio-logy，38（9）：4720-4734.doi：10.1089/dna.2019.4720.

XiWY，Liu C，Hou XL，Yu H.2010.MOTHER OF FT AND TFLI regulates seed germination through anegative feed-back loop modulating ABA signaling in Arabidopsis[J].The Plant Cell，22（6）：1733-1748.doi：10.1105/tpc.109.073072.

Yang FX，Zhu GF，Wei YL，Gao J，Liang G，Peng LY，LuC Q，Jin JP.2019.Low-temperature-induced changes in the transcriptome reveal amajor role of CgSVP genes in regu-lating flowering of Cymbidium goeringii[J].BMC Geno-mics，20（1）：53.doi：10.1186/s12864-019-5425-7.

（責(zé)任編輯 陳燕）