摘要：［目的］高粱通常生長于干旱環(huán)境，芽苗期時常發(fā)生干旱。通過探索外源褪黑素對干旱脅迫下高粱種子芽苗發(fā)芽率與生理代謝的影響，解析高粱抗旱調(diào)節(jié)的生理調(diào)節(jié)途徑和關鍵路徑，可為解決高粱芽苗期種子抗旱萌發(fā)受阻、形態(tài)建成困難的生產(chǎn)難題提供思路和技術支撐。［方法］以高粱品種‘遼糯11’為試驗材料，通過15%PEG模擬干旱脅迫條件，分別設置0、60、120、180、240和300μmol·L-1濃度的褪黑素浸種（對應的簡稱分別為T-0、T-60、T-120、T-180、T-240和T-300），探究干旱脅迫下外源褪黑素對高粱種子萌發(fā)的影響，選取發(fā)芽率最高的濃度與對照組T-0進行代謝組學分析。［結果］干旱脅迫下，施用褪黑素提高了高粱種子發(fā)芽率。其中T-180高粱種子發(fā)芽率最高為75.3%，顯著高于其它處理，比T-0增加了77.18%，為褪黑素最佳施用濃度。選取T-180和T-0進行代謝組學分析，2個處理共富集到15條關鍵代謝途徑，分別為嘌呤代謝、色氨酸代謝、嘧啶代謝、氮代謝、精氨酸生物合成、二苯乙烯-二芳基庚烷和姜辣素的生物合成、丙氨酸-天門冬氨酸-谷氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、玉米素生物合成、氨酰生物合成、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、異喹啉生物堿的生物合成、氨基酸的生物合成、ABC轉運蛋白（ATP-bindingcas?settetransporter，ABCtransporter）和次生代謝產(chǎn)物的生物合成。［結論］綜合分析發(fā)現(xiàn)，T-180為褪黑素最佳施用濃度，對高粱芽苗施用外源褪黑素后，15條關鍵代謝途徑中嘌呤代謝、色氨酸代謝2個代謝途徑變化活躍，是參與抗旱調(diào)節(jié)的關鍵代謝途徑。

關鍵詞：高粱；干旱逆境；外源褪黑素；代謝組學分析；代謝通路

高粱作為C4作物，其具有抗旱、耐鹽堿、耐瘠薄等多重抗性，在干旱、半干旱區(qū)邊際土地利用和種植業(yè)結構調(diào)整中發(fā)揮著不可替代的關鍵作用［1］。盡管高粱是抗旱性較強的作物，但由于其經(jīng)常處于干旱的環(huán)境中，導致高粱季節(jié)性干旱和間歇式干旱時常發(fā)生，尤其是在芽苗期，造成高粱種子萌發(fā)受阻、芽苗形態(tài)建成困難，芽苗期干旱已成為限制高粱抗旱生長的最重要的非生物脅迫因素［2-3］。

褪黑素（化學名稱為N-乙酰-5-甲氧基色胺）作為一類重要的吲哚類激素物質，在植物種子萌發(fā)、幼苗生長、細胞發(fā)育與代謝方面等過程中起重要的調(diào)控作用，具有效率高、低毒性的特點，大量研究表明，隨著我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的實施，褪黑素等植物生長調(diào)節(jié)物質在農(nóng)業(yè)上的廣泛應用，將成為解決我國作物種子抗旱萌發(fā)和幼苗形態(tài)建成障礙的重要手段［4-6］。曾有報道褪黑素處理在植物種子萌發(fā)、幼苗生長、根系和莖葉形態(tài)建成等過程中發(fā)揮著重要作用，其可提升種子萌發(fā)能力、改善生長發(fā)育進程，進而提高植物對逆境的抵御能力［7-9］。研究表明植物種子在外源褪黑素處理后，干、鮮重都得到明顯提高，種子營養(yǎng)物質積累也有所增加，提升了植物萌發(fā)所需的營養(yǎng)物質供給，進而提高了種子發(fā)芽率和成苗率［10-11］。此外，學者們還發(fā)現(xiàn)，褪黑素能夠有效緩解干旱脅迫對植物造成的傷害［3，12-14］。然而，目前外源褪黑素對高粱芽苗抗旱的影響鮮有報道。

本研究通過探索不同濃度外源褪黑素對干旱脅迫下高粱種子萌發(fā)的影響，并解析外源褪黑素抗旱調(diào)節(jié)的關鍵生物學代謝途徑和調(diào)控機理，為高粱芽苗期外源褪黑素施用提供科學依據(jù)，同時為高粱的抗旱生產(chǎn)提供新型技術手段。對緩解高粱芽苗期干旱脅迫傷害、豐富高粱種子抗旱途徑及助力高粱抗旱生產(chǎn)都具有重要意義。

1材料與方法

1.1 試驗設計

本研究以高粱品種‘遼糯11’為材料，采用15%PEG模擬干旱脅迫，試驗采取完全隨機設計，3次重復。采用直徑10cm培養(yǎng)皿作為試驗器材，每個培養(yǎng)皿放置15%PEG15mL。之后將籽粒飽滿、大小均勻、采用次氯酸鈉（5%濃度）消毒15min并用蒸餾水沖洗后晾干的高粱種子放于底部鋪好濾紙的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放置高粱種子30粒并作好處理標記。設置6個褪黑素處理，分別為0、60、120、180、240和300μmol·L-1，以下分別簡稱T-0、T-60、T-120、T-180、T-240和T-300，以蒸餾水為對照。將擺放好種子的培養(yǎng)皿置于RXZ-1000B型人工氣候箱進行種子控溫萌發(fā)培養(yǎng)，設晝夜溫度25℃/20℃，光照強度1500mmol·m?2·s?1，光照/黑暗為12∶12，濕度為50%，培養(yǎng)20d，每2d補充1次蒸餾水。

1.2 種子發(fā)芽率測定

培養(yǎng)第7d，調(diào)查發(fā)芽率，發(fā)芽率=第7d的發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

1.3 生理代謝途徑分析

在15%PEG模擬干旱脅迫第20d，選取通過發(fā)芽率得出的最佳外源褪黑素處理（T-180）和對照（T-0）2個處理取樣，提取RNA，進行非靶基因生理代謝組測序。開展代謝組學研究（LC-MS/MS技術），利用QExactive高分辨率質譜儀，進行正、負離子模式下數(shù)據(jù)采集，進而提高代謝物的覆蓋度。應用CompoundDiscoverer3.1軟件進行LC-MS/MS數(shù)據(jù)分析處理。使用生理代謝組學R軟件包metaX及代謝組信息分析流程進行數(shù)據(jù)預處理，通過生物學統(tǒng)計分析、代謝物分類注釋和功能注釋解析數(shù)據(jù)。通過PCA（主成分分析）降維多變量數(shù)據(jù)，分析變量的分組、趨勢及離群值。

1.3.1 高粱樣品的BPC光譜

基峰色譜圖（BasePeakChromatogram，BPC）采用Xcalibur4.3軟件進行測定，選擇每個時間點最強的離子強度連續(xù)描繪得到的圖譜，圖中包含了離子強度以及離子在色譜中的保留時間。

1.3.2 代謝物的分類和功能注釋

對鑒定到的代謝物進行分類注釋和功能注釋，通過KEGG路徑數(shù)據(jù)庫進行功能注釋，確定參與的代謝物關鍵信號轉導和生理代謝途徑。

1.3.3 統(tǒng)計分析及差異代謝物的篩選

采用單變量分析和多元統(tǒng)計分析相結合的方式來篩選不同處理間差異代謝物。采用差異變化倍數(shù)分析和T檢驗進行單變量分析，采用PCA（主成分分析）進行多元統(tǒng)計分析。

1.3.4 差異代謝物分析

差異代謝物聚類分析：對數(shù)據(jù)進行z-score標準化和log2轉換處理，采用層次聚類算法，采用歐氏距離計算。通過KEGG數(shù)據(jù)庫分析差異代謝物，p-value小于0.05的代謝通路確定為顯著富集通路。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗采取完全隨機處理，發(fā)芽率統(tǒng)計共3次重復，生理代謝組數(shù)據(jù)取樣3次生物學重復。采用SPSS25軟件、Excel2010和DPSv7.50數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析系統(tǒng)作圖和數(shù)據(jù)分析。其中發(fā)芽率統(tǒng)計分析采用新復極差法，Plt;0.05為差異顯著。

2結果與分析

2.1 干旱脅迫下不同褪黑素處理后高粱種子發(fā)芽率

褪黑素對干旱逆境下高粱發(fā)芽率具有顯著的提升效應，同時褪黑素濃度對高粱發(fā)芽率的提升幅度有所不同（圖1）。隨著褪黑素濃度的增加，高粱發(fā)芽率呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢，發(fā)芽率表現(xiàn)為T-180gt;T-120gt;T-300gt;T-240gt;T-60gt;T-0（對照），其中T-180處理發(fā)芽率最高，可達75.3%，是對照的1.79倍。說明褪黑素對干旱逆境下高粱的發(fā)芽具有很好的調(diào)節(jié)能力，可促進干旱逆境高粱種子的發(fā)芽，尤其是T-180處理，在提升種子發(fā)芽率方面效果顯著。

2.2 干旱脅迫下不同褪黑素處理后高粱芽苗表型

通過上述試驗結果發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下褪黑素T-180處理促進種子萌發(fā)效果最佳。因此，選取T-180處理連同對照（T-0）進行非靶基因生理代謝組分析（圖2），以進一步解析褪黑素促進芽苗生長的代謝機理。

2.2.1 外源褪黑素對干旱脅迫下高粱樣品的BPC光譜

對參與檢測的6個樣品（T-180和T-0的2個處理及3次重復）的化驗質量檢測結果表明，所有樣本BPC圖譜（樣品的色譜重疊、PCA、峰數(shù)、峰響應強度差異、重復間相關差異）均符合檢測標準，數(shù)據(jù)分布均勻，同一樣品3次處理重復性高，分布均勻，可達到生理代謝組分析要求（圖3～圖5）。

2.2.2 非靶基因生理代謝相關參數(shù)

在15%PEG模擬干旱脅迫下，對外源褪黑素處理（T-180）與對照（T-0）2組非靶基因生理代謝組數(shù)據(jù)進行檢測分析，檢測到171個代謝（metabo?lite），其上調(diào)（63個）和下調(diào)（108個）分布結果如圖6所示。說明外源褪黑素對高粱的代謝過程具有影響，干旱脅迫下施用外源褪黑素可調(diào)節(jié)高粱的代謝路徑。

2.2.3 代謝物的分類與功能注釋

從圖7可以看出，在干旱脅迫下施用外源褪黑素（T-180）和對照（T-0）2個樣品代謝產(chǎn)物及代謝路徑存在差異。T-180vsT-0代謝物主要分為4類，分別為生物學化合物（Compoundswithbiologi?calroles）、脂類化合物（Lipids）、其它（Others）和植物化合物（Phytochemicalcompounds）。其中藥物（Drugs）、黃酮類（Flavonoids）、萜類（Terpenoids）、苯丙素類（Phenylpropanoids）、內(nèi)源性代謝產(chǎn)物（EndogenousMetabolites）、脂肪酰基［FA］（Fattyacyls［FA］）、聚酮類［PK］（Polyketides［PK］）、氨基酸（Aminoacids）、苯及其衍生物（Benzeneandde?rivatives）、氨基酸（Aminoacids）、肽與類似物（pep?tidesandanalogues）、碳水化合物（Organicacids）、有機酸（Carbohydrates）等代謝物變化數(shù)量較多。脂肪酰基［FA］（Fattyacyls［FA］）最高，為17個，藥物（Drugs）次之，為15個，說明這2個代謝在干旱逆境下施用褪黑素后變化活躍，是抗旱調(diào)節(jié)的關鍵生理過程。

2.2.4 差異代謝物代謝途徑富集分析

通過KEGG數(shù)據(jù)庫對T-180和T-0處理下的差異代謝途徑富集情況進行分析，Plt;0.05的代謝途徑為差異代謝物富集顯著的代謝途徑。分析發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下2種褪黑素處理的高粱在代謝通路上存在明顯差異。干旱脅迫下，T-180和T-0處理相比富集到15條關鍵代謝途徑，分別為嘌呤代謝（Purinemetabolism）、色氨酸代謝（Tryptophanme?tabolism）、嘧啶代謝（Pyrimidinemetabolism）、氮代謝（Nitrogenmetabolism）、精氨酸生物合成（Argi?ninebiosynthesis）、二苯乙烯-二芳基庚烷和姜辣素的生物合成（Glutathionemetabolism）、丙氨酸-天門冬氨酸-谷氨酸代謝（Alanine，aspartateandglutamatemetabolism）等（圖8）。其中，嘌呤代謝（Purinemetabolism）、色氨酸代謝（Tryptophanme?tabolism）2個代謝途徑代謝物數(shù)量較多，分別為95個和82個（表1）。說明這2個代謝為干旱脅迫下施用褪黑素的關鍵調(diào)節(jié)代謝通路。

3討論

干旱是影響作物種子萌發(fā)最為關鍵的非生物逆境因子之一，干旱會影響種子吸脹，減緩種子內(nèi)部生理活動過程，進而影響種子萌發(fā)能力［15-16］。本研究通過外源褪黑素處理手段嘗試提升干旱脅迫下高粱的發(fā)芽能力，結果發(fā)現(xiàn)外源施用褪黑素可有效提升高粱的發(fā)芽率，但不同褪黑素濃度間存在差異，隨著褪黑素濃度的增加，高粱發(fā)芽率呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢，180μmol·L-1濃度下對發(fā)芽率提升幅度最大。此研究結果與杜卓等［17］的研究結果相似，但與秦彬等［18］研究提出的500μmol·L-1褪黑素浸種處理對大豆種子萌發(fā)過程中干旱脅迫的緩解效果最佳存在差異，可能與作物種類差異或種子籽粒大小有關，因此在研究褪黑素提升作物發(fā)芽率方面，要從作物種類、生長環(huán)境和生產(chǎn)方式等多個角度綜合考慮。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下施用外源褪黑素后，高粱在代謝通路上存在明顯差異，從富集到的15個關鍵代謝途徑，發(fā)現(xiàn)嘌呤代謝、色氨酸代謝2個代謝途徑變化活躍，是參與抗旱調(diào)節(jié)的關鍵代謝途徑。此類研究在高粱研究中前人報道相對較少，張瑞棟等［3］研究提出外源褪黑素會對干旱逆境下高粱芽苗代謝過程產(chǎn)生影響，通過調(diào)節(jié)代謝過程可減緩干旱損傷，該結果與本研究結論基本吻合；曹亮等［19］對大豆干旱逆境下施用褪黑素的研究結果表明，施用褪黑素后半胱氨酸合成、光合作用、碳水化合物代謝和葡萄糖代謝等途徑在抗旱調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，可促進干旱脅迫下β-葡萄糖苷酶基因表達，提高了L-天冬酰胺和6-磷酸葡萄糖代謝物的含量，最終提高大豆的抗旱性，該研究發(fā)現(xiàn)的代謝途徑與本研究存在差異，可能與作物種類差異有關。

褪黑素作為干旱調(diào)節(jié)物質在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中越來越受到人們的關注。王艷秋等［20］研究發(fā)現(xiàn)抗旱型高粱開花前期和后期應對水分虧缺的生理調(diào)節(jié)存在差異，并提出外援物質可提升高粱的抗旱性；鄒京南等［21］研究表明施褪黑素能緩解干旱脅迫對植株生長造成的損傷，在大豆生產(chǎn)中使用可提高其碳氮同化能力，增加干旱逆境下大豆的產(chǎn)量；姜瑛等［22］研究認為噴施外源褪黑素對玉米幼苗抗旱性的效果，外源噴施50μmol·L-1褪黑素有效提高了地上部光合能力，提升了玉米的抗旱性。隨著生物技術的不斷發(fā)展，從生理代謝組學、轉錄組學、蛋白組學、基因挖掘等方面對褪黑素的調(diào)節(jié)機理研究將越來越多，還有待于我們進一步深入研究，褪黑素在作物抗旱栽培中也將發(fā)揮重要作用。

4結論

綜上所述，干旱脅迫下施用褪黑素后，高粱種子發(fā)芽率得到顯著改善，各濃度中180μmol·L-1處理種子發(fā)芽率最高，對干旱逆境下高粱的發(fā)芽具有更好的調(diào)節(jié)能力。對照組與處理組進行生理代謝分析，共富集到15條關鍵代謝途徑，其中嘌呤代謝、色氨酸代謝2個代謝途徑代謝物數(shù)量較多，為干旱脅迫下施用褪黑素的關鍵調(diào)節(jié)代謝通路。