關(guān)鍵詞：芒果；60Co-γ 射線輻射；EMS 誘變；SC-SSR 分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S667.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

芒果果實(shí)成熟時(shí)，風(fēng)味濃郁、果肉色澤金黃且多汁，素有“熱帶水果之王”之美譽(yù)。我國(guó)芒果種植面積位居世界第二位[1]，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞辦統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2021年全國(guó)芒果種植面積約37.46 萬(wàn)hm²，產(chǎn)量395.80 萬(wàn)t[2]。芒果起源于印度和東南亞，目前我國(guó)芒果栽培品種如凱特、圣心、澳芒、帕拉英達(dá)、金白花主要來(lái)源于美國(guó)、澳大利亞、緬甸、泰國(guó)等國(guó)家。自20世紀(jì)60年代起，國(guó)內(nèi)芒果育種專家主要通過(guò)實(shí)生和雜交育種的方式來(lái)選種，已篩選出桂香芒、紅象牙、臺(tái)農(nóng)1號(hào)、金煌、貴妃、粵西1號(hào)、熱農(nóng)2號(hào)、攀西紅芒、攀育2號(hào)、景東晚芒、云熱-5007等新品種[3-5]。由于通過(guò)傳統(tǒng)的人工雜交授粉方法工作量大，且結(jié)實(shí)率低，目前芒果新品種的選育仍是通過(guò)農(nóng)家品種篩選和實(shí)生選種。自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良品種缺乏是影響我國(guó)芒果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要問(wèn)題之一，想要選育出能適應(yīng)多個(gè)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)大面積推廣種植的新品種還需較長(zhǎng)時(shí)間。

誘變作為一種創(chuàng)造新種質(zhì)、選育新品種的實(shí)用性技術(shù)，具有變異類型豐富、變異率高、育種周期短等優(yōu)勢(shì)[6]，被廣泛應(yīng)用于果樹(shù)育種改良，常見(jiàn)誘變技術(shù)包括γ 射線、中子、離子束、航天、EMS、NaN3誘變，目前成功選育出柑橘、蘋(píng)果、梨、葡萄、山楂等新品種（系）[7-9]。國(guó)外1960年首次報(bào)道了芒果誘變育種研究，并且開(kāi)展了相關(guān)誘變劑量篩選研究[10]。RIME 等[11]分析ArkaPuneet 芒果的EMS 誘變?nèi)后w，篩選出濃度0.8%EMS 誘變芒果矮化效果最好，育成矮化突變體新材料R8P12。SAúCO等[12]首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了Gomera-1 芒果芽變四倍體。國(guó)內(nèi)廣西亞熱帶作物研究所用⁶⁰Co-γ 射線輻射芒果種子、枝條，均未獲得優(yōu)良變異材料[3]。黃鏡浩等[13]用秋水仙堿處理芒果莖尖，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞加倍效果不明顯。近年，本課題組分別用濃度0.2% EMS 和秋水仙堿處理凱特芒果胎萌種子，篩選出抗畸形病單株和同源四倍體單株。分子標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)便、效率高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，已成為植物基因組DNA 研究的重要手段，其中SSR、AFLP、ISSR、SRAP、SCoT、SNP 等分子標(biāo)記，已被廣泛應(yīng)用于芒果遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建、遺傳圖譜構(gòu)建、雜交子代鑒定等研究[14-19]。采用分子標(biāo)記對(duì)誘變材料進(jìn)行評(píng)價(jià)，有利于篩選出適合某種植物的最佳誘變育種方法和技術(shù)，進(jìn)一步提高誘變效率。SC-SSR[20]是近年基于SCoT 和ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)開(kāi)發(fā)的起始密碼子-微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記，能將標(biāo)記位點(diǎn)與表達(dá)序列緊密聯(lián)系，同時(shí)具有較高擴(kuò)增多態(tài)性，已被應(yīng)用于獼猴桃[21]種質(zhì)資源遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建。芒果SC-SSR分子標(biāo)記反應(yīng)體系已建立優(yōu)化[22]。本研究以凱特芒果為材料，通過(guò)⁶⁰Co-γ 射線輻射和EMS 溶液浸泡創(chuàng)制誘變?nèi)后w材料，再用SC-SSR 分子標(biāo)記分析誘變?nèi)后w遺傳變異，為芒果誘變育種實(shí)踐提供理論依據(jù)，便于加快創(chuàng)制芒果突變體育種新材料。

1 材料與方法

1.1 材料

選用凱特芒果枝條和種子為試材，供試凱特芒果種植于四川省攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院芒果科技示范園。

1.2 方法

1.2.1 ⁶⁰Co-γ 射線輻射誘變 2021 年4 月，選取直徑為1.5～2.0cm 的2年生芒果枝條10 個(gè)，在中部密集芽上1.0 cm 處短截，分別在0、3、6、9、12、15 d 調(diào)查剪口飽滿芽、裂紋芽數(shù)量，確定輻射枝條短截預(yù)處理時(shí)間。同年5 月，剪取長(zhǎng)9 cm的短截預(yù)處理輻射接穗，送至云南華源核輻射技術(shù)有限公司進(jìn)行60 Co-γ 射線輻射誘變，輻射劑量設(shè)0、10、20、30、40、50、60Gy 共7 個(gè)處理，劑量率為1 Gy/min。每處理接穗40 個(gè)，重復(fù)3次。輻射處理后，所有接穗均嫁接于3 年生緬甸8 號(hào)苗砧木，60 d 后調(diào)查成活率。相對(duì)成活率=（輻射接穗成活率/對(duì)照接穗成活率）×100%。根據(jù)接穗的不同輻射劑量對(duì)應(yīng)的相對(duì)成活率，擬合直線回歸方程y=bx+a，確定y=50%的x 值即為半致死劑量（LD），再以半致死劑量輻射處理接穗，培育一批誘變苗。

1.2.2 EMS 溶液浸泡誘變 2021年9月，用0.067 mol/L 的磷酸緩沖液（pH 7.0）配成濃度為0.2% EMS 溶液（含1%二甲基亞砜），浸泡果實(shí)生育期120 d 的種子，浸泡時(shí)間設(shè)0、2、4、6、8 h共5 個(gè)處理，每處理種子數(shù)50個(gè)，重復(fù)3 次。每浸泡1 h 輕攪動(dòng)種子1 min，浸泡后用清水浸泡清洗2～3 次，每次5 min，最后按照株行距20 cm×30 cm 在砂床進(jìn)行播種育苗。播種10 d 后調(diào)查萌發(fā)率，30 d 后調(diào)查成苗率和株高，擬合處理時(shí)間與相對(duì)成苗率直線回歸方程，計(jì)算EMS 溶液浸泡芒果種子半致死時(shí)間，再以半致死時(shí)間浸泡種子，培育一批誘變苗。

1.2.3 SC-SSR 分子標(biāo)記檢測(cè) 2022年9月，取0.1 g凱特芒果及其誘變材料[60Co-γ 射線輻射60株（F1～F60），EMS 溶液浸泡40 株（E1～E40）]的嫩葉，CTAB 法提取DNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)DNA純度和濃度，樣品檢測(cè)合格后用于PCR 擴(kuò)增，并放置于–20 ℃冰箱中保存。選SCoT、ISSR 引物各10 個(gè)（表1），用2 種引物組合對(duì)研究材料進(jìn)行多態(tài)性引物篩選。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：10 μLTaq PCR Mix，2 μL 引物（1 μmol/L），50 ng DNA模板。PCR 擴(kuò)增程序參考張安世等[21]的方法，僅將循環(huán)數(shù)改為32 個(gè)。PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖膠電泳分離，再用凝膠成像系統(tǒng)拍照，其中樣品擴(kuò)增條帶統(tǒng)計(jì)按照有條帶記為“1”，無(wú)條帶記為“0”。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SAS 9.3 軟件進(jìn)行方差分析，使用單因素方差分析和Duncan’s 法比較處理間的差異顯著性。整理形成標(biāo)記擴(kuò)增電泳條帶（0 ，1） 矩陣數(shù)據(jù)， 用POPGENE 32 軟件計(jì)算多態(tài)性比率（PPB）、觀測(cè)等位基因（N）、有效等位基因（N）、Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)（H）、Shannon 多樣性指數(shù)（H?）、多態(tài)性信息含量（PIC），計(jì)算參照Botstein 公式[23]。利用NTSYSpc 2.1軟件計(jì)算試驗(yàn)材料的遺傳相似系數(shù)，使用非加權(quán)組平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，以遺傳相似系數(shù)進(jìn)行主成分分析（PCA），遺傳距離=1-遺傳相似系數(shù)。使用MEGA 7.0 軟件繪制環(huán)形遺傳聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ 射線輻射對(duì)枝條成活率的影響

2.1.1 短截芒果枝條密集芽的動(dòng)態(tài)變化 由圖1可知，健壯芒果枝條經(jīng)中部短截處理促進(jìn)截口密集芽萌動(dòng)，隨處理時(shí)間增加，飽滿芽、裂紋芽數(shù)量逐漸增多，飽滿芽率高于裂紋芽率。處理時(shí)間與飽滿芽率、裂紋芽率的直線擬合方程分別為y=3.712x+29.853 （ R2=0.9595 ）、y=4.8593x–6.96（R²=0.9484）。根據(jù)擬合方程計(jì)算出輻射枝條短截預(yù)處理時(shí)間為8 d，確保采集的接穗有六成飽滿芽（59.55%）和少于四成裂紋芽（31.91%）。

2.1.2 短截芒果枝條輻射半致死劑量 由表2 可知，與對(duì)照（0 Gy）相比，接穗經(jīng)⁶⁰Co-γ 射線輻射后嫁接成活率和相對(duì)成活率均顯著降低，隨輻射劑量增加成活率和相對(duì)成活率降低幅度逐步增加。輻射劑量為60Gy 時(shí)，成活率和相對(duì)成活率分別比對(duì)照降低了67.50%和88.04%。輻射劑量與相對(duì)成活率擬合直線方程y=–1.2545x+89.356（R²=0.9312）（圖2），相關(guān)系數(shù)達(dá)極顯著水平，根據(jù)方程計(jì)算短截芒果枝條的半致死劑量（LD）為31.37 Gy。

2.2 EMS 浸泡處理對(duì)種子萌發(fā)和成苗的影響

種子在濃度為0.2% EMS 溶液中經(jīng)不同浸泡時(shí)間處理后，萌發(fā)率、成苗率、相對(duì)成苗率和株高均顯著低于對(duì)照（0 h），浸泡時(shí)間越長(zhǎng)其降低幅度越大（表3）。浸泡2、4 h 的萌發(fā)率、成苗率和相對(duì)成苗率差異不顯著，但株高降低顯著。浸泡8 h 后的萌發(fā)率、成苗率、相對(duì)成苗率和株高最低，分別是20.67%、17.33%、40.62%和10.20 cm，分別比對(duì)照降低了60.66%、25.34% 、59.38% 和11.77 cm。不同浸泡時(shí)間的成苗率均明顯低于萌發(fā)率，隨浸泡時(shí)間的增加，萌發(fā)率降低減少，降低幅度為3.34%～38.66%。浸泡時(shí)間與相對(duì)成苗率擬合直線方程y=–6.794x+90.604（R²=0.8739）（圖3），相關(guān)系數(shù)達(dá)極顯著水平，根據(jù)方程計(jì)算芒果種子的半致死時(shí)間（LD）為5.9 h。

2.3 誘變材料SC-SSR 分子標(biāo)記分析

2.3.1 引物篩選 選取6 份材料（凱特、F7、F8、F50、E2、E8）DNA 模板用于引物篩選，從100對(duì)引物y2YRsMhBlsGLcBGupWNUgg==中篩選出多態(tài)性引物16 對(duì)（表4），用于試驗(yàn)材料NAD 模板PCR 擴(kuò)增分析。

2.3.2 多態(tài)性分析 基于篩選出的16 對(duì)SC-SSR 引物，對(duì)101份試驗(yàn)材料進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，擴(kuò)增條帶大小主要集中在250～1000 bp 之間，共擴(kuò)增出126 條帶（圖4），其中多態(tài)性條帶117 條，平均多態(tài)性條帶為7.3 條，平均多態(tài)性條帶比率為93.18%。結(jié)果表明，SC-SSR 引物擴(kuò)增多態(tài)性好。

2.3.3 遺傳多樣性分析 由表4 可知，16 對(duì)引物擴(kuò)增條帶分析顯示觀測(cè)等位基因數(shù)范圍為1.750～2.00，平均值為1.923；有效等位基因數(shù)范圍為1.114～1.796，平均值為1.583；Nei’s 基因多樣性指數(shù)范圍為0.093～0.430 ， 平均值為0.334 ；Shannon’s 信息指數(shù)范圍為0.178～0.619，平均值為0.493；多態(tài)性信息含量介于0.129～0.825，平均值為0.610。說(shuō)明芒果誘變?cè)囼?yàn)材料遺傳多樣性豐富，SC-SSR 分子標(biāo)記適用于芒果遺傳多樣性分析。

2.3.4 遺傳相似系數(shù)分析 基于SC-SSR 分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，用NTSYSpc 2.1 軟件計(jì)算獲得的101 份試驗(yàn)材料兩兩間遺傳相似系數(shù)在0.373～0.984 之間，平均為0.779。將遺傳相似系數(shù)轉(zhuǎn)換為遺傳距離作頻數(shù)分布直方圖（圖5），96.69%的遺傳距離分布在0.05～0.51 之間，遺傳距離小于0.05的有25個(gè)（0.50%），遺傳距離大于0.51 有142 個(gè)（2.81%），說(shuō)明少數(shù)試驗(yàn)材料間的差異性大。100 個(gè)誘變材料與對(duì)照凱特的遺傳距離為0.040～0.556，平均為0.156，F(xiàn)3 遺傳距離最小，E2 遺傳距離最大；其中60份⁶⁰Co-γ 射線輻射誘變材料與對(duì)照的遺傳距離為0.040～0.254，平均為0.103；其中40份EMS浸泡誘變材料與對(duì)照的遺傳距離在0.095～0.556之間，平均為0.259。結(jié)果表明，種子EMS 浸泡比枝條60Co-γ 射線輻射的變異大。

2.3.5 聚類分析 選遺傳距離數(shù)據(jù)，用UPGMA方法對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行聚類分析，101 份試驗(yàn)材料被分為三大類群（圖6）。Ⅰ類群共11 份試驗(yàn)材料，占總數(shù)的10.89%，Ⅰ-1 亞群包括E13、E21、E22、E23、E27、E28、E31、E33、E35，Ⅰ-2 亞群包括E3和E4；Ⅱ類群共3 份試驗(yàn)材料，占總數(shù)的2.97%，Ⅱ-1 亞群僅有E37，Ⅱ-2 亞群包括E2 和E7；Ⅲ 類群共87 份試驗(yàn)材料，占總數(shù)的86.14%，Ⅲ-1 亞群包括E18 和E36，Ⅲ-2 亞群僅有E20，Ⅲ-3 亞群包括23 份EMS誘變、60份⁶⁰Co-γ射線輻射誘變和凱特。結(jié)果表明，不同種子EMS誘變?cè)囼?yàn)材料多數(shù)聚類在一起， 部分與枝條⁶⁰Co-γ 射線輻射誘變和凱特試驗(yàn)材料聚類在一起，表明誘變處理方法基因組DNA 水平變異的差異明顯。

2.3.6 主成分分析 基于SC-SSR 標(biāo)記獲得的試驗(yàn)材料遺傳相似系數(shù)，用NTSYSpc 2.1 軟件進(jìn)行主成分分析，其中前3 個(gè)主成分解釋率分別為26.12%、6.75%和5.12%，以第一主成分和第二主成分作二維主成分分析圖（圖7）。101 份試驗(yàn)材料被劃分為3 個(gè)類群（A、B 和C 類群），A 類群12 份，B 類群2 份，C 類群87 份。主成分分析與聚類分析結(jié)果相比較，A 類群與Ⅰ類群僅有E3、E18 和E37 劃分聚類不一致，B 類群與Ⅱ類群僅有E37 劃分聚類不一致，C 類群與Ⅲ類群僅有E13和E18 劃分聚類不一致。

3 討論

因我國(guó)保存的芒果種質(zhì)資源主要是從美國(guó)和東南亞國(guó)家引進(jìn)，遺傳信息狹窄，綜合性狀優(yōu)良種質(zhì)資源數(shù)量少，人工雜交結(jié)實(shí)率低，培育突破性芒果新品種難度較大。研究認(rèn)為60Co-γ、EMS等誘變是創(chuàng)制水稻、油菜、西瓜、柑橘、菊花等植物育種新材料的重要手段，通過(guò)誘變能快速構(gòu)建植物突變體基因庫(kù)，獲得更多有益的新種質(zhì)材料，可用于功能基因組學(xué)研究和品種選育[24-26]。在誘變過(guò)程中增加輻射劑量、EMS濃度或處理時(shí)間能提高誘變效率，同時(shí)也相應(yīng)提高誘變材料的致死率[27]，目前常以半致死率來(lái)確定植物誘變適宜的輻射劑量和EMS 濃度、處理時(shí)間。本研究發(fā)現(xiàn)， 輻射劑量增加嫁接成活率降低，EMS 處理時(shí)間增加萌發(fā)率和成苗率降低，與澳洲堅(jiān)果[28]、白樺[29]、高粱[30]等研究結(jié)果相似。通過(guò)模擬直線方程計(jì)算出的枝條60Co-γ 射線輻射半致死劑量和種子0.2% EMS 溶液浸泡半致死處理時(shí)間，可為芒果相關(guān)誘變育種提供參考借鑒。

本研究對(duì)芒果誘變?cè)囼?yàn)材料進(jìn)行SC-SSR 分子標(biāo)記分析， 16 對(duì)引物擴(kuò)增條帶的PPB 為93.18%。高于羅聰?shù)萚16]應(yīng)用SCoT 標(biāo)記分析的73份芒果資源（PPB 為73.63%）和余賢美等[31]利用ISSR 標(biāo)記分析的芒果野生居群（PPB 為87.25%）。PIC 值能反應(yīng)基因變異程度高低，研究材料群體的PIC 值越大，該基因座雜合子比例就越大，提供的遺傳信息越高[32]。本研究所選的SC-SSR 標(biāo)記獲得的PIC 為0.610，高于SSR、CDDP、SRAP標(biāo)記在芒果上的應(yīng)用[33-35]，參考BOTSEIN 等[36]提出的PIC 指標(biāo)判別方法，獲得14 個(gè)SC-SSR 基因座為高度多態(tài)位點(diǎn)（PIC>0.50），能較好地提供遺傳信息。綜合認(rèn)為，SC-SSR 標(biāo)記擴(kuò)展檢測(cè)多態(tài)位點(diǎn)效率高，在芒果遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建、變異材料鑒定等方面研究應(yīng)用前景廣。

芒果為高度雜合的多年生果樹(shù)，種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富。報(bào)道基于SSR 熒光標(biāo)記分析國(guó)內(nèi)145 份芒果品種及其近緣野生種的遺傳相似系數(shù)在0.50～0.78 之間[15]，SSR 標(biāo)記分析國(guó)內(nèi)116 份芒果實(shí)生資源的遺傳相似系數(shù)在0.60～1.00 之間[33]，SRAP 標(biāo)記分析芒果品種貴妃、金煌及其98 株雜交F1 代群體的相似系數(shù)在0.52～0.92 之間[18]，相比較發(fā)現(xiàn)，本研究選用SC-SSR 標(biāo)記分析凱特及其100 份誘變?cè)囼?yàn)材料的遺傳相似系數(shù)在0.37～0.98 之間，遺傳多樣性更豐富，認(rèn)為在可利用種質(zhì)資源有限的情況下誘變優(yōu)于實(shí)生、雜交對(duì)芒果遺傳變異的影響。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，芒果種子EMS 浸泡比枝條60Co-γ 射線輻射誘變變異大，與常媚瑕等[27]研究不同誘變方法對(duì)朝天椒種子誘變效應(yīng)和鄧仁菊等[37]誘變篩選火龍果抗寒突變體結(jié)果一致，原因可能是受2 種誘變機(jī)理差異影響所致，EMS 誘變多是堿基點(diǎn)突變，輻射誘變多是大片缺失或者顛換。已有研究表明不同萌發(fā)狀態(tài)的草莓種子對(duì)EMS 的敏感程度不同[38]，推測(cè)不同生育期芒果種子對(duì)EMS 的敏感程度同樣會(huì)存在差異，還需開(kāi)展相關(guān)研究提高芒果種子EMS 誘變效率。

聚類分析和主成分分析結(jié)果基本一致，101份試驗(yàn)材料被劃分為三大類群，Ⅰ、Ⅱ類群全部為EMS 浸泡誘變?cè)囼?yàn)材料，Ⅲ類群為凱特、部分EMS 浸泡和全部60Co-γ 射線輻射誘變?cè)囼?yàn)材料。多數(shù)EMS 誘變?cè)囼?yàn)材料聚集在一起，離凱特較遠(yuǎn)，而多數(shù)60Co-γ 射線輻射誘變聚集在一起，離凱特較近。可見(jiàn)不同誘變方法在同種植物上誘變差異明顯，同時(shí)也可能在基因組同位點(diǎn)產(chǎn)生相近變異，需進(jìn)一步研究探討其他誘變方法在芒果上的應(yīng)用，優(yōu)化芒果高效誘變育種技術(shù)，加快芒果突變體基因庫(kù)構(gòu)建。

4 結(jié)論

⁶⁰Co-γ 射線輻射短截預(yù)處理8d，凱特芒果枝條的半致死劑量為31.37 Gy。0.2%EMS 溶液浸泡處理果實(shí)生育期120d，凱特芒果種子的半致死時(shí)間為5.9 h。EMS 浸泡種子比⁶⁰Co-γ 射線輻射枝條更易獲得豐富的遺傳變異。