摘 要 以油菜翻壓后煙株根際土壤作為研究對(duì)象，以無(wú)綠肥處理土壤作對(duì)照，采用宏基因組測(cè)序方法對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，研究油菜翻壓對(duì)植煙生長(zhǎng)及根際微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：油菜翻壓后試驗(yàn)組煙草的株高、莖圍、葉面積均顯著高于對(duì)照組，分別增加了10.35%、1.68%、1.96%（p＜0.05）。煙草種植后的微生物豐度均高于煙草種植前。煙草種植前后試驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)菌多樣性指數(shù)均無(wú)顯著性差異；煙草種植前試驗(yàn)組的土壤真菌辛普森指數(shù)、豐富度指數(shù)顯著低于對(duì)照組，植煙根際真菌α多樣性指數(shù)無(wú)顯著性差異。在門水平上，假單胞菌門（Pseudomonadota）和放線菌門（Actinomycetota）是相對(duì)豐度最大的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，總相對(duì)豐度大于80%；與對(duì)照組相比，油菜翻壓組煙株根際土壤中假單胞菌門相對(duì)豐度增加了2.84%，放線菌門相對(duì)豐度減少了0.65%。優(yōu)勢(shì)真菌門是子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、毛霉門（Mucoromycota）和壺菌門（Chytridiomycota），煙草種植后根際土壤中子囊菌門相對(duì)豐度增加了6.32%，毛霉門、壺菌門和擔(dān)子菌門相對(duì)豐度分別減少了3.69%、1.95%和0.55%?；谖锓N的LEfSe分析結(jié)果表明，在植煙根際土壤中，10個(gè)細(xì)菌和10個(gè)真菌物種在油菜翻壓綠肥處理組樣品中顯著富集。PCoA分析結(jié)果表明，不同處理間微生物群落具有顯著差異。根際微生物群落的功能在油菜翻壓后發(fā)生顯著變化（p＜0.05）。在植煙根際土壤試驗(yàn)組處理中顯著富集了8個(gè)代謝通路，屬于代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、人類疾病過(guò)程。結(jié)論：油菜翻壓后提高了煙株株高、莖圍、葉面積和有效葉片數(shù)，同時(shí)改變了微生物的種群豐度和功能，進(jìn)而改善了煙葉品質(zhì)。

關(guān)鍵詞 根際土壤微生物；油菜翻壓；宏基因組；綠肥；多樣性

中圖分類號(hào)：S154 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.13.002

烤煙是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，是卷煙工業(yè)的主要原料。長(zhǎng)期施用化肥，導(dǎo)致植煙土壤逐年衰退，限制了烤煙產(chǎn)量和品質(zhì)的提高，加劇了病蟲害的發(fā)生。綠肥翻壓是一種將綠色植物材料在土壤中翻埋的農(nóng)業(yè)廢棄物處理方法，不僅有助于減少?gòu)U棄物的產(chǎn)生，還能改善土壤質(zhì)量，增加土壤肥力[1-3]。近年來(lái)，綠肥翻壓在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中扮演著越來(lái)越重要的角色。目前，烤煙-綠肥輪作模式已經(jīng)被認(rèn)為可以改變烤煙產(chǎn)量和品質(zhì)，廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。李尚軍等研究發(fā)現(xiàn)綠肥處理能顯著增加烤煙的有效葉數(shù)量，同時(shí)不同綠肥類型替代化肥都能合理改善煙葉化學(xué)成分含量，提升協(xié)調(diào)性[4]。夏融等發(fā)現(xiàn)大麥掩青還田后烤煙產(chǎn)量提高了15.2%，鉀含量提高了22%[5]。熊維亮等研究發(fā)現(xiàn)，綠肥（豌豆）翻壓后可以提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，同時(shí)也能顯著提高煙葉產(chǎn)量[6]。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，作為土壤中最活躍的組分，在維護(hù)土壤生態(tài)平衡、提高土壤肥力和促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面發(fā)揮著重要的作用[7]。王盼盼等研究表明翻壓綠肥可以顯著提高土壤微生物的生物量，改善土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和提高土壤酶活性，提高土壤肥力，促進(jìn)作物增產(chǎn)[8]。呂卓呈等研究表明，綠肥作物可提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，改善土壤微生物多樣性和代謝功能，綠肥翻壓后，提高了作物根際有益菌種類和數(shù)量[9]。林葉春等發(fā)現(xiàn)綠肥壓青還田可提高植煙土壤養(yǎng)分，改變土壤pH，調(diào)節(jié)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[10]。趙冬雪等研究發(fā)現(xiàn)套作綠肥增強(qiáng)了土壤微生物對(duì)碳源的利用能力，并且改變了植煙土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)和增加了群落功能多樣性[11]。

因此，研究翻壓綠肥對(duì)植煙土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，對(duì)于煙區(qū)培肥改土、提高煙草產(chǎn)質(zhì)量具有積極的現(xiàn)實(shí)意義和理論價(jià)值。盡管已有研究表明綠肥翻壓對(duì)土壤質(zhì)量、植物生長(zhǎng)和根際微生物群落具有顯著的影響，但針對(duì)油菜翻壓對(duì)烤煙生長(zhǎng)和根際微生物群落的影響研究仍較少。本研究擬采用油菜殘留物翻壓還田作為綠肥，采用宏基因組測(cè)序探究油菜殘留物翻壓還田作綠肥對(duì)植煙土壤根際微生物群落多樣性的影響，以期為涪陵煙區(qū)的煙葉恢復(fù)性發(fā)展、“榨菜-烤煙”輪作模式的探索提供科學(xué)依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)地概況

本試驗(yàn)在重慶市涪陵區(qū)羅云鎮(zhèn)池坨壩村（107°54'93\"E，29°75'64\"N，海拔621 m）進(jìn)行。羅云鎮(zhèn)為亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，多年平均氣溫16.1 ℃，年平均無(wú)霜期235 d，年平均日照時(shí)數(shù)1 284 h，0 ℃以上持續(xù)期333 d，年平均降水量1 200 mm。試驗(yàn)地地勢(shì)較平坦，水肥條件較均一，地塊較方正，面積0.13 hm2以上，無(wú)淹水現(xiàn)象發(fā)生。土壤基本理化性質(zhì)：pH值4.7，有機(jī)質(zhì)含量14.4 g·kg-1，堿性氮含量134.9 mg·kg-1，有效磷含量100.4 mg·kg-1，速效鉀含量730 mg·kg-1。

1.2" 試驗(yàn)材料

煙草品種：K326，由重慶市煙草公司涪陵分公司提供。

油菜品種：涪優(yōu)3號(hào)，購(gòu)自涪陵本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.3" 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)期為2022年9月至2023年2月，田間試驗(yàn)，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)2個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)小區(qū)，共計(jì)6個(gè)小區(qū)。試驗(yàn)組：栽種油菜處理，每個(gè)小區(qū)面積13.34 m2，分為2壟，每壟長(zhǎng)6 m，每壟種3行，每行18株，每個(gè)小區(qū)共種植108株油菜。對(duì)照組：不栽種油菜處理，只分小區(qū)，不栽種任何作物。油菜種植采用溫室育苗，待油菜苗長(zhǎng)至6葉期移栽至田間。油菜采收后，對(duì)2個(gè)處理分別進(jìn)行翻壓處理，翻壓后種植煙草。分別采集各處理土壤樣品，編號(hào)為B0：未種植油菜翻壓后土壤（對(duì)照組）；B2：種植油菜翻壓后土壤（試驗(yàn)組）；C0：未種植油菜翻壓后煙草根際土壤（對(duì)照組）；C3：種植油菜翻壓后煙草根際土壤（試驗(yàn)組）。采用五點(diǎn)取樣法采集土壤，每個(gè)處理采集3個(gè)重復(fù)，煙草種植前采集0～20 cm耕層土壤，去除石塊、石礫及明顯的有機(jī)物質(zhì)，采用抖根法采集煙草根際土壤。

1.4" 煙株農(nóng)藝性狀調(diào)查

按照YC/T 142—1998《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查方法》標(biāo)準(zhǔn)，各處理選擇有代表性的5株煙株，在煙草打頂后7 d測(cè)定煙株的農(nóng)藝性狀，主要包括煙株的株高、莖圍、有效葉片數(shù)、腰葉長(zhǎng)、腰葉寬，并利用公式計(jì)算葉面積，葉面積（dm2）=葉長(zhǎng)（dm）×葉寬（dm）×0.634 5。

1.5" 土壤樣品基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增

土壤基因組DNA使用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，美國(guó)）試劑盒提取。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，Qubit4.0檢測(cè)DNA樣品濃度。樣品檢測(cè)合格后，送至百易匯能公司進(jìn)行宏基因組測(cè)序。

1.6" 數(shù)據(jù)分析

對(duì)原始下機(jī)序列文件進(jìn)行質(zhì)控來(lái)去除低質(zhì)量序列。首先去掉reads的接頭序列，截掉左右兩端各5個(gè)堿基，并且去除還含有N的reads，去除一條序列中20%的堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于20的1對(duì)reads，得到clean data。質(zhì)控后的數(shù)據(jù)用kraken2進(jìn)行物種注釋[12]，使用bracken和KrakenTools對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和格式轉(zhuǎn)化。用megahit進(jìn)行組裝[13]，使用biotool對(duì)基因組進(jìn)行排序和統(tǒng)計(jì)。通過(guò)計(jì)算Chao1豐富度估計(jì)量（Chao1 richness estimator）、香農(nóng)多樣性指數(shù)（Shannon diversity index）、Richness指數(shù)來(lái)評(píng)估不同處理的微生物群落Alpha多樣性。通過(guò)PCoA（Principal Co-ordinates Analysis）分析即主坐標(biāo)分析[14]來(lái)研究樣本群落組成的相似性或相異性。采用LEfSe（Linear discriminant analysis Effect Size，線性判別分析及影響因子）檢測(cè)組間差異豐富的分類群和功能[15]。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)各編碼非冗余蛋白進(jìn)行功能注釋[16]。

1.7" 統(tǒng)計(jì)分析

使用 Microsoft Excel 2021軟件對(duì)煙株農(nóng)藝性狀、微生物豐度進(jìn)行T檢驗(yàn)分析。使用SPSS 21對(duì)不同處理間α多樣性指標(biāo)進(jìn)行基于Duncan的單因素方差分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 油菜翻壓對(duì)煙草生長(zhǎng)的影響

在煙草種植后對(duì)其株高、莖圍、葉面積和有效葉片數(shù)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表1?？梢钥闯?，種植油菜后翻壓試驗(yàn)組的株高、莖圍、葉面積均顯著高于對(duì)照組，分別增加了10.35%、1.68%、1.96%（p＜0.05）；試驗(yàn)組有效葉片數(shù)高于對(duì)照組，增加了0.14%，但是差異不顯著。

2.2" 油菜翻壓對(duì)植煙根際土壤微生物群落的影響

2.2.1" 對(duì)土壤微生物豐度的影響

對(duì)煙草種植前后試驗(yàn)組和對(duì)照組處理的細(xì)菌和真菌reads數(shù)進(jìn)行T檢驗(yàn)分析。結(jié)果表明，煙草種植后的微生物豐度均高于煙草種植前（見(jiàn)表2）。

2.2.2" 對(duì)土壤微生物α多樣性的影響

物種多樣性是反映群落結(jié)構(gòu)和功能特征較有效的指標(biāo)，是生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的量度指標(biāo)。對(duì)煙草種植前后試驗(yàn)組和對(duì)照組處理樣本的細(xì)菌、真菌進(jìn)行α多樣性分析，結(jié)果見(jiàn)表3?？梢钥闯?，煙草種植前后試驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)菌多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)、豐富度指數(shù)）均無(wú)顯著性差異；煙草種植前試驗(yàn)組土壤真菌辛普森指數(shù)、豐富度指數(shù)顯著低于對(duì)照組，香農(nóng)指數(shù)無(wú)顯著差異，植煙根際土壤真菌α多樣性指數(shù)無(wú)顯著性差異。

2.2.3" 對(duì)土壤微生物群落組成的影響

在門水平下的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門一共有8個(gè)（相對(duì)豐度大于1%），其中B0、B2、C3處理有7個(gè)，C0處理有8個(gè)（圖1-A，見(jiàn)封三）。其中，假單胞菌門（Pseudomonadota）和放線菌門（Actinomycetota）是相對(duì)豐度最大的優(yōu)勢(shì)菌門，總相對(duì)豐度大于80%。與對(duì)照組相比，假單胞菌門經(jīng)過(guò)綠肥翻壓后相對(duì)豐度增加了0.44%，放線菌門相對(duì)豐度減少了1.43%；植煙種植后根際土壤中，假單胞菌門相對(duì)豐度增加了2.84%，放線菌門相對(duì)豐度減少了0.65%。其次是酸桿菌門（Acidobacteriota，2.01%～2.77%）、浮霉菌門（Planctomycetota，2.03%～2.49%）、擬桿菌門（Bacteroidota，1.96%～2.71%）、芽孢桿菌門（Bacillota，1.94%～2.83%）、粘菌門（Myxococcota，1.52%～1.79%）、疣微菌門（Cyanobacteriota，0.81%～1.06%）。在門水平下的真菌優(yōu)勢(shì)門一共有4個(gè)，其中B0、B2和C3處理有3個(gè)，C0處理有4個(gè)（圖1-B，見(jiàn)封三）。與對(duì)照組相比，子囊菌門（Ascomycota，73.90%～80.22%）、毛霉門（Mucoromycota，2.62%～4.58%）和壺菌門（Chytridiomycota，0.85%～1.48%）相對(duì)豐度分別減少了0.27%、0.73%、0.08%；擔(dān)子菌門（Basidiomycota，15.82%～20.22%）增加了1.05%。煙草種植后根際土壤中，子囊菌門相對(duì)豐度增加了6.32%，毛霉門、壺菌門和擔(dān)子菌門分別減少了3.69%、1.95%和0.55%。

在物種水平上使用LEfSe條形圖主要展示具有顯著性差異（|LDA score|＞2.0）物種的LDA score分布，結(jié)果表明：在煙草種植前，細(xì)菌物種熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens、擬孢囊菌屬Kibdelosporangium sp、Kibdelosporangium phytohabitans、茄科雷爾氏菌Ralstonia solanacearum、亞蘇伯氏腸桿菌Enterobacter asburiae、Hypericibacter terrae、嗜熱水解單胞菌Enhydrobacter sp，真菌物種紫杉假伏革菌Purpureocillium takamizusanense、擬絲孢酵母Pseudozyma flocculosa、絲核菌屬Rhizoctonia sp、果生炭疽菌Colletotrichum fructicola、新殼梭孢菌Neofusicoccum parvum、桔綠木霉Trichoderma citrinoviride、絲軸黑粉菌Sporisorium reilianum、申克氏孢子絲菌Sporothrix schenckii、變色栓菌Trametes versicolor、稻瘟病菌Pyricularia grisea在試驗(yàn)組中顯著富集（圖2A-B，見(jiàn)封三）。

在植煙根際土壤中，細(xì)菌物種食酸戴爾福特菌Delftia acidovorans、慢生根瘤菌屬M(fèi)esorhizobium sp、Gemmatirosa kalamazoonensis、類諾卡氏菌屬Nocardioides sp、德沃斯氏菌屬Devosia sp、水棲菌屬Enhydrobacter sp、貪噬菌屬Variovorax sp、Streptomyces thermocarboxydus、嗜熱一氧化碳鏈霉菌Mycolicibacterium gilvum；真菌物種擴(kuò)散炭層菌Nemania diffusa、足馬杜拉分枝菌Madurella mycetomatis、Botrytis fragariae、灰霉菌Botrytis porri、晶粒小鬼傘Coprinellus micaceus在試驗(yàn)組中顯著富集（圖2C-D，見(jiàn)封三）。

2.2.4" 對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

分別對(duì)煙草種植前后根際土壤細(xì)菌、真菌在種（species）水平上進(jìn)行主成分分析（PCoA）。結(jié)果表明，煙草種植前后試驗(yàn)組和對(duì)照組處理的土壤細(xì)菌和真菌在種水平上具有顯著差異。在煙草種植前，第一主成分（PCoA1）和第二主成分（PCoA2）在細(xì)菌中的解釋量分別為44.41%、31.98%，在真菌中的解釋量分別為39.36%、35.59%；在植煙根際土壤中，第一主成分（PCoA1）和第二主成分（PCoA2）分別解釋了45.77%、20.91%的細(xì)菌變異和95.84%、1.82%的真菌變異（見(jiàn)圖3，見(jiàn)封三）。

2.2.5" 不同處理的KEGG代謝通路分析

KEGG功能分析結(jié)果表明：根際微生物群落的功能在油菜翻壓后的根際土壤中發(fā)生顯著變化（p＜0.05），如圖4所示。在煙草種植前的土壤中，試驗(yàn)組B2處理并未富集代謝通路，煙草種植后根際土壤中試驗(yàn)組C3處理中顯著富集了8個(gè)代謝通路。在植煙根際土壤中，與對(duì)照組相比，ko05204、ko05200、ko03020、ko03018、ko01524、ko00480、ko02010和ko03010通路在試驗(yàn)組C3處理中顯著富集，其中ko00480屬于代謝，ko03010、ko03020和ko03018屬于遺傳信息處理，ko02010屬于環(huán)境信息處理，ko05204、ko5200和ko01524屬于人類疾病。

3" 討論與結(jié)論

烤煙是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，長(zhǎng)期連作造成土壤養(yǎng)分失調(diào)、土壤生物化學(xué)過(guò)程受阻、土壤有害物質(zhì)逐年積累導(dǎo)致烤煙生長(zhǎng)受抑制、煙葉產(chǎn)量品質(zhì)降低等問(wèn)題[17]。因此，選擇一種高效綠肥進(jìn)行輪作不僅能改善作物品質(zhì)，還能解決植煙的連作問(wèn)題。本研究中，油菜翻壓試驗(yàn)組的煙草株高、莖圍、葉面積均顯著高于對(duì)照組，分別增加了10.35%、1.68%、1.96%（p＜0.05），表明油菜翻壓能提高煙葉植株性狀來(lái)提高煙葉質(zhì)量，與李尚軍等[4]使用綠肥替代化肥能夠提高煙葉質(zhì)量的結(jié)果一致。也有研究表明不同耕作深度翻壓綠肥后，能夠明顯提升煙株抗病性及產(chǎn)量，顯著提升初烤煙質(zhì)量[18]。

土壤中功能微生物的數(shù)量可以作為直接衡量土壤營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化和抗病能力的指標(biāo)[19]。李伶俐等研究發(fā)現(xiàn)綠肥翻壓有利于增加土壤細(xì)菌數(shù)量，其原因可能與綠肥翻壓導(dǎo)致植煙土壤中有機(jī)碳和氮源增加，從而促進(jìn)土壤細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖有關(guān)[20]。本研究中，試驗(yàn)組微生物豐度均高于同時(shí)期對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異，表明油菜翻壓對(duì)土壤微生物的α多樣性影響較小，該結(jié)果與林葉春等研究發(fā)現(xiàn)綠肥壓青后土壤多樣性指數(shù)較無(wú)綠肥對(duì)照有所降低[10]的結(jié)果不一致，可能與土壤類型有關(guān)，具體原因仍需進(jìn)一步研究。土壤細(xì)菌廣泛參與到土壤養(yǎng)分循環(huán)的各個(gè)環(huán)節(jié)，其數(shù)量變化和群落結(jié)構(gòu)失衡必將引起土壤微生物功能失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致土壤養(yǎng)分和肥力的改變。本研究中，與對(duì)照組相比，油菜翻壓組煙株根際土壤中假單胞菌門相對(duì)豐度增加了2.84%，放線菌門相對(duì)豐度減少了0.65%；子囊菌門相對(duì)豐度增加了6.32%，毛霉門相對(duì)豐度減少了3.69%。此外，油菜翻壓后植煙根際土壤中放線菌門（Actinomycetota）相對(duì)豐度有一定程度的降低，該結(jié)果與祖韋軍等[21]的研究結(jié)果相反，可能是源于作物土壤類型差異。PCoA分析結(jié)果表明，不同處理間微生物群落具有顯著差異，表明油菜翻壓可能改變了根際土壤中有益菌的豐度，改善了微生物種群結(jié)構(gòu)。

本研究通過(guò)KEGG分析對(duì)煙草種植前后代謝通路進(jìn)行分析，在煙草種植前的土壤中，試驗(yàn)組處理中并未富集代謝通路，在煙草種植后根際土壤中試驗(yàn)組處理中顯著富集了8個(gè)代謝通路。在煙草根際土壤中，與對(duì)照組相比，ko05204、ko05200、ko03020、ko03018、ko01524、ko00480、ko02010和ko03010通路在試驗(yàn)組處理中顯著富集，根際土壤微生物的功能也發(fā)生了顯著轉(zhuǎn)變，富集的微生物主要參與遺傳信息處理、代謝、人類疾病、環(huán)境信息處理過(guò)程，主要集中在遺傳信息處理和人類疾病過(guò)程，表明作物種植后改變了微生物群落的功能，油菜翻壓過(guò)程主要干擾遺傳信息處理和人類疾病過(guò)程。該結(jié)果將為農(nóng)業(yè)上綠肥翻壓后根際微生物菌群研究提供一些指導(dǎo)。綜上所述，油菜綠肥翻壓改變了微生物的種群豐度和功能，促進(jìn)了植煙有效葉的生長(zhǎng)，改善了煙葉品質(zhì)。但植煙根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、功能與烤煙產(chǎn)量、質(zhì)量的相互關(guān)系較復(fù)雜，尚有待進(jìn)一步探究。

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（責(zé)任編輯：易" 婧）

收稿日期：2024-02-22

基金項(xiàng)目：重慶市煙草專賣局青托人才項(xiàng)目（B20222NY1307）。

作者簡(jiǎn)介：徐航（1989—），碩士，農(nóng)藝師，主要從事土壤肥料及煙草育種研究。E-mail：364494342@qq.com。

*為通信作者，E-mail：35947885@qq.com。