關(guān)鍵詞：硫酸鋅；豬繁殖與呼吸綜合征病毒；抗病毒；槲皮素

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcineproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）是一種具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬。它可誘發(fā)豬繁殖與呼吸綜合征（Porcineproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS），引起妊娠母豬的繁殖障礙和育肥豬、保育豬和仔豬的呼吸道疾病，是嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的疫病之一［1-2］。生產(chǎn)中主要通過嚴(yán)格的消毒措施、抗炎抗菌藥物的使用和接種PRRSV疫苗控制PRRSV感染的發(fā)生［3］。目前，尚無有效的抗病毒藥物用于治療PRRSV的感染。鋅（Zinc，Zn）是生物體第二豐富的必需微量元素，在多種生理過程中發(fā)揮重要作用。人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)Zn具有抗病毒感染的作用。然而，在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域鮮見關(guān)于Zn抗病毒感染作用的研究。僅見動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的Zhang等［4］報(bào)告Zn具有抗豬流行性腹瀉病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）感染的作用。

Zn是生物體必需微量元素之一，它被證明對(duì)各種細(xì)胞酶和轉(zhuǎn)錄因子的正確折疊和活性至關(guān)重要［5］。Zn可能也是許多病毒蛋白的重要輔因子［5］。但是，研究表明：細(xì)胞中高濃度的Zn可以抑制多種RNA病毒的復(fù)制。Ghaffari等［6］和Tavakoli等［7］分別報(bào)道：在體外，納米氧化鋅可有效地抑制H1N1流感病毒（Influenzavirus，IFV）和單純皰疹病毒Ⅰ型（Herpessimplexvirustype1，HSV-1）的感染。Khan等［8］也證明：在體外，增補(bǔ)Zn能夠有效地抑制呼吸道合胞病毒（Respiratorysyncytialvirus，RSV）的感染。艾滋病毒（Humanimmunodefi?ciencyvirus，HIV）和丙型肝炎病毒（Hepatitiscvi?rus，HCV）等感染的臨床研究發(fā)現(xiàn)增補(bǔ)Zn可有效抑制組織中病毒的載量［9］。臨床研究表明：在新型冠狀病毒（2019NovelCoronavirus，COVID-19）感染病人治療中，增補(bǔ)ZnSO4能增加患者的治愈率、減少死亡率［10-11］。在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，Zhang等［4］報(bào)道：氧化鋅可有效抑制PEDV對(duì)仔豬的感染，發(fā)揮抗病毒的作用。其中，H1N1、RSV、HIV、HCV和COVID-19和PEDV均是RNA病毒，這意味著，在病毒感染中，細(xì)胞或者血液中高濃度的Zn可有效抑制RNA病毒的感染。

PRRSV屬于RNA病毒的一種，在細(xì)胞中增加Zn含量能否有效抑制PRRSV的感染，有待進(jìn)一步探討。鑒于此，本研究建立PRRSV感染Marc-145的細(xì)胞模型，研究ZnCl2和ZnSO4對(duì)PRRSV滴度的影響；明確細(xì)胞中添加不同濃度ZnSO4對(duì)Marc-145和PAMs細(xì)胞中PRRSV復(fù)制的作用；探究ZnSO4干擾PRRSV感染的生命周期階段。為進(jìn)一步明確Zn抗PRRSV感染的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。槲皮素（Quercetin，QR）是一種天然Zn2+載體，可提高Zn在細(xì)胞中的生物利用度。探究QR增強(qiáng)Zn抗PRRSV感染的作用，為進(jìn)一步將Zn和Zn2+載體QR聯(lián)合使用治療PRRSV感染提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Marc-145和PAMs細(xì)胞均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。Marc-145細(xì)胞用含有10%FBS和1%青霉素＼鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至約80%～90%時(shí)，用胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)后接種至25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長至約80%時(shí)，可用于后續(xù)試驗(yàn)。PAMs細(xì)胞用含有10%的FBS和1%的青霉素＼鏈霉素的1640細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 PRRSV的擴(kuò)增和感染

PRRSV原液由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。利用本文1.1節(jié)的方法培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞，待細(xì)胞長至約80%時(shí)，取5mLPRRSV懸液（原液經(jīng)10倍稀釋）接種于Marc-145細(xì)胞，培養(yǎng)2h。之后，棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，加入5mL含有2%FBS的高糖DMEM細(xì)胞維持培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)60h。當(dāng)大約80%～90%的細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)，收集細(xì)胞。將細(xì)胞置于?20℃和室溫之間反復(fù)凍融。然后，4℃、3000r·min-1下離心30min。收集上清，用0.22μm的微孔濾器過濾，分裝至無菌EP管內(nèi)，?80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒法（CellCountingKit-8，CCK-8）檢測細(xì)胞的活力

將Marc-145或PAMs細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（密度為每孔6×103），待長至約80%時(shí)，接種100TCID50·mL-1的PRRSV，37℃培養(yǎng)2h。之后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基上清，分別用含200、100、50、25、12.5、6.25和0μmol·L-1ZnSO4的2%FBS高糖DMEM細(xì)胞維持液培養(yǎng)48h，每個(gè)ZnSO4濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù)組。之后，避光加入10μL的CCK-8溶液，37℃培養(yǎng)30min后，用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞活力：細(xì)胞存活率=（試驗(yàn)組吸光度－空白組吸光度）/（細(xì)胞對(duì)照組吸光度－空白組吸光度）×100%。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR，qRT-PCR）檢測PRRSVN基因的拷貝數(shù)

將Marc-145細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（密度為每孔1×105），待長至約80%時(shí)，接種100TCID50·mL-1的PRRSV，37℃培養(yǎng)2h。棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基上清，分別用含100、50、12.5μmol·L-1ZnSO4的2%FBS高糖DMEM細(xì)胞維持液培養(yǎng)48h后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基，收集細(xì)胞。之后，用TRIzo（lTaKaRa，北京）提取細(xì)胞總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABM，上海）獲得cDNA。利用2×SYBRGreenqPCRMasterMix（Bimake，上海），通過qRT-PCR測定Marc-145細(xì)胞內(nèi)PRRSVN基因的拷貝數(shù)。PRRSVN基因上游引物為：5'-AGAAGCCCCATTTCCCTCTA-3'，下游引物為：5'-CGGATCAGACGCACAGTATG-3'。絕對(duì)定量檢測PRRSV載量時(shí)，將本實(shí)驗(yàn)室保存的PRRSVN基因重組質(zhì)粒10倍倍比稀釋8個(gè)梯度，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，加入PRRSVN基因上下游引物，進(jìn)行擴(kuò)增。其中，設(shè)置空白組和PRRSV對(duì)照組，試驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.5 Westernblot（WB）檢測PRRSV的表達(dá)

Marc-145細(xì)胞的培養(yǎng)和ZnSO4的處理與本文1.4節(jié)一致。處理完成后，用無菌細(xì)胞刮片刮下細(xì)胞，4000r·min-1離心5min，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次。將細(xì)胞裂解液（RIPA高效裂解液：蛋白磷酸酶抑制劑∶PMSF=100∶1∶1）加入細(xì)胞，劇烈振蕩15s后，超聲處理15min，置于冰上靜置40min，其中，每隔10min劇烈振蕩15s。之后4℃、12000r·min-1離心15min，收集上清。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒（BeyotimeBiotechnology，上海）測定上清中總蛋白濃度。

根據(jù)樣品中細(xì)胞總蛋白濃度，分別取30μg總蛋白，加入5×蛋白上樣緩沖液，95℃變性10min。利用12%的SDS-PAGE分離細(xì)胞中的蛋白。電泳結(jié)束后，根據(jù)蛋白Marker的指示，切下目的條帶。將目的條帶電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2h。加1∶10000稀釋的抗PRRSVN蛋白的單克隆抗體，4℃過夜。之后，用TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，37℃孵育1h。根據(jù)Meilunbio飛科特超敏ECL發(fā)光液（BOSTER，武漢）說明書，制備顯色工作液并顯色。采用Im?ageLab圖像獲取和分析軟件分析數(shù)據(jù)。

1.6 病毒滴度的測定

將Marc-145細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待長至80%時(shí)，接種100TCID50·mL-1的PRRSV，37℃培養(yǎng)2h。棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基上清，分別用含100、50、12.5μmol·L-1ZnSO4的2%FBS高糖DMEM細(xì)胞維持液培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融，收集上清，即為PRRSV原液。將PRRSV原液按1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000、1∶10000000、1∶100000000倍比稀釋，制備為10-1～10-8稀釋度的PRRSV懸液。然后，將Marc-145細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待長至單層時(shí)，每孔接種100μL稀釋度為10-1～10-8的PRRSV懸液。之后繼續(xù)培養(yǎng)，直至觀察到細(xì)胞病變，通過顯微鏡觀察，記錄病變細(xì)胞數(shù)量，按照Reed-Muench公式：TCID50=（高于50%病變率百分?jǐn)?shù)－50%）/（高于50%病變率百分?jǐn)?shù)－低于50%病變率百分?jǐn)?shù)）×稀釋對(duì)數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋倍數(shù)，計(jì)算樣品的病毒滴度。同時(shí)，設(shè)置空白組，試驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.7 PRRSV黏附和進(jìn)入的測定

將Marc-145細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（密度為每孔1×105），待長至80%時(shí)，分別用含100、50、12.5μmol·L-1ZnSO4的2%FBS高糖DMEM細(xì)胞維持液預(yù)處理Marc-145細(xì)胞24h。然后，將不同濃度ZnSO4處理24h的Marc-145細(xì)胞置于4℃預(yù)冷30min，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)上清，接種100TCID50·mL-1的PRRSV，分別置于4℃和37℃孵育2h，置于4℃用于評(píng)定PRRSV的黏附，置于37℃用于評(píng)定PRRSV的進(jìn)入［12］。

同時(shí)，設(shè)置ZnSO4和PRRSV共孵育處理組。將不同濃度ZnSO4和TCID50·mL-1的PRRSV在37℃共孵育2h，然后，用混合液處理4℃預(yù)冷30min的Marc-145細(xì)胞，分別置于4℃和37℃下處理2h。最后，分別用PBS洗去未結(jié)合的PRRSV病毒粒子，收集細(xì)胞。提取總RNA，通過qRT-PCR測定PRRSVN基因的載量。其中，設(shè)置空白組、無ZnSO4的緩沖液和PRRSV混合液的對(duì)照組，試驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.8 PRRSV釋放的測定

將Marc-145細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（密度為每孔1×105），待長至80%時(shí)，接種100TCID50·mL-1的PRRSV，37℃培養(yǎng)2h，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基上清，用PBS洗滌3次。然后，用含100μmol·L-1ZnSO4的2%FBS高糖DMEM細(xì)胞維持液分別培養(yǎng)6、8、10、12、16、20、24、36、48、60和72h，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液，提取上清中的總RNA，通過qRT-PCR測定PRRSVN基因的載量。其中，設(shè)置PRRSV對(duì)照組，試驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用GraphPadPrismsoftware8.0（GraphPadSoftware，Inc.California，USA）分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過單因素方差分析法分析各組之間的差異性，Plt;0.05為差異顯著，Plt;0.01、Plt;0.001和Plt;0.0001為差異極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1 ZnSO4對(duì)Marc-145和PAMs細(xì)胞的最大安全濃度

利用CCK-8法檢測ZnSO4對(duì)Marc-145（圖1A）和PAMs（圖1B）細(xì)胞活力的影響，由圖1A可見，PRRSV接種Marc-145細(xì)胞48h后，與對(duì)照組相比，200μmol·L-1ZnSO4處理組細(xì)胞活力呈極顯著性降低（Plt;0.0001），細(xì)胞存活率低于50%；100μmol·L-1ZnSO4處理組，細(xì)胞活力無顯著性差異，細(xì)胞存活率高于90%；50、25、12.5、6.25μmol·L-1ZnSO4處理組，細(xì)胞活力均呈升高趨勢(shì)，但是，4個(gè)處理間無顯著性差異。使用GraphPadprism8.0計(jì)算可得ZnSO4對(duì)Marc-145細(xì)胞的IC50是173.5μmol·L-1。結(jié)果表明，可選用低于100μmol·L-1的ZnSO4作為處理Marc-145細(xì)胞的濃度。由圖1B可見，PRRSV接種PAMs細(xì)胞48h后，與對(duì)照組相比，200和100μmol·L-1ZnSO4處理組PAMs細(xì)胞活力呈極顯著降低（Plt;0.0001），細(xì)胞存活率分別是60.75%和64.25%，低于90%；50、25、12.5、和6.25μmol·L-1ZnSO4處理組細(xì)胞活力無顯著性差異，存活率均高于90%。使用GraphPadprism8.0計(jì)算可得ZnSO4對(duì)PAMs細(xì)胞的IC50是291.4μmol·L-1。結(jié)果表明：試驗(yàn)可選用低于50μmol·L-1的ZnSO4作為處理PAMs細(xì)胞的濃度。

2.2 ZnSO4和ZnCl2可降低PRRSV的滴度

利用CCID50檢測ZnSO4（圖2A）和ZnCl2（圖2B）對(duì)PRRSV滴度的影響，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，100、50、12.5μmol·L-1ZnSO4和ZnCl2均可顯著和極顯著性降低PRRSV的滴度（Plt;0.05，Plt;0.01，Plt;0.001，Plt;0.0001），且呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。表明：ZnSO4和ZnCl2均可抑制PRRSV的復(fù)制，Zn2+是抑制PRRSV的有效成分。

2.3 ZnSO4抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞中的復(fù)制

利用qRT-PCR和WB檢測ZnSO4對(duì)Marc-145細(xì)胞中PRRSVN基因和N蛋白表達(dá)的影響（圖3A～圖3C），結(jié)果顯示：利用PRRSVN基因重組質(zhì)粒構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=1。與對(duì)照組相比，不同濃度ZnSO4處理組均可極顯著抑制PRRSVN基因的表達(dá)（Plt;0.01，Plt;0.0001）。與對(duì)照相比，100和50μmol·L-1ZnSO4能極顯著抑制PRRSVN蛋白的表達(dá)（Plt;0.01，Plt;0.0001）。結(jié)果表明：成功構(gòu)建了PRRSVN基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可用于后續(xù)PRRSVN基因絕對(duì)定量的標(biāo)曲。100、50和12.5μmol·L-1的ZnSO4均能抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞中的復(fù)制，且抑制作用呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.4 ZnSO4抑制PRRSV在PAMs上的復(fù)制

在PRRSV的靶細(xì)胞PAMs上，觀察了ZnSO4對(duì)PRRSV復(fù)制的作用。利用qRT-PCR和WB檢測ZnSO4對(duì)PAMs細(xì)胞中PRRSVN基因和N蛋白表達(dá)的影響（圖4A～圖4B）。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，50、25和12.5μmol·L-1ZnSO4處理組均可極顯著抑制PRRSVN基因的表達(dá)（Plt;0.0001）。同時(shí)，也極顯著抑制了PRRSVN蛋白的表達(dá)（Plt;0.0001）。結(jié)果表明：50、25和12.5μmol·L-1的ZnSO4均能抑制PRRSV在靶細(xì)胞PAMs中的復(fù)制，且抑制作用呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.5 ZnSO4干擾PRRSV的黏附和進(jìn)入

為了確定ZnSO4干擾PRRSV生命周期的階段，本研究探索了ZnSO4對(duì)PRRSV黏附和進(jìn)入的影響。ZnSO4預(yù)處理Marc-145細(xì)胞24h后，接種PRRSV，分別置于4℃和37℃孵育2h，利用qRTPCR檢測PRRSVN基因表達(dá)量的變化（圖5A、5B）。由圖5A和圖5B可見，與對(duì)照組相比，100和50μmol·L-1ZnSO4預(yù)處理24h，接種PRRSV，4℃和37℃孵育2h后，PRRSVN基因的表達(dá)量均呈極顯著性降低（Plt;0.0001）；12.5μmol·L-1的ZnSO4預(yù)處理組僅在37℃孵育2h后，PRRSVN基因的表達(dá)量呈極顯著性降低（Plt;0.0001）。結(jié)果表明：ZnSO4既可干擾PRRSV的黏附，也可阻止PRRSV的進(jìn)入，且干擾作用呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。同時(shí)，也證明了ZnSO4對(duì)PRRSV的感染具有預(yù)防作用。

為了排除ZnSO4和PRRSV的直接相互作用對(duì)ZnSO4干擾PRRSV黏附和進(jìn)入的影響，設(shè)置了ZnSO4和PRRSV的共孵育試驗(yàn)。兩者共孵育2h后，在Marc-145細(xì)胞中接種PRRSV，分別置于4℃和37℃，利用qRT-PCR檢測PRRSVN基因表達(dá)量的影響（圖5C、5D）。由圖5C可見，不同濃度ZnSO4和PRRSV共孵育2h后，置于4℃，PRRSVN基因的表達(dá)量無顯著變化。表明：ZnSO4和PRRSV的共孵育不干擾PRRSV的黏附。圖5D結(jié)果顯示：與對(duì)照相比，僅100μmol·L-1ZnSO4和PRRSV的共孵育處理組在37℃孵育2h后，PRRSVN基因的表達(dá)量呈極顯著性降低（Plt;0.001，Plt;0.0001）。表明：僅100μmol·L-1ZnSO4和PRRSV的共孵育可顯著抑制PRRSV的進(jìn)入。從而，排除了ZnSO4干擾PRRSV的黏附和進(jìn)入是由于ZnSO4對(duì)PRRSV的直接殺滅作用。

2.6 ZnSO4阻止PRRSV的釋放

利用qRT-PCR檢測ZnSO4對(duì)Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)基上清中PRRSVN基因表達(dá)的影響（圖6）。結(jié)果顯示：與對(duì)照相比，除8、20和60h之外，在6、10、12、16、20、36、48和72h，100μmol·L-1ZnSO4可顯著和極顯著抑制細(xì)胞培養(yǎng)基上清中PRRSVN基因的表達(dá)量。表明：ZnSO4可阻止PRRSV的釋放。ZnSO4對(duì)PRRSV的感染具有治療作用。

2.7 QR增強(qiáng)ZnSO4抗PRRSV感染的作用

利用qRT-PCR和WB檢測ZnSO4、QR以及兩者聯(lián)合處理，PRRSVN基因和N蛋白表達(dá)量變化。結(jié)果顯示：與對(duì)照相比，3.125μmol·L-1QR和0.781μmol·L-1ZnSO4單獨(dú)處理，PRRSVN基因表達(dá)量和N蛋白表達(dá)量無顯著變化。然而，與對(duì)照組相比，3.125μmol·L-1QR和0.781μmol·L-1ZnSO4聯(lián)合處理，PRRSVN基因和N蛋白的表達(dá)量呈顯著性降低（Plt;0.05）。表明：QR可增強(qiáng)ZnSO4抗PRRSV感染的作用。

3討論與結(jié)論

PRRSV是一種單股正鏈RNA病毒，具有高度變異性［13］。我國豬群中存在多種PRRSV譜系，包括譜系1、3、5和8［1］。因此，在生產(chǎn)中，接種PRRSV疫苗并不能持續(xù)有效控制PRRS的發(fā)生［3］。所以，研發(fā)抗PRRSV感染的藥物具有重要的科學(xué)實(shí)踐意義。研究表明：Zn能有效抑制RNA病毒的復(fù)制［14］。本研究發(fā)現(xiàn)：在Marc-145細(xì)胞中，ZnSO4能顯著地抑制PRRSV的滴度和病毒載量，且抑制作用呈一定的劑量依賴性效應(yīng)。這與Kubo等［15］報(bào)道ZnSO4具有抗H1N1和SARS-CoV-2病毒的作用和Khan等［8］報(bào)道Zn能有效地抑制呼吸道合胞病毒（Respiratorysyncytialvirus，RSV）的復(fù)制的結(jié)果是一致的。這意味著ZnSO4是一種潛在抗PRRSV感染的藥物。

Zn抗病毒感染的作用可能是干擾了病毒復(fù)制的不同階段。本研究發(fā)現(xiàn)：ZnSO4預(yù)處理能顯著阻斷PRRSV的黏附和進(jìn)入，且阻斷作用呈一定的劑量依賴效應(yīng)，同時(shí)，排除了ZnSO4對(duì)PRRSV的直接殺滅作用。這一結(jié)果與Rahaman等［16］證明的Zn通過抑制RSV的吸附和滲透抗RSV的結(jié)果是一致的。Liu等［17］也證實(shí)：Zn可以抑制腸道病毒D68（EnterovirusD68，EV-D68）的黏附、進(jìn)入和釋放。Zn阻斷病毒黏附和進(jìn)入的分子機(jī)制可能是由于Zn干擾了病毒糖蛋白介導(dǎo)的膜融合［16］，或者由于Zn與受體中的氨基酸發(fā)生配位結(jié)合，影響了病毒糖蛋白-受體的識(shí)別和相互作用［18］，進(jìn)而抑制了病毒的復(fù)制。除此之外，ZnSO4也能顯著抑制PRRSV在Marc145細(xì)胞和靶細(xì)胞PAMs中的復(fù)制，且抑制作用較ZnSO4對(duì)PRRSV黏附和進(jìn)入的抑制作用顯著。提示了升高細(xì)胞中Zn含量可能是一種潛在治療PRRSV感染的有效策略。這一結(jié)論與teVelthuis等［5］證明Zn可以抑制馬動(dòng)脈炎病毒（Equinearteritisvirus，EAV）和SARS-CoV病毒在細(xì)胞中的復(fù)制的結(jié)論是一致的。Zn抑制病毒的復(fù)制機(jī)制具有多面性。研究表明：Zn可誘導(dǎo)干擾素刺激基因的表達(dá)，合成干擾素，發(fā)揮抗病毒的作用［19］。Panchariya等［20］報(bào)道，Zn可以抑制SARS-CoV-2主要蛋白激酶發(fā)揮抗SARS-CoV-2的作用。teVelthuis等［5］證明Zn通過抑制EAV和SARS-CoVRNA合成酶的活性發(fā)揮抗EAV和SARS-CoV病毒的作用。Zn也可以與SARSCoV-2的RNA依賴性RNA聚合酶和類3C蛋白酶相互作用抑制SARS-CoV-2的復(fù)制［21］。說明Zn可以干擾病毒的黏附和進(jìn)入、阻礙病毒蛋白的加工和阻斷病毒RNA依賴性RNA聚合酶的活性等多種途徑，有效阻斷病毒的感染。

在生產(chǎn)中，日糧中常添加一定量的Zn促進(jìn)豬的生產(chǎn)性能［22］。但是，只有10%～20%的攝入Zn可被吸收。研究表明：在25～60kg的育肥豬日糧中添加50、75和100mg·kg-1ZnSO4，其血液中Zn的濃度分別為2.9、6.6和7.4μmol·L-1，其中，75和100mg·kg-1ZnSO4這2組間并無顯著差異（Pgt;0.05）［23］。同時(shí)，仔豬、斷奶仔豬和育肥豬日糧中分別添加50、75和100mg·kg-1ZnSO4，血清中Zn的最高濃度也僅為7.4μmol·L-1［23］。所以，即便日糧中添加一定量的Zn，由于Zn的吸收率較低，生產(chǎn)中也并不能觀察到明顯的抗PRRSV的作用。QR是一種重要的黃酮類化合物，在洋蔥、蘆筍等水果和蘋果櫻桃等水果中含量較高［24-25］。Dabbagh-Bazarbachi等［24］報(bào)道：QR可作為Zn2+載體，促進(jìn)Zn的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，增加Zn在細(xì)胞內(nèi)的生物利用率。本研究發(fā)現(xiàn)：用0.781μmol·L-1ZnSO4處理Marc-145細(xì)胞，無顯著抑制PRRSV復(fù)制的能力。然而，添加3.125μmol·L-1QR之后，則能顯著抑制PRRSV的復(fù)制。意味著QR可以顯著增強(qiáng)ZnSO4抑制PRRSV復(fù)制的能力。Panchariya等［20］報(bào)道：QR可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Zn含量的升高，增強(qiáng)Zn抗SARS-CoV-2的作用，且是Zn單獨(dú)抗SARSCoV-2的2倍，這與本研究的結(jié)論是一致的。同時(shí)，teVelthuis等［5］利用Zn2+載體吡啶硫酮（Pyrithi?one，PT）增加細(xì)胞內(nèi)Zn濃度，可有效抑制EVA和SARS-CoV病毒的復(fù)制。Liu等［17］利用Zn2+載體二硫代氨基甲酸吡咯烷（Pyrrolidinedithiocarba?mate，PDTC）促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Zn濃度升高，降低EVD68的載量。說明：利用Zn和QR聯(lián)合使用，通過QR增加細(xì)胞內(nèi)Zn的含量，可能是抗PRRSV病毒治療的潛在有效策略。

綜上所述，ZnSO4通過抑制PRRSV的黏附、進(jìn)入和復(fù)制發(fā)揮抗PRRSV感染的作用，且Zn離子載體QR能促進(jìn)細(xì)胞Zn的吸收，增強(qiáng)Zn抑制PRRSV的作用。為進(jìn)一步明確ZnSO4抗PRRSV感染的分子機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)；為進(jìn)一步將ZnSO4作為潛在預(yù)防和治療PRRSV感染的有效策略提供理論支持；同時(shí)，也為進(jìn)一步探索Zn2+載體QR聯(lián)合Zn抗PRRSV感染的作用和分子機(jī)制提供了依據(jù)。