關(guān)鍵詞：泡桐花；響應(yīng)面法；超聲輔助提??；粗多糖；抗氧化活性

泡桐（Paulowniafortunei）廣泛分布于我國華東、西南、中南等地區(qū)，生長于海拔1200m以下的山地、丘陵、平原等地帶。泡桐葉、果實和花均可入藥［1］。我國泡桐花資源豐富，極具開發(fā)潛力。研究表明，泡桐花含有多種生物活性物質(zhì)，包括多糖、黃酮、生物堿、酚類等［2］。多糖是一種由糖苷鍵連接而成的一種高分子化合物，廣泛存在于植物、動物和微生物中［3］。植物多糖通常為貯藏碳水化物或植物細(xì)胞壁構(gòu)成成分。種子、果實、葉子、花等均可作為植物多糖的來源［4］。研究表明植物多糖具有顯著的生物活性功能，如抗病毒、抗氧化、增強免疫等功效［5］。

目前提取植物多糖的常規(guī)方法是溶劑提取法和酶解法。這2種方法提取時間長，溶劑消耗量大，并且需要多次提取達(dá)到高回收率，不利于泡桐花多糖的利用。呂婷婷等［6］通過回流水提法提取泡桐花多糖，提取率僅為2.65%。因此，有必要尋找高效率提取泡桐花多糖的方法。

超聲波輔助提取法是極具潛力的生物活性物質(zhì)提取方式，具有效率高、設(shè)備要求低等特點。超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)能夠破碎植物細(xì)胞，增強溶質(zhì)向溶劑中擴散，從而提高目標(biāo)物質(zhì)的提取率。目前超聲波輔助提取已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于植物中蛋白質(zhì)、黃酮、多酚等生物活性成分的提取，然而未見有關(guān)于超聲波輔助提取泡桐花中多糖的報道。本研究通過響應(yīng)面法確定了超聲波輔助提取泡桐花粗多糖的最佳工藝，并測定泡桐花粗多糖的抗氧化活性，旨在為泡桐花資源深度利用提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

泡桐花收集于陜西省楊凌區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)（29°35'45\"N，108°4'22\"E）。三氯甲烷、正丁醇、石油醚、乙醇、苯酚、硫酸、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、Tris、鹽酸、鄰苯三酚、維生素C（VC）、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH）等試劑，均購自阿拉丁化學(xué)有限公司。

1.2 主要儀器

KQ-400DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計，上海精若科學(xué)儀器有限公司；QYRE-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海秋佐科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 泡桐花提取工藝和單因素試驗

泡桐花經(jīng)自然干燥，粉碎后過篩。經(jīng)過石油醚回流脫脂。自然干燥后使用超聲波輔助提取泡桐花多糖，選擇料液比、提取功率、提取時間和提取溫度作為影響因素，以泡桐花多糖提取率為指標(biāo)研究單一因素對粗多糖提取率的影響。默認(rèn)提取條件為料液比35mL·g-1，提取功率450W，提取時間90min，提取溫度65℃。

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

選取料液比（A）、提取功率（B）、提取時間（C）和提取溫度（D）為自變量，以粗多糖得率為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert12軟件設(shè)計4因素3水平共29個試驗（表1）。

1.4 試驗方法

1.4.1 泡桐花多糖的純化

通過Sevage法［8］去除提取液中的蛋白。向50mL粗多糖溶液加入25mLSevage溶液（三氯甲烷∶正丁醇=5∶1），混合震蕩30min，5000r·min-1離心5min后取水相，重復(fù)萃取2次后，合并水相。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后加入95%乙醇。4℃過夜后離心獲得多糖沉淀。冷凍干燥后待測。

1.4.2 泡桐花粗多糖含量和提取率的測定

采用苯酚-硫酸法，使用葡萄糖溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=0.0142x?0.4256，R2=0.9985。測定泡桐花粗多糖溶液在490nm處的吸光值，通過線性回歸方程計算泡桐花粗多糖含量。得率計算公式如下：

式中X為粗多糖質(zhì)量濃度；V為溶液定容后體積；m為泡桐花樣品質(zhì)量。

1.4.3 DPPH自由基清除能力測定

參考陸杰等［9］的方法。配置0.1、0.5、1、2.5mg·mL-1的泡桐花粗多糖組溶液。取2mL樣品溶液與2mL0.2mmol·L-1DPPH-乙醇溶液。搖勻，37℃避光反應(yīng)30min，使用酶標(biāo)儀測定樣品溶液在517nm下的吸光度。以抗壞血酸（VC）作為陽性對照。DPPH清除率計算公式如下：

式中A0為2mLDPPH-乙醇與2mL無水乙醇混合溶液的吸光值；A1為2mL樣品與2mL無水乙醇混合溶液的吸光值；A2為2mL樣品與2mLDPPH-乙醇混合溶液的吸光值。

1.4.4 羥基自由基清除率測定

采用鄰二氮菲-Fe2+法測定泡桐花總多糖的羥基自由基清除率。取0.5mL不同濃度樣液（0.1、0.5、1、2.5mg·mL-1），加入0.5mL10mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液、0.5mL10mmol·L-1FeSO4溶液、3.5mL蒸餾水。再加入5mL100mmol·L-1H2O2啟動反應(yīng)，混勻充分反應(yīng)后于510nm處測定吸光度，計算清除率：羥基自由基清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%

式中A0為蒸餾水代替樣品液作為空白對照時的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度；A2為用蒸餾水代替H2O2時樣品溶液的吸光度。

1.4.5 超氧自由基清除率測定

參考張明珠等［10］的方法并稍作修改。取0.2mL0.1、0.5、1、2.5mg·mL-1的泡桐花粗多糖溶液加入試管中，加入0.2mLTris-HCl緩沖液（pH值為8.2）。將7mmol·L-1的鄰苯三酚溶液在25℃下預(yù)熱后加入試管?；旌弦簻?zhǔn)確反應(yīng)10min后加入0.1mL10mmol·L-1HCl終止反應(yīng)。靜置15min后再320nm處測定吸光值。超氧自由基清除率計算公式如下：

超氧自由基清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%

式中A0為蒸餾水代替樣品液作空白對照時的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度；A2為用蒸餾水代替鄰苯三酚時樣品溶液的吸光度。

1.5 統(tǒng)計分析

使用SPSS21進(jìn)行單因素方差分析，使用Ori?gin2018繪制圖表，使用Design-Expert12設(shè)計軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2結(jié)果與分析

2.1 不同因素對泡桐花多糖提取率的影響

2.1.1 液料比對泡桐花粗多糖提取率的影響

當(dāng)提取功率450W、提取時間90min、提取溫度65℃時，不同料液比對提取率影響如圖1a所示。泡桐花粗多糖提取率隨料液比升高呈先增后減的趨勢，當(dāng)料液比為35mL·g-1時提取率達(dá)到最大值2.86%。

2.1.2 超聲功率對泡桐花粗多糖提取率的影響

圖1b表明，當(dāng)料液比35mL·g-1、提取時間90min、提取溫度65℃時，持續(xù)增加超聲功率會導(dǎo)致泡桐花粗多糖得率出現(xiàn)先增后減的變化。當(dāng)超聲功率為500W時提取率達(dá)到最大值2.85%。

2.1.3 提取時間對泡桐花粗多糖提取率的影響

當(dāng)料液比35mL·g-1、提取功率450W、提取溫度65℃時，不同提取時間對提取率影響如圖1c所示。泡桐花粗多糖提取率隨提取時間增加呈先增后減的趨勢。當(dāng)提取時間為90min時提取率達(dá)到最大值2.48%。

2.1.4 提取溫度對泡桐花粗多糖提取率的影響

當(dāng)料液比35mL·g-1，提取功率450W，提取時間90min時，不同提取時間對提取率影響如圖1d所示。泡桐花粗多糖提取率隨提取溫度增加呈先增后減的趨勢。當(dāng)提取溫度為75℃時提取率達(dá)到最大值2.77%。

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 方案設(shè)計

通過單因素試驗結(jié)果可以確定響應(yīng)面分析中各因素的合適水平范圍。Box-Behnken設(shè)計試驗因素及水平見表1，響應(yīng)面試驗結(jié)果如表2。

2.2.2 回歸模型有效性及顯著性分析

響應(yīng)面試驗結(jié)果如圖2所示，通過designex?pert12軟件對進(jìn)行分析，最終獲得回歸方程Y=3.18+0.1307A?0.0003B?0.0063C+0.2127D+0.0363AB+0.019AC?0.0497AD?0.0162BC+0.0268BD?0.0323CD?0.2717A2?0.2163B2+0.0018C2?0.3008D2?；貧w方程顯著性檢驗與方差分析結(jié)果表明（表3），模型P值lt;0.0001，表明模型有統(tǒng)計顯著性。失擬項P值不顯著，表明模型有效。R2=0.9813，模型能夠解釋98.13%的響應(yīng)值變化。表明模型與實驗結(jié)果擬合度較好。根據(jù)F值大小可以判斷不同因素對泡桐花粗多糖提取率的影響大小順序為溫度gt;料液比gt;提取功率gt;提取時間。

2.2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

泡桐花粗多糖提取率與不同因素的3D響應(yīng)面圖如圖2所示。響應(yīng)面圖的坡度反映不同因素對響應(yīng)值影響的大小。坡度越陡表明該因素對響應(yīng)值影響較大，反之則越小。等高線的形狀和疏密程度反應(yīng)了不同因素交互作用對響應(yīng)值影響的顯著程度。等高線聚集且呈橢圓形，則表明其交互作用對響應(yīng)值的影響顯著，若等高線分散且呈圓形則不顯著［11］。由圖2可見，不同因素之間的交互作用不顯著，這與方差分析結(jié)果一致。在優(yōu)化范圍內(nèi)，改變料液比、提取溫度、提取功率均可導(dǎo)致提取率發(fā)生變化。

2.2.4 驗證試驗

通過Design-Expert12軟件可得泡桐花粗多糖提取的最佳理論條件：料液比31.8mL·g-1、提取功率456.8W、提取時間61.3min、溫度74.3℃，模型預(yù)測提取率為3.241%?？紤]到可操作性，確定提取條件為：料液比31.8mL·g-1、提取時間62min、溫度74℃、提取功率456W，試驗測得泡桐花多糖提取率為3.213%。表明此模型在預(yù)測泡桐花粗多糖提取工藝時有較高的準(zhǔn)確性?？梢杂糜诟纳婆萃┗ǔ暡ㄝo助提取多糖工藝，促進(jìn)泡桐花資源利用。

2.3 泡桐花粗多糖抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除率

泡桐花粗多糖的DPPH自由基清除率如圖3a所示。泡桐花粗多糖的DPPH自由基清除能力隨濃度增加而增加。在濃度為2.5mg·mL-1使達(dá)到最大值21.41%。作為對照，維生素C的DPPH自由基清除率為80%左右。

2.3.2 羥基自由基清除率

泡桐花粗多糖的羥基自由基清除率如圖3b所示。泡桐花粗多糖的羥基自由基清除能力隨濃度增加而增加。在濃度為2.5mg·mL-1使達(dá)到最大值55.41%。作為對照，維生素C的羥基自由基清除率為80%左右。同時當(dāng)粗多糖濃度大于1mg·mL-1時，增加濃度并不能大幅度提高羥基自由基清除能力。

2.3.3 超氧自由基清除率

泡桐花粗多糖的超氧自由基清除率如圖3c所示。泡桐花粗多糖的超氧自由基清除能力隨濃度增加而增加。在濃度為2.5mg·mL-1時達(dá)到最大值64.52%。作為對照，維生素C的超氧自由基清除率為80%左右。同時當(dāng)粗多糖濃度大于1mg·mL-1時，增加濃度并不能大幅度提高超氧自由基清除能力。

3討論

3.1 超聲波輔助提取對泡桐花粗多糖的影響

超聲波提取技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用于各種生物活性成分的提取。在本研究中通過單因素試驗與Box-Behnken試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析法，優(yōu)化得到泡桐花粗多糖最佳提取條件為料液比31.8mL·g-1、提取時間62min、溫度74℃、提取功率456W，此時粗多糖提取率為3.213%。為利用泡桐花多糖資源提供一定理論基礎(chǔ)。

在單因素試驗中，適當(dāng)增大料液比能夠提升粗多糖的提取率，提取液體積增加降低了粗多糖在體系中的濃度，提高了粗多糖在濃度梯度作用下的擴散速度［12］，繼續(xù)增大料液比會導(dǎo)致提取率降低，可能是由于雜質(zhì)進(jìn)入溶液。同時高料液比會增加純化過程中能源與時間的消耗，因此需要避免使用高料液比提取多糖。增加超聲功率能夠提升水的循環(huán)率，增強提取過程中的傳質(zhì)能力，提高多糖在溶液中的溶解度［13］。但是當(dāng)超聲功率繼續(xù)增加時，多糖溶解度達(dá)到飽和，此時繼續(xù)增加超聲功率并不會繼續(xù)提高提取率，同時高強度的超聲波引起的劇烈微環(huán)境變化可能會導(dǎo)致多糖分子被破壞，導(dǎo)致多糖提取率降低［14］。延長提取時間能夠使多糖充分?jǐn)U散至溶液中，但是長時間提取并不會提高多糖在溶液中的溶解度。長時間的空化效應(yīng)可能會破壞多糖分子結(jié)構(gòu)，使提取率降低［15］。高溫使得分子運動加劇，有利于多糖從植物組織轉(zhuǎn)移到溶液中。然而長時間的高溫加熱可能會引起氧化降解，導(dǎo)致提取率降低［16］。同時有研究表明增加多頻超聲波相比本實驗采用的單頻超聲波可以產(chǎn)生更強的空化效應(yīng)，能夠從植物中提取更多的高價值組分［17］。Chen等［18］通過三頻和雙頻超聲波提取姜莖葉多糖后，得到抗氧化特性更強的小分子量多糖。表明超聲波輔助提取技術(shù)還有繼續(xù)深入挖掘的潛力。

3.2 泡桐花粗多糖的抗氧化活性

本研究所得泡桐花粗多糖，在0.1～2.5mg·mL-1濃度均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，泡桐花多糖抗氧化能力呈劑量依賴型。對DPPH自由基、羥基自由基和超氧自由基清除能力在2.5mg·mL-1達(dá)到最大值。自由基是人體內(nèi)氧化反應(yīng)的有害副產(chǎn)物，由于其具有較強的氧化能力，能夠?qū)?xì)胞產(chǎn)生損害，加速衰老過程，甚至導(dǎo)致慢性疾?。?9］。因此，適當(dāng)補充抗氧化劑有益于身體健康。開發(fā)利用具有抗氧化活性的生物資源具有一定現(xiàn)實意義。目前對于多糖抗氧化活性的作用機制有如下觀點：1）多糖分子能夠增強抗氧化酶活性；2）多糖分子能夠與自由基搶奪必需的金屬離子，如Cu2+、Fe2+等，減少自由基數(shù)量；3）多糖分子直接與自由基結(jié)合并清除自由基［20-21］。多糖的抗氧化活性與其分子量和分子中糖醛酸的含量相關(guān)。低分子量多糖中還原性較強的羥基能夠與自由基發(fā)生反應(yīng)，而高分子量多糖中分子內(nèi)氫鍵作用較強，限制羥基的形成，導(dǎo)致抗氧化活性較差。糖醛酸的親電酮或醛基使氫原子更活躍，易于從氫氧鍵中釋放出來與自由基反應(yīng)，因此高糖醛酸多糖能夠表現(xiàn)出更強的抗氧化活性［22］。為了提高多糖的抗氧化活性，可以進(jìn)行硫酸化，磷酸化和羧甲基化等化學(xué)修飾?；瘜W(xué)基團(tuán)提高了多糖表面的負(fù)電荷，導(dǎo)致分子鏈展開和分子間靜電排斥，使聚合物具有高水溶性。在負(fù)電荷的多糖的螯合特性共同作用下，導(dǎo)致抗氧化性能得到改善［23］。研究表明不同基團(tuán)的取代水平與多糖抗氧化活性呈正相關(guān)［24］。

目前，研究表明許多多糖都具有抗氧化作用，包括聚糖、果膠多糖、葡聚糖等。多糖的抗氧化作用高度依賴其溶解度、糖環(huán)結(jié)構(gòu)、分子量、電荷等因素。本研究所得粗多糖是由多種不同成分組成的混合物，后續(xù)研究應(yīng)對泡桐花粗多糖進(jìn)一步分離純化，研究多糖物質(zhì)的具體構(gòu)成并確定其結(jié)構(gòu)。為泡桐花多糖資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

4結(jié)論

經(jīng)Box-Behnken和響應(yīng)面分析得到泡桐花粗多糖最佳提取條件為31.8mL·g-1、提取時間62min、溫度74℃、提取功率456W，此時粗多糖提取率為3.213%。泡桐花粗多糖應(yīng)用超聲波輔助提取工藝可靠、簡便、成本低。泡桐花粗多糖表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，DPPH自由基、羥基自由基、超氧自由基均表現(xiàn)出一定的清除作用。但是泡桐花多糖的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)仍需進(jìn)一步研究。