摘要：【目的】明確余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病的病原菌種類，了解其生物學(xué)特性，篩選有效的防治藥劑，為余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病的科學(xué)診斷和田間防治提供理論依據(jù)?！痉椒ā繌膹V東省汕尾市陸河縣余甘子產(chǎn)業(yè)園種植基地采集發(fā)生斑點(diǎn)病的余甘子果實(shí)，采用組織分離法對余甘子斑點(diǎn)病病果進(jìn)行病原菌分離，通過形態(tài)學(xué)特征和基于多基因（ITS、TUB和EFl-α）的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析對病原菌進(jìn)行鑒定；采用針刺接種法測定病原菌菌株的致病力；采用菌絲生長速率法測定不同培養(yǎng)條件對病原菌菌絲生長的影響；通過室內(nèi)毒力測定評估12種常見殺菌劑對病原菌的抑菌活性?！窘Y(jié)果】從余甘子病果中分離出1株病原真菌菌株P(guān)E3，致病性測定結(jié)果表明，該菌株為余甘子斑點(diǎn)病致病菌，其形態(tài)特征與間座殼菌Diaporthe phoemicicola相似，且其ITS、TUB和EFI-a基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析顯示與D.phoenicicola聚在同一分支。生物學(xué)特性測定結(jié)果顯示，菌株P(guān)E3菌絲生長的最適溫度為25℃，最適pH為7，最適生長碳源為甘油和蔗糖，最適生長氮源為酵母提取物。室內(nèi)毒力測定結(jié)果顯示，450 g/L咪鮮胺乳油對菌株P(guān)E3菌絲生長的抑制作用最強(qiáng)，抑制中濃度（EC50）為0.019 mg/L;其次是8%氟硅唑微乳劑、10%苯醚甲環(huán)唑微乳劑和25%吡唑醚菌酯懸浮劑，EC50分別為0.023、0.124和0.194 mg/L;而2%春雷霉素水劑對菌株P(guān)E3菌絲生長的抑制效果最差，EC50為402.336 mg/L?！窘Y(jié)論]間座殼菌D.phoenicicola是引起余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病的病原菌，450 g/L咪鮮胺乳油、8%氟硅唑微乳劑、10%苯醚甲環(huán)唑微乳劑和25%吡唑醚菌酯懸浮劑能有效防治余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病，可在余甘子種植中推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：余甘子；果實(shí)斑點(diǎn)?。婚g座殼菌；生物學(xué)特性；毒力測定

中圖分類號：S436.67文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）02-0479-10

Identification，biological characteristics and screening of fungi-cides for Phyllanthus emblica L.spot disease pathogen

LAI Duo'，WANG De-lin'，ZHOU Guo-chang2，SHAO Xue-hua'，QIN Jian'，

ZHUANG Qing-li'，CAI Shi-ke3?，XIAO Wei-qiang'*

（'Institute of Fruit Tree Research，GuangdongAcademy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of South Subtropical Fruit Biology and Genetic Resource Utilization，Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Provincial Key Laboratory ofTropical and SubtropicalFruit Tree Research，Guangzhou，Guangdong 510640，China;2Shanwei Academy of Agricultural Sciences，Shanwei，Guangdong 516699，China;'Crops Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou，Guangdong 510640，China）

Abstract：[Objective]The purpose of the study was to identify the pathogen species of Phyllanthus emblica L.fruit spot disease，to understand its biological characteristics，to screen the effective fungicides，and to provide theoretical ba-sis for the scientific diagnosis and field control of Pemblica fruit spot disease.【Method】The Pemblica fruits with spot disease were collected from the planting base of Pemblica industrial park in Luhe County of Shanwei city，Guangdong Province.Tissue separation method was used to isolate pathogens from Pemblica fruits with spot disease.The pathogens were identified by morphological characteristics and phylogenetic evolutionary analysis based on multiple genes（ITS，TUB and EFl-α）.The pathogenicity of the pathogen strains was determined using the pin-prick inoculation method.The effects of different culture conditions on the mycelial growth of pathogens were determinedbased on the mycelium growth rate method，and the inhibition activities of 12 common fungicides against the pathogen were evaluated by indoor viru-lence assay.【Result】A pathogenic fungus strain PE3 was isolated from the diseased fruit of Pemblica.The pathogenicity test results showed that this strain was the pathogen causing the spot disease of Pemblica.Its morphological characteris-tics were similar to those of Diaporthe phoenicicola.Phylogenetic tree analysis of its ITS，TUBand EFI-a genes showed that it was clustered in the same branch with D.phoenicicola.The results of biological characteristics measurements showed that the optimum temperature for mycelial growth of strain PE3 was 25℃，the optimum pH was 7，the optimum carbon sources for growth were glycerin and sucrose，and the optimum nitrogen source for growth was yeast extract.The results of indoor virulence assay showed that 450 g/L prochloraz emulsifiable concentrate had the strongest inhibition ef fect on mycelial growth of strain PE3，with median inhibitory concentration（ECso）of 0.019 mg/L.It was followed by 8%flusilazole microemulsion，10%difenoconazole microemulsion and 25%pyraclostrobin suspension with ECso of 0.023，0.124 and 0.194 mg/L，respectively.However，2%kasugamycin aqueous solution had the worst inhibition effect on mycelial growth，with ECso of 402.336 mg/L.【Conclusion】D.phoenicicola is the pathogen causing the fruit spot di sease in P.emblica.The 450 g/L prochloraz emulsifable concentrate，8%flusilazole microemulsion，10%difenoconazole microemulsion and 25%pyraclostrobin suspension can effectively prevent and control the fruit spot disease of Pemblica which can bepromoted and applied in Pemblica planting

Key words：PhyllanthusemblicaL.;fruit spot disease;Diaporthe phoenicicola;biological characteristics;viru-lence assay

Foundation items：Guangdong Key Research and Development Project（2019B020217003-04）;Science and Tech-nology Cooperation Project of Shanwei Branch of Guangdong Academy of Agricultural Sciences（2023 Branch Special 01）;Science and Technology Plan Projectof Shanwei City（2023B006）

0引言

【研究意義】余甘子（Phyllanthus emblica L.）又稱油甘子、牛甘果、滇橄欖等，為大戟科葉下珠屬小喬木特色經(jīng)濟(jì)樹種。余甘子果實(shí)營養(yǎng)豐富，富含維生素C以及黃酮、多酚、鞣質(zhì)等多種生物活性成分（王建超等，2018;程子賢等，2022;Yan et al.，2022），在我國已有近2000年的藥食利用歷史，具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳、抗氧化（Liet al.，2020;李曉強(qiáng)等，2023）、抗衰老（Pientaweeratch et al.，2016）、抗腫瘤（馬美等，2020;Kumar et al.，2022）、消炎（Li et al.，2022;Liet al.，2023）、降脂（Chen et al.，2023）等藥理作用，被國家衛(wèi)生部列入首批藥食兼用名單。余甘子廣泛分布于東南亞和南亞等熱帶、亞熱帶地區(qū)，在我國福建、廣東、廣西和云南等地均有分布，其中廣東省作為余甘子主產(chǎn)區(qū)之一，生產(chǎn)的余甘子以鮮食為主，具有產(chǎn)量高、品質(zhì)佳、口感好等優(yōu)勢。近年來，隨著余甘子新式茶飲（趙旭珠等，2020;鄭聰和李勝楠，2022;高楚騰等，2023）、果汁（徐涓等，2019）、果粉（宋志姣等，2023）等產(chǎn)品的興起，其市場需求量不斷增加，種植面積日益增大，已成為部分地區(qū)鄉(xiāng)村振興的特色產(chǎn)業(yè)之一。然而，當(dāng)前余甘子栽培技術(shù)相對落后，管理粗放，導(dǎo)致余甘子田間病害呈明顯加重趨勢，對余甘子產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益造成較大損失，因此，急需加強(qiáng)對余甘子病害的監(jiān)測，為其科學(xué)防治提供技術(shù)支撐?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國內(nèi)外關(guān)于余甘子病害及其病原鑒定的研究已有很多報(bào)道，其病害研究主要集中在采后貯藏病害方面，這與余甘子果實(shí)采后不易貯藏，常溫下易受病菌侵染有關(guān)（陳雨欣等，2022;Dutta et al.，2023）。鄭毅等（2014）采用形態(tài)學(xué)鑒定和rDNA-ITS序列分析從余甘子采后黑療病果實(shí)中分離鑒定出其病原菌為鏈格孢屬（Alternaria spp.）菌株。吳月等（2019）采用形態(tài)學(xué)特征結(jié)合rDNA-ITS序列分析從余甘子采后軟腐病果實(shí)中分離鑒定到一種致病菌青霉菌（Penicillium choe-rospondiatis）;而Sengupta等（2020）從余甘子軟腐病果實(shí)中分離出另一種致病菌，經(jīng)鑒定為擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsis phyllanthus），同時(shí)明確了引起余甘子果實(shí)腐爛病和炭疽病的致病菌分別為指狀青霉菌（Pdigitatum）和膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeo-sporioides）。Dutta等（2023）從余甘子病果中分離出2株能產(chǎn)紅色素和黃色素的致病真菌，采用ITS 和β-tubulin序列分析鑒定為踝節(jié)菌（Talaromyces atroroseus）和青霉菌（P choerospondiatis）。以往研究表明，余甘子果實(shí)采后病害以真菌為主，其中霉菌危害性最大，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致50%減損（Muzaffar et al.，2022）。此外，楊子祥等（2012）調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云南地區(qū)余甘子田間病害主要有銹病、炭疽病和煤污病等。蔣華等（2021）對滇西地區(qū)余甘子主要病蟲害種類及危害情況進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)真菌性病害有13種，其中發(fā)生較嚴(yán)重的病害有黑粉病、炭疽病、褐腐病、煤污病、枝枯病、瘡痂病和褐斑病等7種；而在廣東產(chǎn)區(qū)，余甘子常見的主要病害有銹病和青霉病等（匡石滋等，2020）。在生產(chǎn)種植過程中，余甘子發(fā)生的病害種類繁多，但大多數(shù)病害的識別以田間癥狀觀察為主，多數(shù)尚未明確其確切的病原種類，導(dǎo)致田間用藥缺乏針對性和科學(xué)指導(dǎo)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】2022年12月，本課題組在廣東汕尾對余甘子進(jìn)行病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，田間余甘子果實(shí)腐爛癥狀與已報(bào)道的病害癥狀存在較大差異，發(fā)病率約18%，果面呈紅褐色斑點(diǎn)腐爛癥狀，故稱余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病，果實(shí)感病后腐爛速度較快，危害性大。但目前未見關(guān)于余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病的研究，對引發(fā)該病害的病原菌及其生物學(xué)特性尚不明確，也沒有針對該病害防治藥劑的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題]采用組織分離法對余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病的病原菌進(jìn)行分離，通過形態(tài)學(xué)特征和基于多基因（ITS、TUB和EFI-α）的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析對病原菌進(jìn)行鑒定，采用針刺接種法測定病原菌菌株的致病力，采用菌絲生長速率法測定不同培養(yǎng)條件對病原菌菌絲生長的影響，并通過室內(nèi)毒力測定評估12種常見殺菌劑對病原菌的抑菌活性，以明確該病害的病原菌種類、生物學(xué)特性和有效防治藥劑，為余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病的科學(xué)診斷和田間防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)材料余甘子病果于2022年12月18日從廣東省汕尾市陸河縣余甘子產(chǎn)業(yè)園種植基地采集，放入無菌封口袋，置于冰盒，于當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離。

1.1.2供試培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0g、瓊脂粉15.0g、水1L，pH自然；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀0.5 g、七水硫酸鎂0.5 g、磷酸二氫鉀0.5 g、瓊脂粉15g，水1L。

1.1.3供試藥劑450 g/L咪鮮胺乳油（安道麥馬克西姆有限公司）、30%王銅懸浮劑（江西禾益化工股份有限公司）、25%吡唑醚菌酯懸浮劑（河北成悅化工有限公司）、8%氟硅唑微乳劑（河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司）、10%苯醚甲環(huán)唑微乳劑（河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司）、33.5%喹啉銅懸浮劑（順毅股份有限公司）、30%噁唑菌酮水分散粒劑（陜西華戎凱威生物有限公司）、3%中生菌素可濕性粉劑（河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司）、2%春雷霉素水劑（山西新源華康化工股份有限公司）、80%克菌丹水分散粒劑（山東鄒平農(nóng)藥有限公司）、70%丙森鋅可濕性粉劑（拜爾股份有限公司）、75%抑霉唑硫酸鹽可溶粒劑（安道麥馬克西姆有限公司）。

1.2病原菌分離純化

選取自然發(fā)病具有典型病斑的余甘子果實(shí)，病果用無菌水清洗后，用無菌解剖刀從病果病健交界處切取約5 mm2的組織若干，用75%酒精浸泡3 min，無菌水清洗3次，再用2%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，最后用無菌水清洗3次，取出置于滅菌濾紙上晾干。將病果組織接種在PDA培養(yǎng)基上，于25℃黑暗條件下培養(yǎng)，待長出菌落后挑取菌落邊緣菌絲進(jìn)行純化。

1.3病原菌致病性測定

按照柯赫氏法則，采用針刺損傷接種法對分離菌株進(jìn)行致病性測定。選取健康無病斑、大小一致的余甘子果實(shí)，先用2%次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒后再用無菌水沖洗3次，取出后晾干。用接種針在余甘子果實(shí)赤道部位均勻刺入深3～4 mm的孔，將待測菌株菌絲塊接種于傷口處，置于鋪有保濕紗布的無菌塑料盒，于25℃恒溫條件下培養(yǎng)，每天觀察并記錄果實(shí)發(fā)病情況。出現(xiàn)癥狀后，取發(fā)病部位的病健交界組織再次分離純化，鑒定分離獲得的真菌是否為致病菌。

1.4病原菌鑒定

1.4.1形態(tài)學(xué)鑒定將純化后的病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上，觀察記錄菌落形態(tài)和顏色等。將產(chǎn)生的分生孢子用無菌水沖洗，于光學(xué)顯微鏡下觀察記錄分生孢子形狀、大小等。根據(jù)致病菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征、光學(xué)顯微鏡下分生孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行初步鑒定。

1.4.2分子生物學(xué)鑒定將病原菌菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)，7d后刮取菌絲，采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取菌株基因組DNA。采用通用引物分別擴(kuò)增ITS、EFI-α和TUB基因部分序列，所用引物（表1）均由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系30.0μL：2×PCR Master Mix 15.0μL，DNA模板2.0μL，10μmolL上、下游引物各1.5μL，ddH?O 10.0μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min;95℃30s，54℃30s，72℃1 min，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；72℃延伸1 min，16℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行測序。測序所獲序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTN比對分析。運(yùn)用MEGA 6.0采用鄰接法 （Neighbour-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，采用自舉法（bootstrap）進(jìn)行1000次重復(fù)檢驗(yàn)。

1.5病原菌生物學(xué)特性測定

1.5.1碳源對病原菌菌絲生長的影響在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入2%可溶性淀粉、2%葡萄糖、2%蔗糖、2%半乳糖、2%麥芽糖和2%甘油制成不同碳源培養(yǎng)基，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照（CK）。將病原菌菌餅分別接種在不同碳源培養(yǎng)基中央，于25℃條件下培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)。采用十字交叉法測量各處理菌落直徑，計(jì)算菌絲生長抑制率。

生長抑制率（%）=（對照菌絲直徑-處理菌絲直徑）/對照菌絲直徑×100

1.5.2氮源對病原菌菌絲生長的影響在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入2%葡萄糖，然后分別加入0.2%酵母提取物、0.2%蛋白胨、0.2%硝酸鈉、0.2%氯化銨、0.2%纈氨酸、0.2%甘氨酸、0.2%酪氨酸、0.2%硫酸銨和0.2%硝酸鉀制成不同氮源培養(yǎng)基，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照（CK）;將病原菌菌餅分別接種在不同氮源培養(yǎng)基中央，于25℃條件下培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)，其他試驗(yàn)方法和計(jì)算方法同1.5.1。

1.5.3溫度對病原菌菌絲生長的影響將病原菌菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中心，分別在5、10、15、20、

25、30和35℃下培養(yǎng)3d，每處理3次重復(fù)，其他試驗(yàn)方法和計(jì)算方法同1.5.1。

1.5.4 pH對病原菌菌絲生長的影響用鹽酸和氫氧化鈉將PDA培養(yǎng)基pH分別調(diào)至4、5、6、7、8、9和10。將病原菌菌餅接種在PDA培養(yǎng)基中央，于25℃條件下培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)，其他試驗(yàn)方法和計(jì)算方法同1.5.1。

1.6殺菌劑毒力測定

采用菌絲生長速率法測定12種供試殺菌劑的抑菌活性。將病原菌菌株活化培養(yǎng)5d后，用直徑為5 mm的打孔器從菌落邊緣打取菌餅，分別接入含有殺菌劑的PDA培養(yǎng)基中央，置于25℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)7d后采用十字交叉法測量菌落直徑。每種殺菌劑均設(shè)5個(gè)不同的濃度梯度（表2），以不含殺菌劑的PDA培養(yǎng)基為空白對照，每處理3次重復(fù)，取平均值計(jì)算菌絲生長抑制率。以藥劑濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的菌絲生長抑制率為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，求毒力回歸方程，并計(jì)算各殺菌劑對病原菌菌株的抑制中濃度（EC50）。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病田間發(fā)病癥狀及病原菌分離純化和致病性測定結(jié)果

余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病的典型癥狀如圖1所示。病害發(fā)生初期，在果實(shí)表面出現(xiàn)多個(gè)散生紅褐色小斑點(diǎn)（圖1-A）;隨著病情發(fā)展，小斑點(diǎn)顏色逐漸加深且向四周擴(kuò)散，中間呈黑色，略顯凹陷（圖1-B）;至發(fā)病后期，病斑蔓延擴(kuò)大連接成放射狀的紅褐色大病斑，中間形成明顯的黑色凹陷，凹陷周圍呈紅褐色（圖1-C），嚴(yán)重時(shí)果實(shí)干枯，甚至引起果實(shí)畸形、脫落。

從發(fā)病余甘子果實(shí)上分離得到4株真菌，分別記為PE1、PE2、PE3和PE4，各菌株在PDA培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)相同，菌絲顏色也一樣，選擇菌株P(guān)E3進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

致病性測定結(jié)果（圖2和圖3）顯示，從發(fā)病果實(shí)上分離獲得的菌株P(guān)E3對余甘子果實(shí)具有致病性。菌株P(guān)E3離體果實(shí)接種第3d開始發(fā)病，而未接菌的果實(shí)未出現(xiàn)任何病癥；孢子懸浮液接種5d后果實(shí)發(fā)病癥狀表現(xiàn)為水浸狀至黃褐色的壞死圓形斑，并具有明顯的黃色暈圈，后期病斑擴(kuò)展引起果實(shí)表面凹陷，而對照果實(shí)未發(fā)病。挑取發(fā)病果實(shí)病斑組織進(jìn)行病原菌再分離、純化，得到的病原菌與原接種菌株性狀一致，表明該菌株為余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病致病菌。

2.2病原菌形態(tài)學(xué)特征鑒定結(jié)果

菌株P(guān)E3于PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)觀察，初期菌絲為白色，向四周放射狀生長呈規(guī)則圓形，邊緣平滑，中心菌絲較濃密，四周相對稀疏，生長后期產(chǎn)生黑色小顆粒并有黃色液體排出（圖4-A和圖4-B）。顯微鏡下觀察，菌絲可見明顯分隔（圖4-C）;分生孢子淺綠色，卵圓形，分生孢子直徑約5μm（圖4-D）。

2.3病原菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

以菌株P(guān)E3的基因組DNA為模板，擴(kuò)增ITS、TUB和EFl-α基因部分序列，結(jié)果分別獲得大小約為580、790和310 bp的片段，各條帶清晰，無拖尾雜帶現(xiàn)象。將ITS、TUB、EFI-α基因序列提交至Gen-Bank數(shù)據(jù)庫，BLASTN同源性比對結(jié)果顯示，所測序列與NCBI中的間座殼屬Diaportheceratozamiae、D.pescicola和D.phoenicicola等菌株的同源性相近，無法將其區(qū)分開。利用菌株P(guān)E3和間座殼屬不同種菌株的ITS、TUB、EFI-α基因序列進(jìn)行多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果（圖5）顯示，菌株P(guān)E3與D.phoenicicola聚在同一個(gè)分支。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析將菌株P(guān)E3鑒定為間座殼菌D.phoenicicola。

2.4病原菌生物學(xué)特性

2.4.1不同碳源和氮源對病原菌菌絲生長的影響由表3可知，菌株P(guān)E3在6種碳源培養(yǎng)基上均能生長，但生長速度不完全一致，各碳源處理的菌落直徑比CK提高14.57%～50.33%。其中，菌株P(guān)E3對甘油的利用效果最好，生長速度最快，蔗糖次之，培養(yǎng)5 d后菌落直徑分別為4.54和4.44 cm，兩者間差異不顯著（Pgt;0.05，下同），但均顯著高于其他碳源處理（Plt;0.05，下同）;其次為葡萄糖、麥芽糖和可溶性淀粉；對半乳糖的利用效果最差。

由表4可知，菌株P(guān)E3在9種氮源培養(yǎng)基上均能生長，各氮源處理的菌絲生長速度比CK提高1.47%～60.78%，差異較大。其中，菌株P(guān)E3對酵母提取物的利用效果最好，培養(yǎng)5d后菌落直徑為6.56 cm，顯著大于其他氮源處理；其次為蛋白胨和甘氨酸，菌落直徑分別為6.14和5.48 cm;再次為氯化銨、硝酸鈉、纈氨酸和硝酸鉀；對酪氨酸的利用效果最差，菌落直徑僅為4.14 cm.菌絲生長速度顯著低于其他氮源處理。

2.4.2不同溫度和pH對病原菌菌絲生長的影響

由圖6可知，菌株P(guān)E3菌絲在10～35℃均能生長，不同溫度對菌株P(guān)E3菌絲生長的影響存在顯著差異。菌株P(guān)E3適宜生長溫度為25～30℃，其中25℃最適合菌絲生長，生長速度最快，菌落直徑達(dá)7.40cm;當(dāng)溫度為35、15和10℃時(shí)，菌絲生長受到顯著抑制，菌落直徑分別為2.92、2.14和1.22 cm;當(dāng)溫度為5℃時(shí)，菌絲停止生長。表明溫度低于5℃時(shí)可抑制該菌株的菌絲生長。

由圖7可知，在pH為4～10時(shí)，菌株P(guān)E3菌絲均可生長。當(dāng)pH為7時(shí)菌絲生長速度最快，菌落直徑為8.00 cm，顯著高于其他pH處理；當(dāng)pH為4、5、6和8時(shí)，菌絲生長速度次之，菌落直徑分別為7.38、7.80、7.80和7.02 cm;在pH為9和10時(shí)，菌絲生長顯著減慢，菌落直徑分別為6.04和4.40 cm。表明pH過高會抑制菌株P(guān)E3的菌絲生長。

2.5不同殺菌劑對余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病病原菌的抑制作用

殺菌劑對余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病病原菌的抑制作用測定結(jié)果（表5）顯示，不同殺菌劑對菌株P(guān)E3菌絲生長均有不同程度的抑制作用，各藥劑對菌絲的抑制率均隨著處理濃度的增加而增大，其中，450 g/L咪鮮胺對菌株P(guān)E3菌絲抑制作用最強(qiáng)，EC50為0.019 mg/L，其次為8%氟硅唑、10%苯醚甲環(huán)唑、25%吡唑醚菌酯、3%中生菌素、33.5%喹啉銅和75%抑霉唑硫酸鹽；70%丙森鋅和80%克菌丹的抑制作用較差；30%噁唑菌酮、30%王銅和2%春雷霉素的抑制效果最差，EC50均大于100.00 mg/L。

3討論

斑點(diǎn)病是近年來余甘子主要果實(shí)病害之一，在廣東省汕尾市等產(chǎn)區(qū)發(fā)生較普遍，田間發(fā)病率約18%，嚴(yán)重時(shí)病情指數(shù)達(dá)60%以上，導(dǎo)致余甘子產(chǎn)量降低，品質(zhì)和商品性受到影響。本研究田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病害主要為害果實(shí)，在果面形成散生小點(diǎn)或連接成放射狀的紅褐色病斑，中間呈規(guī)則的圓形黑色凹陷，發(fā)病嚴(yán)重的果面病斑呈塊狀，果實(shí)干枯，甚至引起果實(shí)畸形、脫落。

間座殼屬真菌引起的病害在經(jīng)濟(jì)作物、糧食作物和果蔬作物生產(chǎn)中均有發(fā)生，嚴(yán)重影響了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。該屬真菌包括有性型和無性型2種狀態(tài)，有物種名記錄的就有1000多個(gè)，但目前未能完全對其無性型和有性型的物種完成一一對應(yīng)（豆明珠等，2021）。目前，間座殼屬真菌的形態(tài)分類存在著物種界限模糊的問題（Udayanga et al.，2014a，2014b），因此，其屬下相近種的準(zhǔn)確描述和鑒定存在較大困難。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，核苷酸序列擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育分析在間座殼菌分類中被廣泛應(yīng)用，多個(gè)核苷酸序列或基因片段被用于間座殼菌的系統(tǒng)發(fā)育分析，如ITS、TEF、CAL、HIS、TUB、ACT、EF1-a、FG1093和Apn2等（Udaya-nga et al.，2014a，2014b;Guo et al.，2020;Wang et al.，2021）。本研究通過對余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病病原菌的分離、純化、致病性測定和柯赫氏法則驗(yàn)證，同時(shí)結(jié)合ITS、TUB和EFI-α基因序列對間座殼菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行研究，首次明確了引起余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病的病原菌為間座殼菌D.phoenicicola。

以往研究報(bào)道表明，間座殼屬真菌具有廣泛的寄主，可侵染向日葵（Thompson et al.，2011）、石櫟（Gao et al.，2015）、柑橘（Huang et al.，2015）、藍(lán)莓（李媛等，2017）、獼猴桃（石浩等，2020）、梨（Guo et al.，2020;Wang et al.，2021）、大豆（豆明珠等，2021）、煙草（潘勇等，2022）、甘薯（唐偉等，2022，2023）、櫻桃（周悅妍等，2022）、柿子（Geng and Wang，2023）等多種植物的枝葉、莖干和果實(shí)，造成植物胴枯病、枝枯病、黑點(diǎn)病、軟腐病、潰瘍病、黑腐病、莖腐病等多種病害。但本研究中侵染余甘子果實(shí)的間座殼菌是否侵染其他植物有待進(jìn)一步探究。此外，間座殼屬真菌不僅可通過菌絲和孢子侵染寄主，還可在果實(shí)上分泌促微管解聚A及致癌物質(zhì)赭曲霉毒素A等多種毒素（Kunz et al.，2022），而染病果實(shí)中所含的真菌毒素對人體健康安全造成了嚴(yán)重威脅。因此，應(yīng)對由D.phoenicicola侵染造成的余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病引起足夠重視。

化學(xué)防治一直以來是有效控制果蔬病害的重要措施，但目前對殺菌劑應(yīng)用于D.phoenicicola引起的植物病害防治的毒力篩選報(bào)道不多。本研究在室內(nèi)篩選出咪鮮胺對余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病的病原菌D.phoenicicola的菌絲生長抑制活性最強(qiáng)，其EC50為0.019 mg/L，其次為氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯，EC50均小于0.200 mg/L，而春雷霉素的抑制作用最差。在這些具有良好抑制活性的供試藥劑中，咪鮮胺、氟硅唑和苯醚甲環(huán)唑均屬于甾醇脫甲基酶抑制劑（DMIs），可能與間座殼菌對這類藥劑敏感有關(guān)。雖然這些殺菌劑的作用位點(diǎn)相對單一，但對擴(kuò)充藥劑庫，輪換使用不同作用機(jī)制的藥劑，延長使用壽命具有重要指導(dǎo)意義。本研究僅在室內(nèi)測定了不同殺菌劑對D.phoenicicola的毒力，對于田間防控效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4結(jié)論

余甘子斑點(diǎn)病主要危害果實(shí)，通過形態(tài)學(xué)和ITS、TUB和EFI-α基因序列分析，明確余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病的病原菌為間座殼菌D.phoenicicola;該病原菌在25℃和pH7條件下生長最好，對碳源甘油和蔗糖、氮源酵母提取物的利用率最高；450 g/L咪鮮胺乳油、8%氟硅唑微乳劑、10%苯醚甲環(huán)唑微乳劑和25%吡唑醚菌酯懸浮劑能有效防治余甘子果實(shí)斑點(diǎn)病，可在余甘子種植中推廣應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）